Summary
Parkinsons sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som orsakas av degeneration av dopaminerga neuroner i det centrala nervsystemet, vilket orsakar locomotion defekter. Rotenon modeller Parkinsons sjukdom i Drosophila. Detta dokument beskriver två analyser som kännetecknar både spontana och skrämma-inducerade locomotion brister orsakade av rotenon.
Abstract
Parkinsons sjukdom är en neurodegenerativ sjukdom som orsakas av degenerering av dopaminerga neuroner i det centrala nervsystemet, främst i substantia nigra. Sjukdomen orsakar motoriska brister, varav framgår som stelhet, skakningar och demens hos människor. Rotenon är en insekticid som orsakar oxidativ skada genom att hämma funktionen av elektrontransportkedjan i mitokondrier. Det används också för att modellera Parkinsons sjukdom i Drosophila. Flugor har en inneboende negativ geotactic respons, vilket tvingar dem att klättra uppåt efter att ha blivit skrämd. Det har fastställts att rotenon orsakar tidig dödlighet och locomotion defekter som stör flugorna förmåga att klättra efter att de har tryckt ned. Däremot är effekten av rotenon på spontan rörelse inte väl dokumenterat. Denna studie beskriver två känsliga, reproducerbara och hög genomströmning analyser för att karaktärisera rotenon-inducerad brister ikortsiktig startle-inducerad förflyttning och långsiktig spontan rörelse i Drosophila. Dessa analyser kan enkelt anpassas för att karakterisera andra Drosophila modeller av locomotion defekter och effekt av läkemedel.
Introduction
Locomotion brister är en stor symptom på Parkinsons sjukdom och är till stor del orsakas av försämring av dopaminerga neuroner i substantia nigra 1. Rotenon är en ketonisk insekticid som har studerats ingående för att modellera Parkinsons motoriken i Drosophila 2-6. Rotenon förorsakar oxidativ skada genom att blockera den oxidativa fosforyleringsväg, vilket i slutändan leder celldöd 7. Dopaminerga nervceller är mer benägna att rotenon toxicitet, vilket gör effekten av den kemiska främst motor baserad 2,7. Genom att framkalla symtom på Parkinsons sjukdom i flugor, kan vi bättre förstå sjukdomen och åtgärda dess symtom 6,8-11. Drosophila ger en bra modell för att studera denna effekt eftersom de är genetiskt lätthanterlig, lätt att underhålla, och har en snabb livscykel.
Flera studier har visat att rotenon orsakar kortvarig startle-induceradlocomotion defekter i Drosophila -när flugor bibehålls på rotenon-kompletterad mat, de visar en långsammare negativ geotactic svar efter spritta 2-6. Deras misslyckande att klättra uppåt i en injektionsflaska apparat så snabbt som kontrollförsök tyder på skrämma-inducerad locomotion defekter.
Effekten av rotenon på långsiktig, är spontan rörelse inte väl beskrivna. Drosophila aktivitetsmonitorer (dammar) har med framgång använts för att övervaka rörelse i Drosophila dygnsrytmen studerar 12,13. Flugor är placerade i enskilda rör, som laddas in i DAM. Denna apparat är utrustad med en infraröd sensor, som räknar antalet gånger en fluga bryter den infraröda strålen. Dessa räkningar kan användas som ett mått på ostörd förflyttning och aktivitet 12,13. Genom att placera flugor i en damm, kan effekten av rotenon på deras långsiktiga rörelse karaktäriseras. Denna studie beskriver metoder för measure kortsiktig startle-inducerad förflyttning och långsiktig spontan rörelseförmåga i syfte att bättre förstå effekterna av rotenon medierad motoriska brister. Karakterisering av locomotion brister härmar Parkinsons sjukdom är viktiga eftersom de möjliggör för studier av andra föreningar som kan vända dessa locomotion defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila startle-inducerad Locomotion Assay
- Läkemedelsbehandling
- Sedate att immobilisera önskade antalet (cirka 8-12) av 1-3 dagar gamla manliga flugor använder CO 2 och transportera dem till ampuller innehållande den läkemedels kompletteras livsmedel. Anm: Ett annat narkos t.ex. eter eller is kan användas för att söva flugor för att räkna och hantering.
- Låt flugor för att återhämta sig från sedering under 20 minuter (eller tills återhämtning) med flaskan i ett horisontellt läge (för att undvika flugor fastnar på mat) och sedan placera flaskan upprätt i en 12 tim mörker, 12 h ljus inkubator vid 25 ° C under återstoden av experimentet.
- Experimentell Set Up
- Dela denna dubbla flaskan inställning i tre lika stora sektioner av 6,33 cm genom att markera cirklar runt flaskorna med en märkpenna.
