Summary
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui résulte de la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le système nerveux central, ce qui provoque des défauts de locomotion. modèles de roténone la maladie de Parkinson chez la drosophile. Le présent document décrit deux essais qui caractérisent les lacunes à la fois spontanées et surprendre induites locomotion causés par la roténone.
Abstract
La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui résulte de la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans le système nerveux central, principalement dans la substance noire. La maladie provoque des déficiences motrices, qui présentent comme la rigidité, des tremblements et de la démence chez les humains. La roténone est un insecticide qui provoque des dommages oxydatifs en inhibant la fonction de la chaîne de transport des électrons dans les mitochondries. Il est également utilisé pour modéliser la maladie de Parkinson dans la drosophile. Les mouches ont une réponse négative geotactic inhérente, ce qui les obligent à monter vers le haut après avoir été surpris. Il a été établi que la roténone provoque des anomalies de mortalité et de locomotion début qui perturbent la capacité des mouches à grimper après qu'ils ont été exploitées vers le bas. Cependant, l'effet de la roténone sur le mouvement spontané n'est pas bien documenté. Cette étude décrit deux essais de débit sensibles, reproductibles, et élevés pour caractériser les carences induites roténone enlocomotion et la locomotion spontanée à long terme à court terme sursaut induite chez la drosophile. Ces dosages peuvent être facilement adaptés pour caractériser d'autres modèles de Drosophila de défauts de locomotion et de l'efficacité d'agents thérapeutiques.
Introduction
les irrégularités de locomotion sont un symptôme majeur de la maladie de Parkinson et sont en grande partie due à une dégradation des neurones dopaminergiques de la substantia nigra 1. La roténone est un insecticide cétoniques qui a été largement étudié pour modéliser les déficits moteurs parkinsoniens chez la drosophile 2-6. La roténone provoque des dommages oxydatifs en bloquant la voie de la phosphorylation oxydative, ce qui entraîne finalement la mort de la cellule 7. Les neurones dopaminergiques sont plus sensibles à la toxicité de la roténone, ce qui rend les effets de la substance chimique principalement basée 2,7 moteur. En induisant les symptômes de la maladie de Parkinson chez les mouches, nous pouvons mieux comprendre la maladie et ses symptômes remédier 6,8-11. Drosophila fournit un bon modèle pour étudier cet effet parce qu'ils sont génétiquement docile, facile à entretenir, et ont un cycle de vie rapide.
Plusieurs études ont montré que la roténone provoque à court terme sursaut induitedéfauts de locomotion chez la drosophile de les mouches sont maintenus sur l'alimentation de la roténone complété, ils montrent une réponse plus lente geotactic négatif après sursaut 2-6. Leur incapacité à monter vers le haut dans un appareil flacon aussi rapidement que les essais de contrôle indique des défauts de locomotion induite sursaut.
L'effet de la roténone sur le long terme, le mouvement spontané n'est pas bien décrite. Surveillance de l'activité chez la drosophile (barrages) ont été utilisés avec succès pour surveiller les mouvements chez la drosophile rythme circadien étudie 12,13. Les mouches sont placés dans des tubes individuels, qui sont chargés dans la DAM. Cet appareil est équipé d'un capteur infrarouge, qui compte le nombre de fois où une mouche rompt le faisceau infrarouge. Ces chiffres peuvent être utilisés comme mesure de la locomotion et 12,13 activité intacte. En plaçant les mouches dans un DAM, l'effet de la roténone sur leur locomotion à long terme peut être caractérisé. Cette étude décrit les méthodes à AEMlocomotion et la locomotion spontanée à long terme ure à court terme sursaut induite afin de mieux comprendre les effets de la roténone médiation déficiences motrices. Caractérisation des carences de locomotion mimant la maladie de Parkinson sont importants car ils permettent l'étude d'autres composés qui peuvent inverser ces défauts de locomotion.
