Summary
파킨슨 병은 운동력 결함을 일으키는 중추 신경계의 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 로테 논 모델 초파리 파킨슨 병. 이 논문은 로테 논으로 인한 자연 및 놀라게 유도 모두 운동 부족의 특성이 분석을 간략하게 설명합니다.
Abstract
파킨슨 병은 주로 흑질에서, 중추 신경계에서 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 질병은 인간의 강성, 떨림과 치매로 제시 모터 결함을 발생합니다. 로테 논은 미토콘드리아의 전자 전달계의 기능을 억제함으로써 산화 적 손상을 일으키는 살충제. 또한 초파리 파킨슨 병을 모델링하기 위해 사용된다. 파리 그들을 놀라게되는시 위쪽으로 올라 강요 고유의 부정적인 geotactic 응답을 가지고있다. 그것은 로테 논들이 아래쪽으로 도청 한 후 상승 할 수있는 파리의 능력을 방해 조기 사망률과 운동 결함을 유발한다는 설립되었습니다. 그러나, 자발적인 움직임에 로테 논의 효과는 잘 설명되지 않는다. 이 연구에서 로테 논에 의한 결함의 특성을이 민감한 재현성, 높은 처리량 분석을 설명단기 초파리 운동 및 장기 자발적인 운동을 놀라게은 유도. 이러한 분석법은 편리 운동력 결함 치료제의 효능을 다른 초파리 모델을 특성화하도록 구성 될 수있다.
Introduction
운동력 결핍은 파킨슨 병의 주요 증상이며 크게 흑색질 (1)의 도파민 뉴런의 열화에 의해 야기된다. 로테 논은 초파리 2-6 파킨슨 모터 적자를 모델로 광범위하게 연구 된 케톤 살충제입니다. 로테 논은 궁극적으로 세포의 죽음 (7)의 원인이되는 산화 적 인산화 경로를 차단하여 산화 적 손상이 발생합니다. 도파민 뉴런은 주로 모터 2,7 기반 화학 물질의 효과를 만들고, 로테 논 독성에 더 쉽다. 파리에서 파킨슨 병 증상을 유도함으로써, 우리는 더 나은 질병을 이해하고 6,8-11이. 초파리들이 유지 보수가 용이, 유전자 취급 용이하기 때문에 이러한 효과를 연구하기위한 좋은 모델을 제공 증상을 개선하고 급속한 수명을 가질 수있다.
몇몇 연구 로테 논 단기 놀라게 유도 일으키는 것으로 나타났다초파리 언제 파리에서 운동 결함 로테 논 - 보충 식품에서 유지, 그들은 놀람 2-6 후 느린 부정적인 geotactic 응답을 보여줍니다. 컨트롤 실험 빨리 바이알 장치에서 위쪽으로 오르는 그들의 실패 놀라게 유도 운동력 결함을 나타낸다.
장기간에 로테 논의 효과는, 자발 운동은 잘 초파리 활동 모니터 (댐)이 성공적 초파리 생체 리듬 운동을 모니터링하는데 사용되어왔다. 설명 12,13 연구되지 않는다. 파리는 DAM에로드 된 각각의 튜브에 배치됩니다. 이 장치는 비행 적외선 빔을 중단 횟수를 카운트 적외선 센서가 장착된다. 이 카운트는 교란 운동 및 활동 12,13의 척도로 사용될 수있다. DAM에 파리를 배치하여 자신의 장기 운동에 로테 논의 효과가 특징으로 할 수있다. 이 연구는 MEAS에 대한 방법을 설명합니다URE 단기 나은 로테 논 매개 모터 결함의 영향을 이해하기 위해 운동과 장기 자발 운동 놀라게는 유도. 그들이이 운동 결함을 반대 할 수있는 다른 화합물의 연구를 위해 수 있기 때문에 파킨슨 병을 흉내 낸 운동 부족의 특성이 중요하다.