- Efter 3 dagars läkemedelsexponering, flugor överföring utan anestetisering i botten flaskan och snabbt placera den övre flaskanöver öppningen. Tejpa de två flaskorna tillsammans med genomskinlig tejp.
- Låt flugor för att anpassa sig till den nya miljön i 15 min.
- Placera flaskor på en vit bakgrund och inrätta en digitalkamera på lämpligt avstånd från den dubbla flaskan apparaten med en timer i sikte. Se till att hela apparaten är synlig i en enda bildram och att alla flugor är i fokus. För att upprätthålla konsekventa ramar mellan försöken, markera platsen för kameran och flaskan.
- Rörlighet Assay
- Tydligt visa rättegången nummer, läkemedelsbehandling och timer i kameravyn.
- Knacka dubbla flaskan apparaten mot bänkskivan 3 gånger och se till att alla flugor faller till botten av flaskan. Samtidigt startar timern.
- Varje 5 sek i 1 min, ta en bild av apparaten. Anm: Alternativt kan en video fångas och pausas med lämpliga intervall för mätningar.
- Låt flugor att återvinna ostört under 1 min.
- Dataanalys
- Granska bilder och registrera antalet flugor i varje avsnitt med tiden. Beräkna procentandelen av flugor i varje avsnitt med tiden. Anteckningar: Upprepa hela proceduren med samma flugor på 2 eller 3 sevärdheter tid, till exempel, dag 3, 5 och 7 Om för många flugor dör under experimentet är det möjligt att skala upp den ursprungliga rättegången numret för att kompensera för dödlighet. Använd lämplig statistisk analys för att jämföra uppgifterna.
2. Drosophila Spontan Locomotion analys
- Typ av mat
- Rekonstituera 3 g av instant Drosophila-medium med 15 ml avjoniserat vatten och önskad rotenon(Eller annat läkemedel av intresse) dosering.
- När maten blandningen har blivit fast (ca 5 min), försiktigt fylla på livsmedel vara ca 1 cm höga i tillverkarens medföljande transparenta rör (5 mm x 65 mm). Lägg läkemedlet infunderas mat till rören genom att försiktigt placera rören vertikalt i maten och vrida dem tills de kan tas bort med maten inuti röret. Obs: Det är bra att placera ett finger på öppningen av röret för att skapa ett vakuum. Mat ska inte innehålla några luftbubblor eller har en ojämn yta som flugorna kan fastna.
- Experimental Setup
- Placera en plastlock på änden av röret närmast maten. Skjut plastlocket på tuben så lite som möjligt, eftersom det kan skapa en luftbubbla i ampullen om skjuts till med kraft.
- Stillsam 1 dag gammal man flyger med hjälp av CO2 och försiktigt in 1 hane flyga i varje rör med en pensel. Upprepa beroende på antalet önskade prövningar.
- Anslutänden av röret längst bort från mat med en liten bomullstuss, som kan handsydd från större butik köpte bomullstussar.
- Låt flugor att återhämta sig med rören i horisontellt läge i 15 minuter och se till att alla flugor är levande och aktiv. Sätt i rören i DAM och se till att alla rör är i samma position i förhållande till DAM. Notera: Det är möjligt att placera dem med området övervakning vid mitten av flaskan, eller att driva alla flaskorna åt sidan, så att änden av röret övervakas. OBS: Se diskussionen om variationer på denna metod.
- Datainsamling
- Placera DAM i en 12 tim mörker, 12 h ljus inkubator inställd på 25 ° C. Anslut DAM till datainsamlingssystemet. Öppna DAM programvara och under inställningar väljer bin längd till 10 minuter. Starta datainsamling och låta programmet att samla in data i 7 dagar. Obs: Bin längd kan justeras vid behov.
- Dataanalys
Obs: Processdata för att erhålla pulstal per minut som en åtgärd för långsiktig spontan rörelse.- Öppna DAM fil scan program och tillgång övervaka data genom att klicka på Välj indata.
- Välj lämplig skärmsortiment och välj bin längd till 10 minuters intervall.
- I utgångs filtyp väljer kanalfiler. Låt alla andra alternativ som standard.
- Klicka skanningsdata och spara till en angiven mapp.
