Summary
パーキンソン病は、運動欠陥を引き起こす中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。ロテノンモデルショウジョウバエのパーキンソン病。本論文では、ロテノンによって引き起こされる自発的かつ驚愕誘発性の両方歩行の欠陥を特徴づける2つのアッセイの概要を説明します。
Abstract
パーキンソン病は、主に黒質に、中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。疾患は、ヒトにおける剛性、振戦および痴呆として存在モータの欠陥を引き起こす。ロテノンは、ミトコンドリアにおける電子伝達系の機能を阻害することによって、酸化的損傷を引き起こす殺虫剤である。また、 ショウジョウバエにおけるパーキンソン病をモデル化するために使用される。ハエは、びっくりしている時に上向きに登るためにそれらを強いる固有の負の走地性の応答を持っている。それは、ロテノンは、彼らが下向きにタップされた後に登るハエの能力を混乱の早期死亡率と運動の欠陥の原因となることが確立されている。しかし、自発的な運動にロテノンの効果は十分に文書化されていません。この研究は、内ロテノン誘導性の欠陥を特徴付けるために二つ敏感な再現性、高スループットアッセイを概説ショウジョウバエの短期的な驚愕誘発性運動と長期自発運動。これらのアッセイは、好都合に移動欠陥および治療 薬の有効性の他のショウジョウバエモデルを特徴付けるために適合させることができる。
Introduction
ロコモーションの不備は、パーキンソン病の主な症状であり、主に黒質1のドーパミン作動性ニューロンの劣化によって引き起こされる。ロテノンは、 ショウジョウバエ 2-6のパーキンソン運動障害をモデル化するために広く研究されているケトン殺虫剤である。ロテノンは、最終的に細胞死7を引き起こす酸化的リン酸化経路を遮断することによって酸化的損傷を引き起こす。ドーパミン作動性ニューロンは、主にモータが2,7を基に化学物質の影響を作り、ロテノン毒性になりやすいです。彼らは遺伝的に扱いやすいですのでハエでパーキンソン病症状を誘導することによって、私たちはより良い病気を理解し、その症状6,8-11を解決することができます。 ショウジョウバエは維持し、迅速なライフサイクルを持ちやすい、この効果を研究するための優れたモデルを提供します。
いくつかの研究は、ロテノン、短期驚愕誘発性の原因となることが示されているショウジョウバエ毎期ハエにおける歩行欠陥がロテノン補充食品で維持されている、彼らは驚愕2-6の後に遅い負走地性の応答を示しています。対照トライアル限り迅速にバイアル装置において上向きに登るため彼らの失敗は驚愕誘発性運動欠陥を示すものである。
長期的にロテノンの効果は、自発的な動きがよくショウジョウバエの活動モニター（のDAM）が正常ショウジョウバエ概日リズムの動きを監視するために使用されている。記載12,13を研究されていない。ハエは、DAMにロードされる個別のチューブ内に配置される。この装置は、ハエが赤外線ビームを遮断回数をカウントする赤外線センサを備えている。これらのカウントは、邪魔されずに移動および活性12,13の尺度として用いることができる。 DAMでハエを確定すると、長期的な運動に対するロテノンの影響を特徴づけることができる。この研究は、MEASへの方法について説明しますより良いロテノン仲介モーターの欠陥の影響を理解するためにURE短期の驚愕誘発性運動と長期自発運動。彼らはこれらの運動欠陥を逆転し得る他の化合物の研究のために可能にするので、パーキンソン病を模倣運動欠乏症の特性が重要である。
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Protocol
1 ショウジョウバエ驚愕誘発性歩行アッセイ
- 薬物治療
- CO 2を使用して、1〜3日齢のオスのハエの希望数を（およそ8-12）固定化し、薬剤を補充食品を含むバイアルに輸送することが落ち着いた。注：別の麻酔薬、例えばエーテルまたは氷が計数および取り扱いを可能にするためにハエを鎮静するために使用することができます。
- ハエは（食品に付着したばかりハエを防ぐために）水平にバイアルを20分間（またはリカバリまで）、鎮静から回復した後、12時間の暗闇の中で直立バイアルを配置することができ、25℃で12時間の明インキュベーター実験の残りのために。
- 実験のセットアップ
- 油性マジックでバイアルの周りに円をマークすることで、6.33センチメートルの3等分この二重バイアルセットアップを分割します。
- 薬物曝露の3日後、転送が底バイアル中に麻酔なしで飛ぶとすぐにバイアルを置く開口部に。明確なテープと一緒に2つのバイアルをテープで固定します。
