Summary
Parkinsons sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som er et resultat av degenerasjon av dopaminerge neuroner i sentralnervesystemet, forårsaker locomotion defekter. Rotenon modeller Parkinsons sykdom i Drosophila. Dette notatet skisserer to analysene som preger både spontane og skremme-indusert locomotion mangler forårsaket av rotenon.
Abstract
Parkinsons sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som er et resultat av degenerasjon av dopaminerge neuroner i sentralnervesystemet, primært i substantia nigra. Sykdommen forårsaker motor mangler, som presenterer som stivhet, skjelvinger og demens hos mennesker. Rotenon er et insekticid som fører til oksidativ skade ved å hemme funksjon av elektrontransportkjeden i mitokondriene. Det er også brukt til å modellere Parkinsons sykdom i Drosophila. Fluer har en iboende negativ geotactic respons, som tvinger dem til å klatre oppover etter å ha blitt skremt. Det er fastslått at rotenon forårsaker tidlig dødelighet og locomotion defekter som forstyrrer fluene 'evne til å klatre etter at de har blitt tappet ned. Imidlertid, er effekten av rotenon på spontan bevegelse ikke godt dokumentert. Denne studien skisserer to sensitive, reproduserbare, og høy gjennomstrømning analyser for å karakterisere rotenon-indusert mangler ikortsiktig skremme-indusert bevegelse og langsiktig spontan bevegelse i Drosophila. Disse assays kan enkelt tilpasses for å karakterisere andre Drosophila modeller for bevegelse defekter og effekten av terapeutiske midler.
Introduction
Bevegelse manglene er et viktig symptom av Parkinsons sykdom, og er i stor grad forårsaket av forverringen av dopaminerge neuroner i substantia nigra 1. Rotenon er en ketonic insektmiddel som har blitt studert inngå å modellere Parkinsons motoriske mangler i Drosophila 2-6. Rotenon fører til oksidativ skade ved å blokkere oksidativ fosforylering svei, som til slutt fører til celledød 7. Dopaminerge nevroner er mer utsatt for rotenon toksisitet, noe som gjør virkningen av den kjemiske primært motoren basert 2,7. Ved å fremkalle Parkinsons sykdom symptomer i fluer, kan vi bedre forstå sykdommen og utbedre sine symptomer 6,8-11. Drosophila gir en god modell for å studere denne effekten fordi de er genetisk medgjørlig, lett å vedlikeholde, og har en rask livssyklus.
Flere studier har vist at rotenon fører kortsiktig skremme-indusertlocomotion defekter i Drosophila-når fluer er opprettholdt på rotenon-supplert mat, viser en langsommere negativ geotactic respons etter skremme 2-6. Deres manglende evne til å klatre oppover i et hetteglass apparat så raskt som kontrollforsøk er et tegn på skremme-indusert locomotion defekter.
Effekten av rotenon på lang sikt, er spontan bevegelse ikke godt beskrevet. Drosophila aktivitets skjermer (demninger) har blitt brukt til å overvåke bevegelser i Drosophila døgnrytme studerer 12,13. Fluer er plassert i individuelle rør, som er lastet opp i dammen. Denne apparatur er utstyrt med en infrarød sensor, som teller antallet ganger en flue bryter den infrarøde strålen. Disse tellinger kan brukes som et mål på uforstyrret bevegelse og aktivitet 12,13. Ved å plassere fluer i en DAM, kan effekten av rotenon på deres langvarige bevegelse karakteriseres. Denne studien beskriver metoder til måleure kortsiktig skremme-indusert bevegelse og langsiktig spontan bevegelse for å bedre forstå effektene av rotenon mediert motoriske mangler. Karakterisering av locomotion mangler mimicking Parkinsons sykdom er viktige fordi de gir mulighet for studiet av andre forbindelser som kan reversere disse locomotion defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila Sjokk-induced Locomotion Assay
- Drug Treatment
- Sedate å immobilisere ønsket antall (ca. 8-12) av 1-3 dager gammel mann flyr ved hjelp av CO 2 og transportere dem til hetteglass som inneholder stoffet-supplert mat. Merk: En annen bedøvende f.eks, eter eller is kan bli brukt til å bedøve fluer for å muliggjøre telling og håndtering.
- Tillat fluer å gjenopprette fra sedasjon i 20 min (eller til gjenvinning) med hetteglasset i en horisontal stilling (for å forhindre fluer setter seg fast på mat) og deretter plassere røret stående i en 12 timers mørke, 12 t lys inkubator ved 25 ° C for resten av forsøket.
- Eksperimentell Set Up
- Dele denne doble hetteglass oppsett i tre like deler av 6.33 cm ved å markere sirkler rundt hetteglassene med en permanent markør.
