Summary
La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che deriva dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema nervoso centrale, causando difetti di locomozione. Modelli rotenone malattia di Parkinson in Drosophila. Questo documento delinea due saggi che caratterizzano le carenze locomozione sia spontanee e spaventare-indotte causate da rotenone.
Abstract
La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa che deriva dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici nel sistema nervoso centrale, soprattutto nella substantia nigra. La malattia provoca deficit motori, che presentano come rigidità, tremori e demenza negli esseri umani. Rotenone è un insetticida che provoca il danno ossidativo inibendo la funzione della catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. Viene anche usato per modellare la malattia di Parkinson in Drosophila. Le mosche hanno una intrinseca geotactic risposta negativa, che obbliga loro di salire verso l'alto dopo essere stato sorpreso. È stato stabilito che rotenone causa di mortalità e di locomozione difetti iniziali che inficiano la capacità delle mosche 'a salire dopo che sono stati sfruttati verso il basso. Tuttavia, l'effetto di rotenone sul movimento spontaneo non è ben documentata. Questo studio delinea due test di throughput sensibili, riproducibili, e alti per caratterizzare carenze rotenone-indottalocomozione e locomozione spontanea-lungo termine a breve termine startle-indotta in Drosophila. Questi test possono essere adattati facilmente per caratterizzare altri modelli di Drosophila di difetti di locomozione e l'efficacia degli agenti terapeutici.
Introduction
Carenze Locomotion sono un sintomo principale della malattia di Parkinson e sono in gran parte causati dal deterioramento dei neuroni dopaminergici della substantia nigra 1. Rotenone è un insetticida chetonici che è stata ampiamente studiata per modellare deficit motori del Parkinson in Drosophila 2-6. Rotenone provoca danno ossidativo bloccando la via della fosforilazione ossidativa, che provoca in ultima analisi, la morte cellulare 7. Neuroni dopaminergici sono più inclini alla tossicità rotenone, rendendo gli effetti della chimica basata principalmente motore 2,7. Per indurre i sintomi della malattia di Parkinson in mosche, possiamo capire meglio la malattia e porre rimedio suoi sintomi 6,8-11. Drosophila offre un buon modello per lo studio di questo effetto, perché sono geneticamente trattabili, di facile manutenzione, e hanno un ciclo di vita veloce.
Diversi studi hanno dimostrato che il rotenone provoca a breve termine startle-indottadifetti di locomozione in mosche Drosophila -quando sono mantenuti sul cibo rotenone-integrato, mostrano una risposta più lenta geotactic negativa dopo startle 2-6. La loro incapacità di salire verso l'alto in un apparato fiala più rapidamente le prove di controllo è indice di difetti di locomozione startle-indotta.
L'effetto di rotenone on-lungo termine, movimento spontaneo non è ben descritto. Monitor di attività Drosophila (dighe) sono stati utilizzati con successo per monitorare il movimento in Drosophila ritmo circadiano studia 12,13. Le mosche sono posti in tubi singoli, che vengono caricati nel DAM. Questo apparecchio è dotato di un sensore a infrarossi, che conta il numero di volte che una mosca interrompe il raggio infrarosso. Questi conteggi possono essere usati come misura di locomozione e dell'attività 12,13 indisturbati. Inserendo mosche in una diga, l'effetto di rotenone sul loro locomozione a lungo termine può essere caratterizzato. Questo studio descrive metodi per measlocomozione e locomozione spontanea a lungo termine URE breve termine startle-indotta al fine di comprendere meglio gli effetti del rotenone mediata deficit motori. Caratterizzazione delle carenze di locomozione che mimano la malattia di Parkinson sono importanti perché consentono per lo studio di altri composti che possono invertire questi difetti di locomozione.
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Protocol
1 Drosophila Startle indotta Assay Locomotion
- Trattamento di droga
- Sedare immobilizzare il numero desiderato (circa 8-12) di 1-3 giorno-vecchio maschio vola con CO 2 e trasportarli a fiale contenenti il cibo-farmaco integrato. Nota: Un altro anestetico ad esempio, etere o ghiaccio possono essere usati per sedare le mosche per consentire il conteggio e la manipolazione.