- Importera data i en dygnsrytm dataanalys programvara för att få räknas per min. Obs: För dataanalys Clocklab programvara används ofta. Andra alternativ finns också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila startle-inducerad Locomotion Assay
Vildtyp, canton-S, flugor visade en robust negativ geotactic svar med endast ca 88% och 5% av flugor i de övre och nedre sektionerna respektive av den dubbel flaskan apparat efter 30 sek (Figur 1). Flugor som exponerats för 125 iM och 250 ^ M rotenon i 3 dagar uppvisade en svag minskning av antalet flugor i den övre delen och viss ökning av antalet flugor i den nedre delen. Flugor som exponerats för 500 iM rotenon visade signifikant defekt nekande geotactic svar (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse) vilket framgår av färre flugor i den övre delen och fler flugor i underdelen jämfört med kontroll flugor (Figur 1). Denna brist i negativt geotactic svar på grund av oförmåga att snabbt klättra i apparaten indikerar en defekt i skrämsel-inproduceras locomotion.
Drosophila Spontan Locomotion-analys
Vildtyp, canton-S, flugor visade 0.57 impulser per minut som ett mått på spontan rörlighet på den fjärde dagen i DAM (Figur 2). Flugor som exponerats för 125 iM rotenon visade en liknande nivå av spontan rörelse. Däremot, flugor exponerades för 250 pM och 500 pM rotenon visade cirka 50% lägre åtgärder (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse) av spontan rörelse (figur 2). Dessa flugor förflyttas vid cirka 0,20 impulser per minut, vilket är indikativt för en rotenon-inducerad defekt i spontan rörelseförmåga.
För att ta hänsyn till initiala avvikelser (om någon) i rörelse som inte orsakats av rotenon exponering, dras vi locomotion data mellan dag 4 och dag 3. Kontroll flugor visade en ökning på ca 0,1 impulser per minut i spontaneooss Locomotion mellan dagar, medan flugor exponerades för 125 iM rotenon uppvisade en liten minskning på ca 0,15 pulser per minut (Figur 3). Flugor som exponerats för 250 | iM och 500 ^ iM rotenon visas mer allvarliga minskningar i locomotion mellan dagarna, med skillnaderna att vara ungefär 0,3 och 0,5 (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse) räknas per minut respektive. Dessa data tyder på en brist i spontan rörelse över tiden med exponering för rotenon och bekräftar enda dag analys som redovisas ovan - flugor som utsätts för högre doser av rotenon visade en minskning i spontan rörelse. Sammantaget dessa metoder på ett tillförlitligt sätt mäta rotenon-inducerad brister spontant och skrämma-inducerad förflyttning.
Figur 1. startle-inducerad locomotion plot avflugor som exponerats för ökande doser av rotenon. Vildtyp, Canton-S, var manliga flugor exponerades för olika doser av rotenon för 3 dagar och överlevande flugor (8-12) var sedan tappas in i botten av den dubbla flaskan apparaten. Flugor som exponerats för 500 pM rotenon visar en signifikant minskning i procent av flugor i den övre (A) och ökar i procent av flugor i bottensektionen (B) av anordningen efter 30 sek. Detta är indikativ för en brist i skrämselreaktion i flugor som exponerats för rotenon. Kolumnerna representerar den genomsnittliga andelen 6 oberoende experiment. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse.
Figur 2. Spontan locomotion plot av flugor exponerades för ökande doss av rotenon. Wild typ, canton-S, var manliga flugor utsatta för olika doser av rotenon och räkningar per minut på den fjärde dagen efter exponering avsattes. Räknar mättes i en damm. Flugor som exponerats för 250 | iM och 500 ^ iM rotenon visar en minskning i pulser per minut. Detta är indikativ för en brist i spontan rörelseförmåga i flugor som exponerats för rotenon. Kolumnerna representerar de genomsnittliga impulser per minut på fjärde dagen av fem oberoende studier. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse.
Figur 3 Förändring av spontan rörelse plot av flugor som exponerats för ökande doser av rotenon. Vildtyp, Canton-S, var manliga flugor exponerades för olika doser av rotenon och skillnaden i impulser per min on den tredje och fjärde dagen efter exponering plottades. Räknar mättes i en damm. Det finns en dosberoende trend för minskning av spontan rörelse med flugor som utsätts för högre doser har en mer negativ förändring i förflyttning. Detta är ett tecken på en minskning i rörelse. Kolumnerna representerar den genomsnittliga förändringen av rörelse per minut av fem oberoende studier. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis jämförelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskriver vi två förfaranden för mätning av både långfristiga spontan rörelse och korttids startle-inducerad förflyttning i en rotenon-inducerade Drosophila modell av Parkinsons sjukdom. Man kan även mäta dessa locomotion egenskaper i flugor som utsätts för andra läkemedel som man vet att modellera Parkinsons sjukdom t ex, parakvat 14 genetiska modeller av Parkinsons sjukdom t ex alfa-synuklein mutanter 15, och andra flyga modeller av sjukdomar som påverkar rörelse. För båda metoderna, kan alternativa metoder och modifieringar övervägas. Flugor kan bedövas med hjälp av is, vilket skulle kunna lindra begränsningar CO2 anesthetization exempelvis eftersläpning i datainsamling för att låta CO2 effekten avklinga.