- Etter 3 dagers legemiddeleksponering, fluer overføring uten bedøvelse inn i bunnen av hetteglasset og raskt å sette topphetteglassetover åpningen. Tape de to hetteglassene sammen med klar tape.
- Tillat fluer for å akklimatisere seg til de nye omgivelsene i 15 minutter.
- Plasser hetteglassene på en hvit bakgrunn og sette opp et digitalt kamera på et passende avstand fra den doble hetteglass apparat med en tidtaker i sikte. Sørg for at hele apparatet er synlig i en enkelt bilderammen og at alle fluer er i fokus. For å opprettholde konsekvente rammer mellom studier, og merk plasseringen av kamera og hetteglass.
- Mobilitet Assay
- Tydelig vise prøvenummeret, medikamentell behandling, og timer i kamerabildet.
- Fast trykk på dobbel hetteglass apparat mot benken tre ganger og sikre at alle fluene falle til bunnen av flasken. Samtidig starter tidtakeren.
- Hver 5 sek i 1 min, ta et bilde av apparatet. Merk: Alternativt kan en video bli fanget og satt på pause med passende mellomrom for målinger.
- Tillat fluer for å gjenopprette uforstyrret i 1 min.
- Data Analysis
- Se på bilder og registrere antall fluer i hver del over tid. Beregn prosentandelen av fluer i hver seksjon over tid. Merknader: Gjenta denne hele prosedyren med de samme fluer på 2 eller 3 tidspunkter av interesse, for eksempel, dag 3, 5 og 7. Hvis det er for mange fluer dø i løpet av forsøket er det mulig å skalere opp det opprinnelige prøvenummeret for å kompensere for dødelighet. Bruk egnet statistisk analyse for å sammenligne data.
2. Drosophila Spontan Locomotion analysen
- Matlaging
- Rekonstituer 3 g instant Drosophila medium med 15 ml deionisert vann og ønsket rotenon(Eller et annet legemiddel av interesse) dosering.
- Når maten blandingen har blitt fast (ca 5 min), nøye laste at maten skal være ca 1 cm høye til produsenten levert gjennomsiktige rør (5 mm x 65 mm). Tilsett medikamentet tilført mat til rørene ved forsiktig å plassere rørene vertikalt i mat og vri dem inntil de kan fjernes med maten inne i røret. Merk: Det er nyttig å plassere en finger på åpningen av røret for å skape et vakuum. Mat bør ikke inneholde noen luftbobler eller har en ujevn overflate som fluene kan bli sittende fast.
- Eksperimentell Setup
- Plasser en plasthette på enden av røret nærmest mat. Skyv plasthette på røret så lite som mulig, så det kan skape en luftboble i ampullen hvis presset til makt.
- Sedate 1 dag gammel mann flyr ved hjelp av CO 2 og nøye sette inn en mannlig fly i hvert rør med en pensel. Gjenta avhengig av antall ønskede forsøk.
- Pluggenden av røret lengst unna mat med en liten bomullsdott, som kan hånd rullet fra større butikken kjøpte bomullsdotter.
- Tillat fluer for å gjenopprette med rørene i horisontal stilling i 15 minutter, og sikre at alle fluer er i live og aktive. Sett rørene i DAM og sørge for at alle rørene er i samme posisjon i forhold til demningen. Merk: Det er mulig å plassere dem med overvåkingsområde på midten av beholderen, eller for å skyve alle ampuller til siden, slik at enden av røret som blir overvåket. Merk: Se diskusjonen for variasjoner på denne metoden.
- Datainnsamling
- Plasser DAM i en 12 timers mørke, 12 timers lys inkubator innstilt på 25 ° C. Koble DAM til datainnsamlingssystem. Åpne DAM programvare og under preferanser velger bin lengde til 10 min. Starte datainnsamling og tillate programmet å samle inn data for 7 dager. Merk: Bin lengde kan justeres ved behov.
- Data Analysis
Merk: Processdata for å få tellinger pr min som et mål for langsiktig spontan bevegelse.- Åpne DAM fil Scan-programmet og tilgang overvåkingsdataene ved å klikke Velg inndata.
- Velg riktig skjermserien og velg bin lengde til 10 min intervaller.
- I utskriftsfiltype velge kanal filer. La alle andre alternativer som standard.
- Klikk scan data og lagre til en bestemt mappe.