- Consenti mosche per recuperare da sedazione per 20 minuti (o fino al recupero) con la fiala in posizione orizzontale (per evitare di rimanere bloccati mosche sul cibo) e quindi posizionare il flacone in posizione verticale in un buio 12 ore, 12 ore di luce incubatore a 25 ° C per il resto dell'esperimento.
- Sperimentale Set Up
- Dividere questa doppia configurazione fiala in tre sezioni uguali di 6,33 centimetri contrassegnando cerchi intorno le fiale con un pennarello indelebile.
- Dopo 3 giorni di esposizione al farmaco, trasferimento vola senza anestetizzante nel flaconcino inferiore e posizionare rapidamente il flaconcino all'iniziosopra l'apertura. Tape le due fiale con nastro adesivo trasparente.
- Consenti mosche per acclimatarsi al nuovo ambiente per 15 min.
- Luogo fiale su uno sfondo bianco e impostare una fotocamera digitale ad una distanza appropriata dal doppio apparato flaconcino con un timer in vista. Assicurarsi che l'intero apparato è visibile in una sola cornice e che tutte le mosche sono a fuoco. Per mantenere cornici coerenti tra prove, segnare la posizione della telecamera e il flacone.
- Mobilità Assay
- Chiaramente visualizzare il numero di prova, trattamento farmacologico, e timer in vista della telecamera.
- Saldamente toccare il doppio apparato fiala contro il piano di lavoro 3 volte e garantire che tutte le mosche cadono sul fondo della fiala. Contemporaneamente avviare il timer.
- Ogni 5 secondi per 1 minuto, scattare una foto dell'apparato. Nota: In alternativa, un video può essere catturato e messo in pausa ad intervalli appropriati per le misurazioni.
- Consenti mosche di recuperare indisturbati per 1 min.
- Analisi dei dati
- Rivedere le immagini e registrare il numero di mosche in ogni sezione nel corso del tempo. Calcolare la percentuale di mosche in ogni sezione nel tempo. Note: Ripetere l'intera procedura con le stesse mosche a 2 o 3 punti di tempo di interesse, per esempio, il giorno 3, 5, e 7 se troppe mosche muoiono durante l'esperimento, è possibile scalare il numero di prova iniziale per compensare per la mortalità. Utilizzare l'analisi statistica opportuno confrontare i dati.
2 Drosophila spontanea Locomotion Assay
- Preparazione del cibo
- Ricostituire 3 g di media istantanea Drosophila con 15 ml di acqua deionizzata e rotenone desiderato(O un altro farmaco di interesse) dosaggio.
- Una volta che il composto cibo è diventato impresa (circa 5 min), caricare con cura il cibo per essere circa 1 cm in alto produttore forniti tubi trasparenti (5 mm x 65 mm). Aggiungere il farmaco infuso cibo ai tubi ponendo attenzione le provette verticalmente nel cibo e torsione fino a che non possono essere rimossi con il cibo all'interno del tubo. Nota: È utile posizionare un dito sull'apertura del tubo per creare il vuoto. Il cibo non deve contenere bolle d'aria o avere una superficie irregolare come le mosche possono diventare bloccato.
- Setup sperimentale
- Inserire un tappo di plastica all'estremità del tubo più vicina del cibo. Spingere il tappo di plastica sul tubo il meno possibile, come si può creare una bolla d'aria nel flacone se spinto a forza.
- Sedare 1 giorno-vecchio maschio vola con CO 2 e inserire con cautela 1 maschio vola in ogni provetta con un pennello. Ripetere a seconda del numero di prove desiderati.
- Inserire ilestremità del tubo più lontano dal cibo con una piccola pallina di cotone, che può essere arrotolato a mano dal deposito ingrandito comprato batuffoli di cotone.