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Protocol
1 초파리 놀라게 유도 로코의 분석
- 약물 치료
- 원하는 번호를 고정화하는 차분한 (약 8 ~ 12) 1-3 일 된 남성 CO 2를 사용하여 약물이 첨가 된 음식을 포함하는 유리 병에 수송 파리. 참고 : 또 다른 마취 예를 들면, 에테르, 얼음 계산 및 처리를 가능하게하기 위해 파리를 마취하는 데 사용할 수 있습니다.
- 25 ° C에서 파리 (파리를 방지하기 위해 식품에 갇히지) 수평으로 유리 병 20 분 (또는 복구까지)에 대한 진정을 복구 한 후 12 시간 어둠 속에서 똑바로 유리 병을 배치 할 수 있도록 허용, 12 시간 빛 인큐베이터 실험의 나머지.
- 실험 세트 최대
- 영구 마커 튜브 주위에 원을 표시하여 6.33 cm의 세 동일한 섹션으로이 두 병 설정을 나눈다.
- 약물 노출 3 일 후에, 전송은 바이알 바닥에 마취없이 빠르게 날아 가기 바이알을 놓고입구에. 분명 테이프와 함께 병을 두 개 테이프입니다.
- 파리 15 분 동안 새로운 환경에 적응할 수 있도록해야합니다.
- 장소 흰색 배경에 튜브 및보기에 타이머 이중 유리 병 장치로부터 적절한 거리에 디지털 카메라를 설정합니다. 장치 전체가 하나의 액자에 표시됩니다 확인하고 모든 파리는 초점이있다. 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 프레임들, 카메라 및 바이알의 위치를 표시한다.
- 모바일 분석
- 분명히 카메라 뷰에서 재판 번호, 약물 치료, 그리고 타이머를 표시합니다.
- 단단히 카운터에 세 번 두 번 유리 병 장치를 누르고 모든 파리는 유리 병의 바닥에 떨어질 있는지 확인합니다. 동시에 타이머를 시작합니다.
- 매 5 초마다 1 분 동안, 장치의 사진을 촬영. 참고 : 또는 비디오 캡처 및 측정을위한 적절한 간격으로 일시 중지 될 수있다.
- 파리 1 분 동안 방해받지 않고 복구 할 수 있습니다.
- 데이터 분석
- 사진을 검토하고 시간이 지남에 따라 각 섹션에서 파리의 수를 기록한다. 시간이 지남에 따라 각 섹션에서 파리의 비율을 계산합니다. 주 : 예를 들어, 일 3, 5에 대한 관심이 또는 세 시점에서 같은 파리이 전체 절차를 반복하고, 너무 많은 파리를 보상하기 위해 원래 시험 수를 확장하는 것이 가능 실험을하는 동안 죽을 7 경우 사망률. 데이터를 비교하기 위해 적절한 통계 분석을 사용합니다.
2 초파리 자발적 로코의 분석
- 음식 준비
- 탈 이온수 15 ml의 물과 함께 원하는 로테 논 인스턴트 초파리 배지 3g 재구성(또는 관심의 다른 약물) 복용.
- 식품 혼합물 회사 (약 5 분)가되면, 조심스럽게 제조 업체에 높은 약 1cm 투명 튜브 (5mm X 65mm)를 공급하는 음식을로드합니다. 조심스럽게 음식을 수직으로 튜브를 삽입하고이 관 내부의 음식을 제거 할 수 있습니다 때까지를 왜곡하여 튜브로 음식을 주입 약물을 추가합니다. 참고 : 진공을 만들기 위해 튜브의 구멍에 손가락을 배치하는 것이 도움이된다. 음식은 공기 방울을 포함하거나 파리가 붙어 될 수 요철이 없어야합니다.
- 실험 설정
- 음식 가까운 튜브의 끝 부분에 플라스틱 캡을 배치합니다. 강제로 푸시 경우가 바이알에 기포를 생성 할 수 있기 때문에, 가능한 한 작은 플라스틱 튜브에 캡을 밀어.
- 침착 한 일일 세 남자는 CO 2를 사용하여 조심스럽게 한 남성이 페인트 브러시와 각 튜브에 비행 삽입 날아갑니다. 원하는 시험의 수에 따라 반복한다.
