Summary
Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der resulterer fra degenerering af dopaminerge neuroner i centralnervesystemet, der forårsager bevægelseskomponenter defekter. Rotenon modeller Parkinsons sygdom i Drosophila. Dette papir beskriver to analyser, der kendetegner både spontane og startle-inducerede bevægelseskomponenter mangler forårsaget af rotenon.
Abstract
Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der resulterer fra degenerering af dopaminerge neuroner i centralnervesystemet, især i substantia nigra. Sygdommen forårsager motoriske mangler, som præsenterer som stivhed, rystelser og demens hos mennesker. Rotenon er et insekticid, der forårsager oxidativ skade ved at inhibere funktionen af elektron transportkæde i mitokondrierne. Det er også bruges til at modellere Parkinsons sygdom i Drosophila. Fluer har en iboende negativ geotactic svar, som tvinger dem til at klatre opad efter at være blevet forskrækket. Det er blevet fastslået, at rotenon forårsager tidlig dødelighed og bevægelseskomponenter fejl, der forstyrrer fluerne evne til at klatre, efter at de er blevet tappet nedad. Imidlertid er effekten af rotenon på spontan bevægelse ikke veldokumenteret. Denne undersøgelse skitserer to følsomme, reproducerbare, og analyser med høj kapacitet til at karakterisere Rotenon-induceret mangler ikortsigtet startle-induceret bevægelse og langvarig spontan bevægelse i Drosophila. Disse analyser kan nemt tilpasses til at karakterisere andre Drosophila modeller af bevægelseskomponenter fejl og effekten af terapeutiske midler.
Introduction
Locomotion mangler er en vigtig symptom på Parkinsons sygdom og er i vid udstrækning skyldes forringelse af dopaminerge neuroner i substantia nigra 1. Rotenon er en ketonisk insekticid, der er blevet undersøgt grundigt at modellere Parkinsons motoriske underskud i Drosophila 2-6. Rotenon forårsager oxidative skader ved at blokere den oxidative phosphorylering vej, hvilket i sidste ende forårsager celledød 7. Dopaminerge neuroner er mere tilbøjelige til rotenon toksicitet, hvilket gør virkningen af kemikaliet primært motor baseret 2,7. Ved at inducere symptomer på Parkinsons sygdom i fluer, kan vi bedre forstå sygdommen og afhjælpe dens symptomer 6,8-11. Drosophila giver en god model til at studere denne effekt, fordi de er genetisk medgørlig, let at vedligeholde, og har en hurtig livscyklus.
Adskillige undersøgelser har vist, at rotenon forårsager kortvarig chok-induceretbevægelseskomponenter defekter i Drosophila -når fluer vedligeholdes på rotenon-suppleret mad, de viser en langsommere negativ geotactic respons efter forskrækkelse 2-6. Deres manglende evne til at klatre opad i et hætteglas apparat så hurtigt som kontrolforsøg er tegn på forskrækkelseskasser-induceret bevægelseskomponenter defekter.
Effekten af rotenon på langsigtet, er spontan bevægelse ikke velbeskrevet. Drosophila aktivitet monitorer (dæmninger) med succes er blevet anvendt til at overvåge bevægelse i Drosophila døgnrytme undersøgelser 12,13. Fluer er placeret i de enkelte rør, der er indlæst i dæmningen. Dette apparat er udstyret med en infrarød sensor, der tæller antallet af gange en flue bryder den infrarøde stråle. Disse tællinger kan bruges som et mål for uforstyrret bevægelse og aktivitet 12,13. Ved at placere fluer i et DAM, kan effekten af rotenon på deres langsigtede bevægelse karakteriseres. Undersøgelsen beskriver metoder til at measURE kortsigtet startle-induceret bevægelse og langvarig spontan bevægelse for bedre at forstå virkningerne af rotenon medieret motoriske mangler. Karakterisering af bevægelseskomponenter mangler efterligner Parkinsons sygdom er vigtige, fordi de giver mulighed for undersøgelse af andre forbindelser, der kan vende disse bevægelseskomponenter defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Drosophila Startle-induceret Locomotion assay
- Drug Treatment
- Adstadige at immobilisere ønskede antal (ca. 8-12) på 1-3 dage gammel mand fluer ved hjælp af CO 2 og transportere dem til hætteglas indeholdende lægemidlet-suppleret fødevarer. Bemærk: En anden bedøvelsesmiddel fx kan æter eller is bruges til at bedøve fluer at muliggøre optælling og håndtering.