- Consenti mosche di recuperare con i tubi in posizione orizzontale per 15 minuti e assicurarsi che tutte le mosche sono vivi e attivi. Inserire i tubi in DAM e assicurarsi che tutti i tubi sono nella stessa posizione relativa alla diga. Nota: E 'possibile posizionarle con la zona di monitoraggio al centro del flacone, o di spingere tutte le fiale di lato, in modo che l'estremità del tubo viene monitorato. Nota: Si veda la discussione di variazioni su questo metodo.
- Raccolta dati
- Inserite il DAM in un buio 12 ore, 12 ore di luce incubatrice impostata a 25 ° C. Collegare il DAM al sistema di raccolta dati. Aprire il software DAM e alle preferenze selezionate lunghezza bin a 10 min. Avviare la raccolta dei dati e consentire al programma di raccolta di dati per 7 giorni. Nota: la lunghezza Bin può essere regolata, se necessario.
- Analisi dei dati
Nota: Processoi dati per ottenere conteggi per minuto come misura di locomozione spontanea a lungo termine.- Programma e monitorare l'accesso ai dati di scansione dei file DAM Aprire facendo clic su Seleziona dati di input.
- Selezionare appropriata gamma del monitor e selezionare la lunghezza bin a intervalli di 10 min.
- Nel tipo di file di output scegliere i file di canale. Lasciare tutte le altre opzioni come predefinite.
- Fare clic su dati di scansione e salvare in una cartella designata.
- Importare dati in un circadiano software di analisi dei dati per ottenere conteggi per minuto. Nota: Per il software di analisi dei dati Clocklab è comunemente usato. Altre opzioni sono disponibili anche.
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Representative Results
Drosophila Startle indotta Assay Locomotion
Di tipo selvatico, Canton-S, mosche mostrato una robusta risposta geotactic negativa con solo circa il 88% e il 5% di mosche nelle sezioni superiore e inferiore, rispettivamente, dell'apparato doppio flaconcino dopo 30 sec (Figura 1). Le mosche esposte a 125 mM e 250 mM rotenone per 3 giorni hanno mostrato una lieve diminuzione del numero di mosche nella sezione superiore e leggero aumento del numero di mosche nella sezione inferiore. Le mosche esposte a 500 mM rotenone hanno mostrato difetti significativi nella risposta geotactic negativa (p <0.05 ANOVA, Bonferroni paio saggio di confronto), come evidenziato da un minor numero di mosche nella sezione superiore e più mosche nella sezione in basso rispetto al controllo in linea (Figura 1). Questo difetto in risposta geotactic negativa a causa dell'impossibilità di salire rapidamente nell'apparato è indicativo di un difetto di startle-indotto locomozione.
Drosophila spontanea Locomotion Assay
Di tipo selvatico, Canton-S, mosche mostrato 0,57 impulsi al minuto come misura di mobilità spontanea il quarto giorno del DAM (Figura 2). Le mosche esposti a 125 micron rotenone hanno mostrato un livello simile di locomozione spontanea. Al contrario, mosche esposto a 250 micron e 500 micron rotenone ha mostrato misure inferiori di circa il 50% (p <0.05 ANOVA, Bonferroni paio saggio di confronto) di locomozione spontanea (Figura 2). Queste mosche spostati a circa 0.20 conteggi per minuto, che è indicativo di un difetto rotenone-indotta in locomozione spontanea.
Per spiegare le discrepanze iniziali (se presenti) in locomozione non causate da esposizione rotenone, abbiamo sottratto i dati di locomozione tra il giorno 4 e il giorno 3. mosche di controllo ha mostrato un aumento di circa 0,1 conteggi al minuto in spontaneonoi locomozione tra i giorni, mentre le mosche esposti a 125 micron rotenone mostrato una leggera diminuzione di circa 0,15 conteggi per minuto (Figura 3). Le mosche esposte a 250 mM e 500 mM rotenone visualizzate diminuzioni più gravi in locomozione tra i giorni, con differenze essendo circa 0,3 e 0,5 (p <0.05 ANOVA, coppia Bonferroni saggio di confronto) conta per minuto rispettivamente. Questi dati suggeriscono un deficit di locomozione spontanea nel corso del tempo con l'esposizione di rotenone e conferma l'analisi solo giorno di cui sopra - le mosche esposti a dosaggi più alti di rotenone ha mostrato una diminuzione della locomozione spontanea. Presi insieme, questi metodi misurano in modo affidabile carenze rotenone-indotta in startle spontaneo e indotto locomozione.