- ハエは15分間、新しい環境に順応できるようにします。
- 場所バイアル白地に、ビュー内のタイマによる二重バイアル装置から適切な距離にデジタルカメラを設置。装置全体は、単一の画像フレームで表示され、すべてのハエが焦点になっていることを確認してください。試験間一貫したフレームを維持するために、カメラやバイアルの位置をマーク。
- モビリティアッセイ
- 明らかに、カメラビューに試行番号、薬物治療、タイマーを表示する。
- しっかりとカウンターに対する二重バイアル装置を3回タップすると、すべてのハエがバイアルの底に落ちることを確認してください。同時にタイマーを開始。
- 1分間ごとに5秒間、装置の写真を撮る。注：または、ビデオがキャプチャされ、測定のための適切な間隔で一時停止することができた。
- ハエが1分間邪魔されずに回復することを許可します。
- データ分析
- 写真を確認し、時間をかけて各セクションのハエの数を記録する。時間をかけて各セクションのハエの割合を計算します。注：あまりにも多くのハエは、実験を通して死ぬ場合は、補償するために、元の試行番号をスケールアップすることが可能であり、例えば、関心のある2または3の時点で同一のハエで、この手順全体を繰り返して3日目、5、および7死亡率。データを比較するために、適切な統計分析を使用してください。
2 ショウジョウバエ自発歩行アッセイ
- 食品の調製
- 15脱イオン水mlの希望ロテノンインスタントショウジョウバエ培地の3グラムを再構成（または関心のある別の薬剤）の投与量。
- 食品混合物はしっかりした（約5分）となっていたら、慎重にメーカーへの高約1cmを透明のチューブ（5ミリメートル×65 mm）を供給すべき食品をロードします。慎重に食品中に垂直にチューブを配置し、それらがチューブ内の食品を用いて除去することができるまで、それらをねじることによって管に食物を注入された薬剤を追加します。注：これは、真空を作成するために、管の開口部に指を置くと便利です。食べ物は気泡が含まれているか、ハエがままになることがように表面に凹凸があってはなりません。
- 実験の設定
- 食品最寄りのチューブの端部にプラスチックキャップを置きます。強制的にプッシュされた場合、それがバイアル内に気泡を作成することができますよう、可能な限り少ない管上にプラスチックキャップを押してください。
- 落ち着いた1日齢の雄は、CO 2を使用して飛行し、慎重に1オスが絵筆を各チューブに飛んで挿入します。所望の試行回数に応じて繰り返す。
- プラグ大きな店買ったコットンボールから手をロールバックすることができ、小さなコットンボールを持つ食物からチューブ最も遠い、の終わり。
- ハエは15分間水平にチューブを回復し、すべてのハエが生きて、アクティブであることを確認できるようにします。 DAMにチューブを挿入し、すべての管がDAMに対する相対同じ位置にあることを確認してください。注：これは、管の端部が監視されているように、バイアル瓶の中央モニタリングの領域とに配置する、または側面にすべてのバイアルをプッシュすることが可能である。注：この方法のバリエーションのための説明を参照してください。
- データ収集
- 12時間の暗闇の中でDAMを置き、12時間の明インキュベーターを25℃に設定してください。データ収集システムにDAMを接続します。 DAMソフトウェアを開いて、好みの下で10分のビンの長さを選択します。データ収集を開始し、番組が7日間のデータを収集できる。注：必要に応じてビンの長さを調整することができる。
- データ分析
注：プロセスデータは、長期自発運動の尺度として分あたりのカウントを得る。- 選択入力データをクリックして開くDAMファイルスキャンプログラムとアクセスモニタデータ。
- 適切なモニターの範囲を選択し、10分間隔にビンの長さを選択します。
- 出力ファイル·タイプは、チャネルファイルを選択します。デフォルトとして他のすべてのオプションのままにしておきます。
- スキャンデータをクリックして、指定したフォルダに保存します。
- 分あたりのカウントを取得するために、概日データ解析ソフトウェアでデータをインポート。注：データ解析Clocklabソフトウェアが一般的に使用されるために。その他のオプションも用意しています。
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Representative Results
ショウジョウバエ驚愕誘発性歩行アッセイ