- 연결손 큰 상점에서 롤백 할 수있는 작은 목화 공을 가진 음식에서 튜브 먼의 끝은 면봉을 샀다.
- 파리 15 분간 수평으로 튜브 복구하고 모든 파리가 살아 있고 활성화되어 있는지 확인 할 수 있습니다. DAM에 튜브를 삽입하고 모든 튜브 댐 같은 상대적인 위치에 있는지 확인하십시오. 주 : 바이알의 중간에 모니터링 영역으로 이들을 배치, 또는 튜브의 단부가 모니터링되고, 그래서 측으로 모든 튜브를 밀어하는 것이 가능하다. 참고 :이 방법에 변화를 설명을 참조하십시오.
- 데이터 수집
- 12 시간 어둠 속에서 DAM을 배치, 12 시간 빛 인큐베이터는 25 ° C로 설정합니다. 데이터 수집 시스템에 DAM을 연결합니다. DAM 소프트웨어를 열고 환경 설정을 선택 빈 길이에 따라 10 분에. 데이터 수집을 시작하고 프로그램이 칠일에 대한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 주 : 필요한 경우 빈 길이를 조정할 수있다.
- 데이터 분석
참고 : 프로세스데이터는 장기 자발 운동을위한 수단으로 분당 카운트를 얻었다.- 선택 입력 데이터를 클릭하여 열기 DAM 파일 스캔 프로그램 및 액세스 모니터 데이터입니다.
- 해당 모니터 범위를 선택하고 10 분 간격으로 빈 길이를 선택합니다.
- 출력 파일 형식에서 채널 파일을 선택합니다. 기본적으로 다른 모든 옵션을 둡니다.
- 스캔 데이터를 클릭하고 지정된 폴더에 저장합니다.
- 생체 데이터 분석 소프트웨어의 데이터 가져 오기가 분당 카운트를 얻었다. 참고 : 데이터 분석 Clocklab 소프트웨어는 일반적으로 사용하십시오. 다른 옵션도 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
초파리 놀라게 유도 로코의 분석
야생형, 캔톤-S는, 파리는 30 초 (도 1) 이후 두 번 바이알 장치의 각각 단지 약 88 % 및 상부 및 하부 부분에있는 파리의 5 %와 강력한 geotactic 부정적인 반응을 보였다. 125 μM 3 일간 250 μM의 로테 노출 파리 상부 섹션 및 하부 섹션 파리의 수가 약간 증가 파리의 수가 약간 감소 하였다. 500 μM의 로테 논에 노출 파리는 파리 (그림 1)를 제어에 비해 바닥 부분에서 상단 부분에 적은 수의 파리보다 파리에 의해 입증 부정적인 geotactic 응답 하였다 (p <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교)에 중요한 결함을 보여 주었다. 때문에 신속하게 장치에 오를 수 없다는 부정적인 geotactic 응답이 결함은 놀람 인에서 결함을 나타낸다하였으므로 운동력.
초파리 자발적 로코의 분석
야생형은 광저우-S는, 파리는 DAM의 넷째 날에 자연 이동성의 척도로 (그림 2) 분 당 0.57 카운트를 보여 주었다. 125 μM의 로테 노출 파리 자발 운동 비슷한 수준을 나타내었다. 대조적으로, 250 μM에 노출 및 500 μM 로테 논은 약 50 % 낮은 조치 자발적인 운동의 (p <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교) (그림 2)을 보여 주었다 파리. 이러한 파리 자발 운동에 로테 논 - 유도 결함을 나타낸다 분당 약 0.20 카운트에 옮겼다.