Figura 1 Startle indotta locomozione terreno dimosche esposti a dosi crescenti di rotenone. tipo selvatico, Canton-S, le mosche di sesso maschile sono stati esposti a diversi dosaggi di rotenone per 3 giorni e mosche superstiti (8-12) sono stati poi sfruttato nella parte inferiore del doppio apparato fiala. Le mosche esposte a 500 mM rotenone mostrano una significativa diminuzione della percentuale di mosche in alto (A) e aumentare della percentuale di mosche nella sezione inferiore (B) dell'apparecchiatura dopo 30 sec. Questo è indicativo di una carenza di risposte di allarme in mosche esposti al rotenone. Le colonne rappresentano la percentuale media di 6 esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media; * P <0,05 ANOVA, coppia Bonferroni saggio di confronto.
Figura 2 locomozione spontanea appezzamento di mosche esposto ad aumentare della doses di rotenone. tipo selvatica, Canton-S, le mosche di sesso maschile sono stati esposti a diversi dosaggi di rotenone e conteggi per minuto il quarto giorno dopo l'esposizione sono stati tracciati. Conti sono stati misurati in una diga. Le mosche esposti a 250 micron e 500 micron rotenone mostrano una riduzione della conta al min. Questo è indicativo di una carenza di locomozione spontanea in mosche esposti al rotenone. Le colonne rappresentano le conte medie per minuto sul quarto giorno di 5 prove indipendenti. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media; * P <0,05 ANOVA, coppia Bonferroni saggio di confronto.
Figura 3 Variazione spontanea locomozione appezzamento di mosche esposte a crescenti dosi di rotenone. Tipo selvatica, Canton-S, le mosche di sesso maschile sono stati esposti a diversi dosaggi di rotenone e la differenza di conteggi per minuto on il terzo e quarto giorno dopo l'esposizione sono stati tracciati. Conti sono stati misurati in una diga. Vi è una tendenza dose-dipendente per il declino in locomozione spontanea con le mosche esposti a dosi più elevate hanno una variazione più negativa nella locomozione. Questo è indicativo di una diminuzione nel movimento. Le colonne rappresentano la variazione media nella locomozione per minuto su 5 prove indipendenti. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media; * P <0,05 ANOVA, coppia Bonferroni saggio di confronto.
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Discussion
In questo studio, descriviamo due procedure di misurazione sia locomozione spontanea a lungo termine e di locomozione startle indotta a breve termine in un rotenone indotta Drosophila modello della malattia di Parkinson. Si può anche misurare queste caratteristiche locomozione in mosche esposti ad altri agenti farmacologici noti per modello di malattia di Parkinson, per esempio paraquat 14, modelli genetici della malattia di Parkinson ad esempio, alfa-sinucleina mutanti 15, e altri modelli Fly di malattie che colpiscono locomozione. Per entrambi i metodi, possono essere considerati metodi alternativi e modifiche. Le mosche possono essere anestetizzati con ghiaccio, che potrebbe alleviare le limitazioni di CO 2 anesthetization ad esempio ritardo nella raccolta dei dati per consentire di CO 2 effetto svanire.