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Protocol
1. Drosophila sursaut induite par dosage de locomotion
- Traitement de la toxicomanie
- Calme pour immobiliser nombre désiré (environ 8-12) de 1-3 jour-vieux mâle vole en utilisant le CO 2 et les transporter dans des flacons contenant de la nourriture de la drogue complété. Note: Un autre anesthésique par exemple, l'éther ou de la glace peut être utilisé pour endormir les mouches pour permettre le comptage et la manipulation.
- Autoriser les mouches de se remettre de la sédation pendant 20 minutes (ou jusqu'à ce que la récupération) avec le flacon en position horizontale (pour empêcher les mouches de se retrouver sur la nourriture) et puis placez le flacon en position verticale dans un endroit sombre de 12 h, la lumière incubateur de 12 h à 25 ° C pour le reste de l'expérience.
- Dispositif expérimental
- Diviser cette configuration à double flacon en trois parties égales de 6,33 cm par marquage des cercles autour des flacons avec un marqueur permanent.
- Après 3 jours d'exposition au médicament, transfert vole sans anesthésie dans le flacon fond et placer rapidement le flacon hautsur l'ouverture. Collez les deux flacons avec du ruban adhésif transparent.
- Autoriser les mouches à s'acclimater à leur nouvel environnement pendant 15 min.
- Placer les flacons sur un fond blanc et mis en place un appareil photo numérique à une distance appropriée de l'appareil à double flacon avec une minuterie en vue. S'assurer que la totalité de l'appareil est visible dans un cadre photo unique et que toutes les mouches sont au point. Pour maintenir des cadres cohérents entre les essais, marquer l'emplacement de la caméra et le flacon.
- Mobilité Assay
- Afficher clairement le numéro de l'essai, traitement de la toxicomanie, et la minuterie en vue de la caméra.
- Taper fermement l'appareil à double flacon contre le comptoir 3 fois et veiller à ce que toutes les mouches tombent au fond du flacon. Commencer simultanément la minuterie.
- Toutes les 5 secondes pendant 1 min, prendre une photo de l'appareil. Remarque: vous pouvez, une vidéo peut être capturé et mis en pause à des intervalles appropriés pour les mesures.
- Permettre de récupérer vol au repos pendant 1 min.
- Analyse des données
- Passez en revue les images et enregistrer le nombre de mouches dans chaque section au fil du temps. Calculer le pourcentage de mouches dans chaque section au fil du temps. Notes: Répétez cette procédure entière avec les mêmes mouches à 2 ou 3 points de temps d'intérêt, par exemple, jour 3, 5, et 7 Si trop de mouches meurent pendant l'expérience, il est possible d'intensifier le nombre de procès en première instance pour compenser pour la mortalité. Utiliser l'analyse statistique appropriée pour comparer les données.
2. Drosophila spontanée Locomotion Assay
- Préparation des aliments
- Reconstituer 3 g de milieu Drosophila instantanée avec 15 ml d'eau désionisée et la roténone souhaitée(Ou un autre médicament d'intérêt) dosage.
- Une fois le mélange alimentaire est devenue ferme (environ 5 min), charger attentivement la nourriture à environ 1 cm de hauteur en fabricant fournis tubes transparents (5 mm X 65 mm). Ajouter le médicament perfusé nourriture pour les tubes en plaçant soigneusement les tubes verticalement dans la nourriture et les tordre jusqu'à ce qu'ils puissent être enlevés avec de la nourriture à l'intérieur du tube. Remarque: Il est utile de placer un doigt sur l'ouverture du tube pour créer un vide. Aliments ne doivent pas contenir de bulles d'air ou avoir une surface inégale que les mouches peuvent se coincer.
- Configuration expérimentale
- Placer un capuchon en plastique sur l'extrémité du tube la plus proche de la nourriture. Poussez le couvercle en plastique sur le tube aussi peu que possible, car il peut créer une bulle d'air dans le flacon si on le pousse à force.
- Sedate 1 jour-vieux mâle vole en utilisant le CO 2 et insérer délicatement 1 mâle mouche dans chaque tube avec un pinceau. Répéter en fonction du nombre d'essais souhaités.