野生型、 カントン-Sは 、ハエは、30秒（ 図1）の後に二重バイアル装置の、それぞれわずか約88％、上部と下部でのハエの5％堅牢な負走地性の反応を示した。 3日間125μMおよび250μMロテノンにさらさハエは、上部セクションと下部セクションのハエの数がわずかに増加中のハエの数がわずかに減少を示した。 500μMのロテノンにさらさハエは対照ハエ（ 図1）と比較して、一番上の部分と下側部分でよりハエにおける少数ハエによって証明されるように、負の走地性の応答した（p <0.05 ANOVA、ボンフェローニペア単位の比較）において有意な欠陥を示した。により迅速に装置内に登ることができないことに対する否定走地性の応答におけるこの欠陥は驚愕インでの欠陥の指標であるduced移動。
ショウジョウバエ自発歩行アッセイ
野生型、 カントン-S、ハエは、DAM（ 図2）で4日目に自発的な移動性の尺度として、毎分0.57カウントを示した。 125μMのロテノンにさらさハエは、自発運動の同様のレベルを示した。これとは対照的に、250μMおよび500μMロテノンにさらさハエは、自発運動の約50％低い施策た（p <0.05 ANOVA、ボンフェローニペア単位の比較）（ 図2）を示した。これらのハエは、自発運動におけるロテノン誘発性欠陥の指標である毎分約0.20カウントで移動。
ロテノン曝露に起因するものではない運動の初期の矛盾（もしあれば）を考慮するために、私たちは4日目と3日目のコントロールハエ間の歩行データを差し引くことspontaneoにおいて毎分約0.1カウントの増加を示したハエは125μMのロテノンにさらされ、毎分約0.15カウント（ 図3）のわずかな低下を示しながら、私たちは、日の間に移動。 250μMおよび500μMロテノンにさらさハエは違いが約0.3〜0.5であることと、日の間に歩行でより深刻な減少を示した（P <0.05 ANOVAは、ボンフェローニペア単位の比較）は、それぞれ、カウント毎分。このデータは、ロテノンへの曝露との時間にわたる自発運動の欠陥を示唆していると、上述した一日の分析を確認する - ロテノンの高用量に暴露したハエは、自発運動の減少を示した。まとめると、これらの方法は、確実に自発的かつ驚愕誘発性運動におけるロテノン誘発性の欠陥を測定します。
1。驚愕誘発性運動プロット図ロテノンの投与量の増大にさらさハエ。野生型、 カントン-Sは 、オスのハエは3日間生存しているハエ（8-12）のためのロテノンの異なる投与量にさらされたが、その後、二重バイアル装置の底にタップされた。 500μMのロテノンにさらさハエがトップ（A）におけるハエの割合の有意な減少を示し、30秒後に装置の底部に（B）中のハエのパーセントで増加。これはロテノンにさらさハエにおける驚愕反応の欠損の指標である。カラムは、6つの独立した実験の平均割合を表す。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 * P <0.05 ANOVA、ボンフェローニのペア単位の比較。
ハエの図2。自発運動プロットは漸増用量にさらさロテノンのsの野生型、 カントン-Sは 、オスのハエは、露出をプロットした後の4日目にロテノンと分当たりのカウントの異なる投与量に暴露した。カウントはDAMで測定した。 250μMおよび500μMロテノンにさらさハエは分あたりのカウントの減少を示す。これはロテノンにさらさハエにおける自発運動の不足を示している。カラムは、5つの独立した試験の4日目の分あたりの平均カウントを表します。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 * P <0.05 ANOVA、ボンフェローニのペア単位の比較。
ロテノンの投与量の増加にさらさハエの自発運動プロットにおける図3に変更。野生型、 カントン-Sは 、オスのハエは、異なるロテノンの投与量および分Oあたりのカウントの差にさらされたnは、露光後の第三及び第四日目にプロットした。カウントはDAMで測定した。歩行でより負の変化を持つ、より高い用量にさらさハエと自発運動の減少のための用量依存性の傾向があります。これは、運動の減少の指標である。カラムは、5つの独立した試験の分あたりの運動の平均変化を表している。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 * P <0.05 ANOVA、ボンフェローニのペア単位の比較。
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Discussion