Nel saggio di locomozione trasalimento indotta, poiché mosche mostrano variazione circadiana in mobilità, è importante raccogliere dati nello stesso momento dellagiorno tra esperimenti. È altresì importante introdurre mosche nel all'apparecchio di prova senza anestesia. Contrariamente alla maggior parte dei saggi di locomozione risposte di allarme, che si basano su uno snapshot di passare una soglia in un lasso di tempo predeterminato 10,11,15,16, il nostro approccio, simile a rapidi geotassi negativi iterativi (anello) test 17,18, controlla il movimento in successive istanze multiple per un periodo di tempo. Questo approccio di monitoraggio continuo della distribuzione di mosche in zone diverse può risolvere le sottili differenze tra i gruppi di trattamento. Inoltre, il nostro approccio di calcolo della percentuale di mosche in più zone della scena può aiutare a minimizzare il contributo dei valori anomali nei dati.
Abbiamo anche deciso sistematicamente e in quel momento il punto di prendere i dati per confrontare i gruppi di trattamento. Dopo aver preso i dati ogni 5 secondi per 1 minuto, abbiamo tracciato i dati e ha scoperto che le differenze più notevoli tra i trattamenti potrebbero be visto a 30 sec. Dopo questo punto di tempo, mosche esposti al rotenone sono in grado di compensare i loro difetti locomotori. Pertanto, si consiglia agli utenti di ottimizzare i tempi di acquisizione dei dati per risolvere meglio le differenze tra loro controllo e set sperimentali. Questo approccio ha anche il vantaggio di determinare carenze locomotore relativi tra gli agenti farmacologici e / o modelli genetici. Ad esempio, un prodotto chimico più tossico rotenone può mostrare più notevoli differenze prima di 30 punto temporale sec.
Per il lungo termine test locomozione spontanea, dal momento che le mosche sono anestetizzati per introdurli nei tubi, non prendere in considerazione i dati di prime 24-48 ore per consentire l'anestesia di indossare-off e acclimatazione di mosche nei tubi del monitor. Un'altra considerazione per questo dosaggio è la posizione relativa del tubo e il sensore di movimento in DAM, che riteniamo possa influire i dati locomozione spontanea. Abbiamo messo le provette contenenti mosche nel monitorin modo che il sensore è stato monitorato un terzo arco di tubo più lontano dal cibo e non al centro del tubo, come avviene normalmente in uso tradizionale di DAM in studi circadiani. Questo ci ha permesso di esaminare la capacità delle mosche di attraversare almeno due terzi della lunghezza del tubo e ha portato a dati più consistenti. E 'probabile che i conteggi di attività possono essere influenzate in linea rotenone alimentati a causa di raffiche di movimento e / o contrazioni fenotipo. Altri possibili fattori di confondimento per i conteggi di attività potrebbe essere un gustativa e / o olfattiva di una avversione / attrazione verso rotenone e altre sostanze chimiche di interesse per l'utente. Pertanto, il monitoraggio video aggiuntivo 17,19 può essere utilizzato per integrare i dati DAM per un'analisi più approfondita del fenotipo locomozione.
In uno scenario in cui le mosche sperimentali hanno conteggi di attività simili a quelle con linea di controllo, è possibile che differiscono nella distribuzione circadiano circolazione dal fbugie sono più attivi attorno alla luce on / off e off / on transizione in una 12 ore di luce 12 ore ciclo scuro. Pertanto, sarebbe utile per determinare i conteggi per minuto in momenti e lunghezze bin multiple in un periodo di 24 ore per determinare l'esatta distribuzione di locomozione. In conclusione, questo saggio, per la sua capacità di valutare caratteristiche di movimento non limitato ai movimenti in risposta a spaventare, fornirà nuove intuizioni difetti di locomozione e caratterizzazione di strategie correttive.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Qiuli Wang, Language Resource Center, Colby College, per l'assistenza tecnica con l'elaborazione video e Eric Thomas, dipartimento di musica, Colby College, per fornire la musica di sottofondo. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal Centro Nazionale per la Ricerca Risorse, INBRE (P20RR016463-12), l'Istituto Nazionale per la General Medical Sciences (P20 GM103423-12), i cittadini Institutes of Health and Science Division di Grant, Colby College (STA). JL e LWM sono stati supportati da sovvenzioni dal Fondo Estate Scholar, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
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