로테 노출에 의해 야기되지 운동력의 초기 불일치 (있는 경우)을 설명하기 위해, 우리는 4 일 및 3 일 제어 날아간 사이 운동력 데이터를 감산하는 spontaneo 분당 약 0.1 카운트의 증가를 보였다파리 125 μM 로테 논에 노출 분당 약 0.15 카운트 (그림 3)의 약간의 감소를 전시하면서 우리는 일 사이에 운동. 250 μM 및 500 μM 로테 논에 노출 파리는 차이가 약 0.3 및 0.5 인으로, 일 사이에 운동에 더 심각한 감소를 표시 하였다 (p <0.05 ANOVA는 페로 니 쌍의 현명한 비교)은 각각 분당 계산합니다. 이 데이터는 로테 논에 노출되는 시간이 지남에 따라 자발 운동 결핍을 제안하고 위에서 언급 한 일 분석 확인 - 로테 논의 높은 투여 량에 노출 된 파리 자발 운동 감소를 보였다. 함께 찍은, 이러한 방법은 안정적으로 자연에 로테 논에 의한 결함을 측정하고 놀라게 유도 운동을.
1. 놀라게 유도 운동 플롯을 그림로테의 복용량을 증가 노출 파리. 야생형, 캔톤-S는, 남성이 날아간 3 일 생존 파리 (8-12)에 대한 상이한 투여 로테 논에 노출 된 후 두 바이알 장치의 하부에 두드려 하였다. 500 μM로 노출 로테 논 파리 상단 (A)에있는 파리의 퍼센트에서 유의 한 감소를 표시하고 30 초 후에있어서의 바닥 부 (B)에있는 파리의 퍼센트 증가. 이것은 로테 노출 초파리 놀라게 응답 결핍을 나타낸다. 열 여섯 독립적 인 실험의 평균 비율을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다; * P <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교.
파리의 그림 2 자발적인 운동 플롯은 증가 복용량에 노출노출이 플롯 한 후 로테 논. 야생 유형, 광저우-S의 S는 남성 파리는 넷째 날에 분당 다른 로테 논의 투여 량 및 횟수에 노출되었다. 카운트는 DAM 측정 하였다. 250 μM 및 500 μM 로테 논에 노출 파리는 분당 카운트의 감소를 보여줍니다. 이것은 로테 노출 초파리에서 자발 운동 결핍을 나타낸다. 열 다섯 독립적 인 임상 시험의 넷째 날에 분 당 평균 수를 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다; * P <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교.
로테의 투여 량 증가에 노출 파리의 자발적인 운동 곡선의 그림 변경하십시오. 야생 유형, 광저우-S는 남성 파리는 다른 로테 논의 투여 량 및 분 오 당 계수의 차이에 노출 된n은 노출 후 세 번째와 네 번째 날 플롯 하였다. 카운트는 DAM 측정 하였다. 운동에 더 부정적인 변화를 갖는 고용량에 노출 파리와 자발적 운동의 감소에 대한 농도 의존적 경향이있다. 이 운동의 감소를 나타낸다. 열 다섯 독립적 인 임상 시험의 분 당 운동의 평균 변화를 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다; * P <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교.
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Discussion
본 연구에서는 파킨슨 병 로테 논 유도 초파리 모델에서 장기 자발 운동 단기 놀라게 유도 운동 모두를 측정하기위한 두 가지 방법을 설명한다. 하나는 또한 파킨슨 질환 등을 모델링하는 것으로 알려진 기타 약리학 적 제제, 파라콰트 14, 파킨슨 씨병 등의 유전 모델, 알파 - 시누 클레인 돌연변이 체 (15), 및 운동에 영향을주는 질환의 다른 플라이 모델에 노출 날아간 이러한 운동 특성을 측정 할 수있다. 두 방법 모두 대체 방법 및 수정이 고려 될 수있다. 파리는 CO 2 효과는 벗겨 수 있도록 데이터 수집 예를 지연에 대한 CO 2 마취의 제한을 완화 할 수 얼음을 사용하여 마취 할 수 있습니다.