- Importere data i en circadian dataanalyse programvare for å skaffe teller per min. Merk: For dataanalyse Clocklab programvare er ofte brukt. Andre alternativer er også tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila Sjokk-induced Locomotion Assay
Villtype, Canton-S, fluer viste en robust negativ geotactic respons med bare ca 88% og 5% av fluer i topp og bunn seksjoner henholdsvis av dobbel-hetteglass apparat etter 30 sek (figur 1). Fluer utsatt for 125 m og 250 mikrometer rotenon for tre dager viste en svak nedgang i antall fluer i den øverste delen og svak økning i antall fluer i den nederste delen. Fluer utsatt til 500 mikrometer rotenon viste betydelig feil i negativ geotactic respons (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning) som gjenspeiles av færre fluer i den øverste delen og flere fluer i bunnseksjonen i forhold til å kontrollere fluer (figur 1). Denne defekten i negativ geotactic respons på grunn av manglende evne til å raskt klatre i apparatet er en indikasjon på en defekt i skremme-insert bevegelse.
Drosophila Spontan Locomotion analysen
Villtype, Canton-S, fluer viste 0,57 tellinger per minutt som et mål på spontan mobilitet på den fjerde dag i DAM (figur 2). Fluer som utsettes for 125 uM rotenon viste et lignende nivå av spontan bevegelse. I motsetning til dette, fluer eksponert for 250 uM og 500 uM rotenon viste omtrent 50% lavere tiltak (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning) av spontan bevegelse (figur 2). Disse fluer beveget på ca 0,20 tellinger per minutt, noe som er en indikasjon på en rotenon-induserte feil i spontan bevegelse.
For å veie opp for første avvik (hvis noen) i bevegelse ikke er forårsaket av rotenon eksponering, vi trekkes locomotion data mellom dag 4 og dag 3. Kontroll fluer viste en økning på om lag 0,1 tellinger per minutt i spontaneooss bevegelse mellom dager, mens fluer eksponert for 125 uM rotenon, viste en liten reduksjon på omtrent 0,15 tellinger per minutt (figur 3). Fluer utsatt for 250 m og 500 mikrometer rotenon vises mer alvorlig reduksjon i bevegelse mellom dager, med forskjeller å være cirka 0,3 og 0,5 (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning) teller per minutt hhv. Disse dataene tyder på en mangel i spontan bevegelse over tid med eksponering for rotenon og bekrefter eneste dag analyse nevnt ovenfor - fluer eksponert for høyere doser av rotenon viste en nedgang i spontan bevegelse. Samlet utgjør disse metodene sikker måling av rotenon-indusert mangler i spontan og skremme-indusert bevegelse.
Figur 1. Sjokk-induced locomotion tomt påfluer utsatt for økende doser av rotenon. villtype, Canton-S, ble hannfluer utsatt for forskjellige doser av rotenon i 3 dager og overlevende fluer (8-12) ble deretter tappet inn i bunnen av ampullen dobbelt anordning. Fluer som utsettes for 500 uM rotenon viser en betydelig reduksjon i prosent av fluer i toppen (A) og øker i prosent av fluer i den nedre seksjonen (B) av apparatet etter 30 sek. Dette er et tegn på en mangel på skremmeeffekt på fluer utsatt for rotenon. Søyler representerer gjennomsnittlig prosent av 6 uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning.
Figur 2. Spontan locomotion tomt på fluer utsatt for økende doses av rotenon. villtype, Canton-S, mannlige fluer ble utsatt for ulike doser av rotenon og teller per min på den fjerde dagen etter eksponering ble plottet. Teller ble målt i en dam. Fluer som utsettes for 250 uM og 500 uM rotenon viser en reduksjon i tellinger pr min. Dette er et tegn på en mangel på spontan bevegelse i fluer utsatt for rotenon. Søylene representerer gjennomsnittlig antall pr min på fjerde dagen av fem uavhengige forsøk. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning.
Figur 3. Endring i spontan bevegelse plott av fluer utsatt for økende doser av rotenon. Villtype, Canton-S, ble hannfluer utsatt for forskjellige doser av rotenon og forskjellen i tellinger pr min on den tredje og fjerde dagen etter eksponering ble plottet. Teller ble målt i en dam. Det er en doseavhengig trend for nedgang i spontan bevegelse med fluer utsatt for høyere doser har en mer negativ endring i bevegelse. Dette er et tegn på en reduksjon i bevegelse. Søylene representerer den gjennomsnittlige endringen i bevegelse per minutt av fem uavhengige forsøk. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien beskriver vi to prosedyrer for måling både langsiktig spontan bevegelse og kortsiktig skremme-indusert bevegelse i en rotenon-indusert Drosophila modell av Parkinsons sykdom. Man kan også måle disse locomotion egenskaper i fluer utsatt for andre legemidler som er kjent for å modellere Parkinsons sykdom f.eks, Paraquat 14, genetiske modeller av Parkinsons sykdom f.eks, alfa-synuclein mutanter 15, og andre flue modeller av sykdommer som påvirker bevegelse. For begge metoder, kan alternative fremgangsmåter og modifikasjoner bli vurdert. Fluer kan bedøves ved hjelp av is, noe som kan lindre begrensninger av CO 2 anesthetization for eksempel etterslep i datainnsamling for å la CO 2-effekten slites av.