- Branchez l'partie la plus éloignée du tube de la nourriture avec une petite boule de coton, qui peut être roulé à la main de grand magasin a acheté des boules de coton.
- Autoriser les mouches de récupérer les tubes en position horizontale pendant 15 minutes et faire en sorte que toutes les mouches sont vivants et actifs. Insérer les tubes dans DAM et assurez-vous que tous les tubes sont dans la même position par rapport au barrage. Remarque: il est possible de les placer à la zone de surveillance au moyen de l'ampoule, ou pour pousser tous les flacons sur le côté, de sorte que l'extrémité du tube est surveillée. Remarque: Voir la discussion des variations sur cette méthode.
- Collecte des données
- Placez le DAM dans un endroit sombre 12 h, incubateur de lumière de 12 h réglé à 25 ° C. Connectez le DAM pour le système de collecte de données. Ouvrez le logiciel de DAM et dans les préférences, sélectionnez la longueur du bac à 10 min. Lancer la collecte des données et permettre au programme de collecte de données pendant 7 jours. Remarque: longueur Bin peut être ajustée si nécessaire.
- Analyse des données
Remarque: Processobtenir les données de coups par minute en tant que mesure de la locomotion spontanée à long terme.- Ouvrir le fichier DAM programme et l'accès de surveiller les données de numérisation, cliquez données de sélection d'entrée.
- Sélectionnez la plage de surveillance approprié et sélectionnez la longueur du bac à intervalles de 10 minutes.
- Dans le type de fichier de sortie choisir les fichiers de canal. Laissez toutes les autres options par défaut.
- Cliquez données de numérisation et enregistrer dans un dossier désigné.
- Importer des données dans un logiciel d'analyse de données circadien d'obtenir coups par min. Remarque: Pour l'analyse des données des logiciels Clocklab est couramment utilisé. D'autres options sont également disponibles.
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Representative Results
Drosophila sursaut induite par dosage de locomotion
De type sauvage, Canton-S, les mouches ont montré une réponse négative geotactic robuste avec seulement environ 88% et 5% de mouches dans les parties supérieure et inférieure, respectivement, de l'appareil à double flacon après 30 secondes (Figure 1). Mouches exposées à 125 pM et 250 pM roténone pendant 3 jours ont montré une légère diminution du nombre de mouches dans la section supérieure et une légère augmentation du nombre de mouches dans la section du bas. Les mouches exposées à 500 pM roténone ont montré défaut important dans la réponse geotactic négative (p <0,05 ANOVA, Bonferroni paire comparaison sage) comme en témoigne moins de mouches dans la partie supérieure et plus de mouches dans la section inférieure par rapport à lutter contre les mouches (figure 1). Ce défaut de réponse geotactic négative due à l'impossibilité de monter rapidement dans l'appareil est indicative d'un défaut de sursaut enlocomotion duit.
Drosophila spontanée Locomotion Assay
De type sauvage, Canton-S, les mouches ont montré 0,57 coups par minute comme une mesure de la mobilité spontanée sur le quatrième jour de la DAM (Figure 2). Mouches exposées à 125 pM roténone ont montré un niveau de locomotion spontanée similaire. En revanche, les mouches exposé à 250 um et 500 um roténone a montré mesures environ 50% plus faibles (p <0,05 ANOVA, Bonferroni paire comparaison sage) de la locomotion spontanée (figure 2). Ces mouches déplacés à environ 0,20 coups par minute, ce qui est indicatif d'un défaut induit roténone dans la locomotion spontanée.
Pour tenir compte des écarts initiaux (le cas échéant) de la locomotion ne sont pas causées par l'exposition de la roténone, nous avons soustrait les données de locomotion entre le jour 4 et le jour 3. vol de contrôle a montré une augmentation d'environ 0,1 coups par minute en spontaneonous locomotion entre les jours, tandis que les mouches exposées à 125 pM roténone ont montré une légère baisse d'environ 0,15 coups par minute (Figure 3). Les mouches exposées à 250 pM et 500 pM de roténone affichées diminue plus sévères dans la locomotion entre les jours, les différences étant d'environ 0,3 et 0,5 (p <0,05 ANOVA, paire de Bonferroni sage comparaison) coups par minute respectivement. Ces données suggèrent une carence dans la locomotion spontanée au fil du temps à l'exposition à la roténone et confirme l'analyse en une seule journée mentionné ci-dessus - mouches exposées à des doses plus élevées de la roténone a montré une diminution de la locomotion spontanée. Pris ensemble, ces méthodes mesurent de façon fiable les carences induites roténone en sursaut spontané et induit locomotion.