I spritta-inducerad rörelseanalys, eftersom flugor visar dygnsrytm variation i rörlighet är det viktigt att samla in data vid samma tidpunktdag mellan experimenten. Det är också viktigt att införa flugor in i testapparaten utan anestesi. I motsats till de flesta skrämselreaktion locomotion analyser, som förlitar sig på en ögonblicksbild av passerande en tröskel i en förutbestämd mängd tid 10,11,15,16, vårt tillvägagångssätt, liknande snabba iterativa negativa geotaxis (ring)-analys 17,18, övervakar rörelse vid successiva flera instanser under en tidsperiod. Detta tillvägagångssätt för kontinuerlig övervakning av fördelningen av flugor i olika zoner kan lösa små skillnader mellan behandlingsgrupperna. Dessutom kan vår metod för att beräkna den procentuella andelen av flugor i multipla zoner av arenan hjälpa till att minimera bidraget av extremvärden i data.
Vi också systematiskt beslutas vid vilken tidpunkt för att ta data för att jämföra behandlingsgrupper. Efter att ha tagit uppgifter var 5 sek i 1 min, plottade vi data och fann att de mest anmärkningsvärda skillnader mellan behandlingarna kunde be ses vid 30 sek. Efter denna tidpunkt, flugor som exponerats för rotenon har möjlighet att kompensera för att de motoriska defekter. Därför rekommenderar vi användarna att optimera tidpunkten för datainsamling för att bäst lösa skillnaderna mellan deras kontroll och experimentella uppsättningar. Detta tillvägagångssätt har också den fördelen att bestämma relativa rörelseapparaten brister mellan farmakologiska medel och / eller genetiska modeller. Till exempel kan en mer giftig kemikalie än rotenon visar mest anmärkningsvärda skillnader tidigare än 30 sek tidpunkt.
För den långsiktiga spontana rörelseanalys, eftersom flugor är sövd att introducera dem i rören, anser inte data från första 24-48 tim för att möjliggöra anestesi att bära start och acklimatisering av flugor i monitorrören. Ett annat övervägande för denna analys är det relativa läget av röret och rörelsesensorn i DAM, vilken vi tror kan påverka de spontana locomotion data. Vi placerade rören innehållande flugor i monitornså att givaren var att övervaka en tredjedel spann av röret längst bort från maten och inte i mitten av röret som görs oftast i traditionella användningen av DAM i dygnsrytm studier. Detta tillät oss att undersöka möjligheten för flugorna att färdas minst två tredjedelar av rörets längd och lett till mer konsekventa data. Det är troligt att de aktivitetsräkningar kan påverkas i rotenon matade flugor på grund av rörelse skurar och / eller ryckningar fenotyp. Andra möjliga felkällor för aktivitetsräkningar kan vara en smak och / eller ett lukt motvilja / attraktion till rotenon och andra kemikalier av intresse för användaren. Därför extra spårning video 17,19 kan användas för att komplettera DAM uppgifter för en mer noggrann analys av rörelse fenotypen.
I ett scenario där experimentella flugor har liknande aktivitetsräkningar jämfört med kontroll flugor, är det möjligt att de skiljer sig i den cirkadiska fördelning av rörelse eftersom flögner är mer aktiva kring ljus på / av och av / på övergång i en ljus-12 tim mörker-cykel 12 tim. Därför skulle det vara bra att bestämma pulser per minut vid flera tidpunkter och sopp längder i en 24-timmarsperiod för att fastställa den exakta fördelningen av förflyttning. Sammanfattningsvis kommer denna analys, på grund av dess förmåga att bedöma rörelseegenskaper inte begränsat till rörelser som svar att skrämma, ge nya insikter i locomotion defekter och karakterisering av korrigerande strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Qiuli Wang, Language Resource Center, Colby College, för tekniskt bistånd med videobearbetning och Eric Thomas, institutionen för musik, Colby College, för att ge bakgrundsmusik. Projektet har finansierats med bidrag från National Center for Research Resources, INBRE (P20RR016463-12), Institutet för General Medical Sciences (P20 GM103423-12), Nationals Institutes of Health och Science Division Grant, Colby College (STA). JL och LWM stöddes av bidrag från Summer Scholar Fund, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
- Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
- Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
- Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
- St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
- Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
- Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640 (2011).
- Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
- Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
- Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
- Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).