I skremme-indusert bevegelses analysen, siden fluer viser circadian variasjon i mobilitet, er det viktig å samle inn data på samme tid avdag mellom eksperimenter. Det er også viktig å innføre fluer i testapparatet uten bedøvelse. I motsetning til de fleste skremmeeffekt locomotion analyser, som er avhengige av et øyeblikksbilde av passerer en terskel i en forhåndsbestemt tid 10,11,15,16, vår tilnærming, i likhet med raske iterative negative geotaxis (ring) assay 17,18, overvåker bevegelse ved suksessive flere forekomster for over en tidsperiode. Denne tilnærmingen for kontinuerlig overvåking av fordelingen av fluer i ulike soner kan løse små forskjeller mellom behandlingsgruppene. I tillegg kan vår tilnærming for å beregne prosentandelen av fluer i flere soner av arenaen bidra til å redusere bidraget fra utliggere i dataene.
Vi har også systematisk besluttet ved hvilket tidspunkt punkt å ta data for å sammenligne de behandlingsgruppene. Etter å ha tatt data hver 5 sek i 1 min, vi plottet data og funnet at de mest bemerkelsesverdige forskjeller mellom behandlingene kunne be sett på 30 sek. Etter dette tidspunkt, fluer utsatt for rotenon er i stand til å kompensere for deres bevegelses defekter. Derfor anbefaler vi brukere å optimalisere timingen av datainnsamling til beste løse forskjellene mellom deres kontroll og eksperimentelle sett. Denne fremgangsmåten har også den fordelen av å bestemme relative bevegelsesmangler mellom farmakologiske midler og / eller genetiske modeller. For eksempel kan en mer giftig kjemikalie enn rotenon vise mest bemerkelsesverdige forskjeller tidligere enn 30 sek tidspunkt.
For langtids spontan bevegelse analysen, siden fluer er bedøvet for å innføre dem i rørene, ikke anser data fra første 24 til 48 timer for å tillate den å bære anestesi-off og akklimatisering av fluer i skjermrørene. En annen vurdering for denne analysen er den relative stilling av røret og bevegelsessensoren i DAM, som vi tror kan påvirke den spontane locomotion data. Vi plasserte rør som inneholder fluer på skjermenslik at sensoren var overvåking en tredjedel span av røret lengst borte fra mat og ikke i midten av røret, slik det vanligvis gjøres i tradisjonell bruk av DAM i biologiske studier. Dette tillot oss å undersøke muligheten for fluene å traversere minst to tredjedeler av rørets lengde og førte til mer konsistente data. Det er sannsynlig at aktivitetsnivået kan bli påvirket i rotenon-matet fluer på grunn av bevegelse bursts og / eller rykninger fenotype. Andre mulige konfunderende faktorer for aktiviteten teller kunne være en gustatory og / eller en olfactory aversjon / tiltrekning mot rotenon og andre kjemikalier av interesse for brukeren. Derfor ekstra videosporing 17,19 kan være ansatt for å utfylle demningen data for en grundigere analyse av locomotion fenotype.
I et scenario der eksperimentelle fluer har lignende aktivitet tellinger sammenlignet med kontroll fluer, er det mulig at de skiller seg i det biologiske fordeling av bevegelsen etter fløgner er mer aktive rundt lys av / på og av / på overgang i en 12 timers lys-12 timers mørke syklus. Derfor ville det være nyttig for å bestemme de tellinger pr min ved multiple tidspunkter og bin lengder i en 24-timers periode for å avgjøre den eksakte fordeling av bevegelse. Som konklusjon vil denne analysen, på grunn av sin evne til å vurdere bevegelseskarakteristikker ikke begrenset til bevegelser som reaksjon på skremme, gir ny innsikt i locomotion defekter og karakterisering av utbedrings strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Qiuli Wang, Språk Resource Center, Colby College, for teknisk assistanse med videobehandling og Eric Thomas, Institutt for musikk, Colby College, for å gi bakgrunnsmusikk. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra National Center for Forskning Resources, INBRE (P20RR016463-12), Statens institutt for General Medical Sciences (P20 GM103423-12), Nationals Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL og LWM ble støttet med tilskudd fra Summer Scholar Fund, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
- Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
- Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
- Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
- St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
- Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
- Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640 (2011).
- Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
- Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
- Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
- Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).