本研究では、パーキンソン病のロテノン誘発性ショウジョウバエモデルにおける長期的な自発運動および短期驚愕誘発性運動の両方を測定するための2つの手順を説明します。 Oneはまた、パーキンソン病などをモデル化することが知られている他の薬理学的薬剤、パラコート14、パーキンソン病などの遺伝的モデルが、α-シヌクレイン変異体15、及び移動に影響を与える疾患の他のハエモデルにさらさハエにおけるこれらの運動特性を測定することができる。両方の方法については、代替的な方法および修正が考えられる。ハエをCO 2効果が脱ぎ履きできるように、データ収集例遅れをCO 2麻酔の制限を緩和することができ、氷を用いて麻酔することができる。
ハエは、移動度の概日変動を示すので、驚愕誘発性歩行運動アッセイでは、それは同時にデータを収集することが重要である実験間の一日。これは、麻酔なしで試験装置にハエを導入することも重要である。時間10,11,15,16所定量のしきい値を渡すのスナップショットに依存しているほとんどの驚愕反応歩行アッセイとは対照的に、迅速な反復負走地（RING）アッセイ17,18と同様のアプローチは、監視し、一定期間の連続した複数のインスタンスで動作。異なるゾーンのハエの分布の継続的な監視のこのアプローチは、治療群間の微妙な違いを解決することがあります。また、アリーナの複数のゾーンにハエの割合を計算する私たちのアプローチは、データ内の外れ値の寄与を最小限に抑えることがあります。
また、体系的治療群を比較するためのデータを取るために、その時間の時点で決定した。 1分間のデータごとに5秒を取った後、私たちは、データをプロットし、治療の間の最も顕著な違いをbできることがわかっeは、30秒で見られる。この時点の後、ロテノンにさらさハエは、彼らの運動の欠陥を補うことができます。そこで私たちは最高のそれらの制御と実験セット間の相違を解決するために、データ収集のタイミングを最適化するために、ユーザーにお勧めします。このアプローチはまた、薬理学的物質および/または遺伝的モデルとの間の相対運動欠陥を決定するという利点を有する。例えば、ロテノンより毒性化学物質は30秒の時点よりも早く、最も顕著な違いを示してもよい。
ハエは、チューブでそれらを紹介して麻酔をかけているので、長期自発運動アッセイのために、麻酔モニターチューブ中のハエのと順化オフを身に着けるためにできるように、最初の24〜48時間のデータを考慮していない。このアッセイのための別の考慮事項は、管の相対的な位置、私たちは自発的な運動データに影響を与えることができると思うDAMモーションセンサである。私たちは、モニターにハエを含むチューブに入れ通常、概日研究におけるDAMの伝統的な使用で行われるようにセンサーが食品ではなく、チューブの途中からチューブ最も遠いの三分の一のスパンを監視していたように。これは、私たちは、チューブの長さの3分の2以上を横断するハエの能力を調べることができ、より一貫性のあるデータにつながった。これは、アクティビティの数が移動によるバーストおよび/またはけいれん表現型にロテノン与えたハエに影響を受ける可能性が可能性が高い。アクティビティカウントのための他の可能な交絡因子は、味覚および/またはロテノン、ユーザーに関心のある他の化学物質に向かって嗅覚嫌悪/アトラクションである可能性があります。したがって、追加のビデオトラッキング17,19は、運動表現型のより徹底的な分析のためにDAMデータを補完するために使用することができる。
対照ハエと比較して、実験ハエが同様の活性カウントを有するシナリオでは、それらをfから運動の概日分布が異なることが可能である嘘がオン/オフし、12時間の光、12時間暗サイクルの遷移のON / OFF光の周りがよりアクティブになっている。そのため、運動の正確な分布を決定するために24時間に複数の時点とビンの長さで分あたりのカウントを決定することに役立つだろう。結論として、このアッセイは、驚愕によるに応答して運動に限定されるものではない運動特性を評価する能力を、救済戦略の運動不良や特性評価に新たな洞察を提供するであろう。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
著者らは、バックグラウンドミュージックを提供するために、ビデオ処理とエリック·トーマス、音楽科、コルビー大学と技術支援のために、Qiuli王、言語リソースセンター、コルビー·カレッジに感謝したいと思います。このプロジェクトは、研究資源、INBRE（P20RR016463-12）ナショナル·センターからの助成、一般的な医科学研究所（P20のGM103423-12）、健康科学課グラント、コルビー·カレッジ（STA）の国民研究所によってサポートされていました。 JLとLWM夏奨学生基金、コルビー大学からの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
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