Figure 1 induite sursaut-terrain de locomotionmouches exposées à des doses croissantes de la roténone. type sauvage, Canton-S, les mouches mâles ont été exposés à des doses différentes de la roténone pour 3 jours et les mouches survivants (8-12) ont ensuite été taraudés dans le fond de l'appareil à double flacon. Les mouches exposées à 500 pM de roténone montrent une diminution significative du vol en pour cent de la partie supérieure (A) et l'augmentation du pour cent de vol dans la section inférieure (B) de l'appareil après 30 sec. Ceci est une indication d'une déficience de la réponse de sursaut chez les mouches exposées à la roténone. Les colonnes représentent le pourcentage moyen de six expériences indépendantes. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne; * P <0,05 ANOVA, paire de Bonferroni comparaison sage.
Figure 2 locomotion spontanée terrain de mouches exposé à dose croissantes de la roténone. Type sauvage, Canton-S, mouches mâles ont été exposés à des doses différentes de la roténone et coups par minute le quatrième jour après l'exposition ont été tracés. Comptages ont été mesurés dans un DAM. Les mouches exposées à 250 pM et 500 pM de roténone montrent une réduction en coups par minutes. Ceci est une indication d'une déficience de locomotion spontanée chez les mouches exposées à la roténone. Colonnes représentent les comptes moyens par minute sur le quatrième jour de 5 essais indépendants. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne; * P <0,05 ANOVA, paire de Bonferroni comparaison sage.
Figure 3 Variation de la parcelle de la locomotion spontanée des mouches exposées à des doses croissantes de la roténone. Type sauvage, Canton-S, mouches mâles ont été exposés à des doses différentes de la roténone et la différence en coups par min on le troisième et le quatrième jour après l'exposition ont été tracés. Comptages ont été mesurés dans un DAM. Il ya une tendance dose-dépendante de baisse de la locomotion spontanée de mouches exposées à des doses plus élevées ayant un changement plus négatif dans la locomotion. Ceci est indicatif d'une diminution de la circulation. Colonnes représentent la variation moyenne de locomotion par minute de 5 essais indépendants. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne; * P <0,05 ANOVA, paire de Bonferroni comparaison sage.
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Discussion
Dans cette étude, nous décrivons deux procédures pour mesurer à la fois la locomotion spontanée à long terme et de la locomotion induite sursaut court-terme dans un modèle drosophile induit roténone de la maladie de Parkinson. On peut aussi mesurer ces caractéristiques de la locomotion chez les mouches exposés à d'autres agents pharmacologiques connus pour modéliser la maladie de par exemple de la maladie de Parkinson, le paraquat 14, les modèles génétiques de la maladie d'exemple de la maladie de Parkinson, des mutants alpha-synucléine 15, et d'autres modèles de mouches de maladies affectant la locomotion. Pour les deux méthodes, les méthodes alternatives et modifications peuvent être envisagées. Les mouches peuvent être anesthésiés avec de la glace, ce qui pourrait atténuer les limitations de CO 2 anesthésie par exemple retard dans la collecte de données à laisser CO 2 effet s'estomper.