파리 이동도 편차를 보여 주기성 때문에 놀라게 유도 식 이동 분석법에서, 그것의 데이터를 동시에 수집하는 것이 중요실험 사이의 일. 그것은 마취없이 시험 장치에 파리를 소개하는 것도 중요합니다. 시간 10,11,15,16의 소정 금액에 임계 값을 전달하는 스냅 샷에 의존하는 대부분의 놀라게 응답 운동력 분석, 달리, 빠른 반복 부정적인 geotaxis (RING) 분석 (17, 18)과 유사한 우리의 접근 방식은, 모니터 일정 기간 동안 연속적인 여러 인스턴스에서 운동. 서로 다른 영역에서 파리의 분포를 지속적으로 모니터링이 방법은 치료 그룹 사이의 미묘한 차이를 해결할 수 있습니다. 또한, 경기장의 여러 영역에서 파리의 비율을 계산하는 우리의 접근 방식은 데이터에서 특이점의 기여를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
우리는 또한 체계적으로 치료 그룹을 비교하는 데이터를 가지고있는 시간이 시점에서 결정했다. 1 분 동안 데이터마다 5 초를 복용 후, 우리는 데이터를 플로팅 치료의 가장 주목할만한 차이가 ㄱ 수 있다는 것을 발견전자는 30 초에서 본. 이 시점 이후, 로테 논 노출 초파리는 전위 결함을 보상 할 수있다. 그러므로 우리는 가장 잘 제어 및 실험 세트 사이의 차이를 해결하기 위해 데이터 수집의 타이밍을 최적화하기 위해 사용자를 권장합니다. 이 접근법은 또한 약학 제제 및 / 또는 유전 모델 간의 상대 전위의 결함을 판정하는 이점을 갖는다. 예를 들어, 로테 논보다 더 많은 독성 화학 물질이 30 초 시점 이전의 가장 주목할만한 차이를 표시 할 수 있습니다.
파리는 튜브를 소개 마취 때문에 장기 자발적인 운동 분석의 경우, 착용 오프 모니터 튜브 파리와 순응 할 수있는 마취 수 있도록 첫번째 24 ~ 48 시간의 데이터를 고려하지 않습니다. 이 분석을위한 다른 고려 튜브 우리가 자발적인 운동 데이터에 영향을 줄 수 있다고 생각 DAM에서 모션 센서의 상대적인 위치이다. 우리는 모니터에 파리가 들어있는 튜브를 배치일반적으로 생체 연구 DAM의 전통적인 사용 에서처럼 매우 센서는 음식과하지에서 관의 중간 부분을 상기 튜브의 먼 1/3 스팬을 모니터링되었다. 이는 튜브의 길이의 적어도 3 분의 2를 통과하는 파리의 능력을 조사하라고 허용하고보다 일관된 데이터로 이어졌다. 그것은 활동 카운트 인해 이동 버스트 및 / 또는 꿈틀 표현형 로테 논 - 공급 파리에 영향을받을 수있는 가능성이있다. 활성 카운트위한 다른 가능한 교란 요인 미각 및 / 또는 로테 논 및 사용자가 관심을 다른 화학 향해 후각 혐오 / 매력 수 있었다. 따라서 추가 비디오 추적 17,19은 운동력 표현형의보다 철저한 분석 DAM 데이터를 보완하기 위해 이용 될 수있다.
제어 파리에 비해 실험 파리 유사한 활성 카운트가 시나리오에서는 그들이 F 보낸 운동의 생체 분포에 따라 다를 가능성이있다거짓말은 12 시간 빛을 12 시간 어두운 사이클의 전환에 / 온 / 오프 빛 주위에 오프 더 활성화됩니다. 따라서, 운동의 정확한 분배를 결정하기 위해 24 시간 동안의 시점과 길이 여러 빈에서 분당 카운트를 결정하는데 도움이 될 것이다. 결론적으로,하지 놀라게 응답하여 움직임에 한정 움직임 특성을 평가할 수있는 능력으로 인해이 분석은, 운동력 결함 및 치료 전략의 특성화에 새로운 통찰력을 제공 할 것이다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 배경 음악을 제공하기 위해, 비디오 처리 및 에릭 토마스, 음악학과, 콜비 대학과 기술 지원을, Qiuli 왕, 언어 리소스 센터, 콜비 대학에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트는 연구 자료, INBRE을위한 국가 센터 (P20RR016463-12), 일반 의료 과학 국립 연구소 (P20의 GM103423-12)에서 보조금에 의해 지원되었다, 보건 및 과학 사업부 그랜트, 콜비 대학 (STA)의 국민 연구소. JL과 LWM 여름 학술 기금, 콜비 대학에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
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