Dans le test de locomotion induite par sursaut, vol depuis montrent la variation circadienne de la mobilité, il est important de collecter des données à la fois de l'jour entre les expériences. Il est également important d'introduire vol dans le dispositif de test sans anesthésie. Contrairement à la plupart des essais de locomotion de réponse de sursaut, qui reposent sur un instantané de passer un seuil dans un laps de temps prédéterminé 10,11,15,16, notre approche, semblable à géotaxie rapides itératives négatifs (RING) de dosage 17,18, surveille l' mouvement à plusieurs occurrences successives sur une période de temps. Cette approche de la surveillance continue de la répartition des mouches dans les différentes zones peut résoudre les différences subtiles entre les groupes de traitement. De plus, notre approche du calcul du pourcentage de mouches dans plusieurs zones de l'arène peut aider à réduire la contribution des valeurs aberrantes dans les données.
Nous avons également décidé systématiquement à laquelle le point de prendre des données pour comparer les groupes de traitement. Après la prise de données toutes les 5 secondes pendant 1 minute, nous avons tracé les données et constaté que les différences les plus notables entre les traitements pourraient be vu à 30 sec. Après ce point de temps, mouches exposées à la roténone sont en mesure de compenser leurs défauts de l'appareil locomoteur. Par conséquent, nous recommandons aux utilisateurs d'optimiser le calendrier d'acquisition de données afin de résoudre au mieux les différences entre leur contrôle et les coffrets d'expériences. Cette approche présente aussi l'avantage de déterminer les irrégularités de locomotion relatifs entre les agents pharmacologiques et / ou des modèles génétiques. Par exemple, un produit encore plus toxique que la roténone peut montrer les différences les plus notables antérieures à 30 point de temps sec.
Pour le long terme test de locomotion spontanée, car les mouches sont anesthésiés pour les introduire dans les tubes, ne considèrent pas les données des 24-48 premières heures pour permettre l'anesthésie à l'usure-off et de l'acclimatation des mouches dans les tubes cathodiques. Une autre considération pour ce test est la position relative du tube et le capteur de mouvement dans DAM, dont nous pensons peuvent influer sur les données de la locomotion spontanée. Nous avons placé les tubes contenant les mouches dans le moniteurde sorte que le capteur a été suivi d'un tiers la durée de la plus éloignée du tube à partir de la nourriture et non au milieu du tube, comme on le fait habituellement dans l'utilisation traditionnelle de la DAM dans les études circadiens. Cela nous a permis d'examiner la capacité des mouches à traverser au moins deux tiers de la longueur du tube et a conduit à des données plus cohérentes. Il est probable que les chiffres de l'activité peuvent être affectés à vol d'roténone nourris en raison de rafales de mouvement et / ou phénotype secousses. D'autres facteurs de confusion possibles pour les comptages d'activité pourrait être un gustative et / ou une aversion olfactive / attraction vers la roténone et d'autres produits chimiques d'intérêt pour l'utilisateur. Par conséquent plus suivi vidéo 17,19 peut être utilisé pour compléter les données de DAM pour une analyse plus approfondie du phénotype de la locomotion.
Dans un scénario où les mouches expérimentales ont comptages d'activité similaires à celles obtenues pour les mouches de commande, il est possible qu'elles diffèrent dans la distribution de mouvement depuis circadien fmensonges sont plus actifs dans la lumière on / off et transition Marche / Arrêt dans une lumière 12 h cycle d'obscurité de 12 h. Par conséquent, il serait utile de déterminer les coups par minutes à plusieurs points dans le temps et la longueur des poubelles dans une période de 24 heures afin de déterminer la répartition exacte de la locomotion. En conclusion, cette analyse, en raison de sa capacité à évaluer les caractéristiques du mouvement ne se limite pas à des mouvements en réponse à surprendre, offrira de nouvelles perspectives sur les défauts de locomotion et la caractérisation des stratégies correctives.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Qiuli Wang, Centre de ressources de langues, Colby College, de l'assistance technique avec le traitement vidéo et Eric Thomas, département de musique, Colby College, pour fournir la musique de fond. Ce projet a été financé par des subventions du Centre national des ressources de recherche, INBRE (P20RR016463-12), l'Institut national des sciences médicales générales (P20 de GM103423-12), les ressortissants Institutes of Health et la Division des sciences Grant, Colby College (STA). JL et LWM ont été pris en charge par des subventions du Fonds Scholar été, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
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