- Tillad fluer til at inddrive fra sedation i 20 min (eller indtil nyttiggørelse) med hætteglasset i vandret position (for at undgå fluer at få fast på fødevarer) og derefter placere hætteglasset i en 12 timers mørke, 12 timers lys inkubator ved 25 ° C for resten af eksperimentet.
- Eksperimentel opsætning
- Divider denne dobbelte hætteglas opsætning i tre lige store dele af 6.33 cm ved at markere cirkler omkring hætteglassene med en permanent markør.
- Efter 3 dages eksponering for lægemidlet, overførsel flyver uden bedøvelse i bunden hætteglasset og hurtigt placere toppen hætteglasover åbningen. Tape de to hætteglas sammen med klar tape.
- Tillad fluer at akklimatisere sig til det nye miljø i 15 min.
- Placer hætteglas på en hvid baggrund og oprette et digitalt kamera i en passende afstand fra den dobbelte hætteglas apparat med en timer i betragtning. Sørg for, at hele apparatet er synligt i en enkelt billedramme, og at alle fluer er i fokus. For at opretholde ensartede rammer mellem forsøg markere placeringen af kameraet og hætteglasset.
- Mobilitet Assay
- Tydeligt mærket med prøvenummer, narkotikabehandling, og timeren i kamera visning.
- Bankes den dobbelte hætteglas apparat imod køkkenbordet 3 gange og sikre, at alle fluer falde til bunden af hætteglasset. Samtidig starte timeren.
- Hver 5 sek i 1 min, tage et billede af apparatet. Bemærk: Alternativt kan en video indfanges og standsede med passende mellemrum for målingerne.
- Tillad fluer at inddrive uforstyrret i 1 min.
- Dataanalyse
- Gennemgå billeder og registrere antallet af fluer i hver sektion over tid. Procentdelen af fluer i hver sektion over tid. Bemærkninger: Gentag hele denne procedure med de samme fluer på 2 eller 3 tidspunkter af interesse, for eksempel, dag 3, 5 og 7. Hvis der er for mange fluer dør hele eksperimentet er det muligt at skalere op den oprindelige retssag for at kompensere for dødelighed. Brug passende statistisk analyse for at sammenligne data.
2. Drosophila Spontan Locomotion Assay
- Madlavningsprodukter
- Opløs 3 g øjeblikkelig Drosophila-medium med 15 ml afioniseret vand og ønskede rotenon(Eller et andet lægemiddel af renter) dosering.
- Når maden blandingen er blevet fast (ca. 5 min), omhyggeligt indlæse fødevarer skal være ca 1 cm høje i Producentleveret gennemsigtige rør (5 mm x 65 mm). Tilføj lægemidlet infused fødevarer til rørene ved omhyggeligt at anbringe rørene lodret i fødevarer og dreje dem, indtil de kan fjernes med fødevarer inden i røret. Bemærk: Det er nyttigt at placere en finger på åbningen af røret for at skabe et vakuum. Fødevarer bør ikke indeholde luftbobler eller har en ujævn overflade som fluerne kan sætte sig fast.
- Forsøgsopstilling
- Placer en plastik hætte på enden af røret nærmest maden. Skub plastik hætte på røret så lidt som muligt, da det kan skabe en luftboble i hætteglasset, hvis skubbet til kraftigt.
- Adstadig 1 dag-gammel mand flyver ved hjælp af CO 2 og omhyggeligt indsætte 1 han flyve i hvert rør med en pensel. Gentag afhængigt af antallet af ønskede forsøg.
- Sætende af røret længst væk fra fødevarer med et lille stykke vat, som kan hånd rulles fra større butik købte vatkugler.
- Tillad fluer til at inddrive med de rør i en vandret stilling i 15 minutter og sikre, at alle fluer er i live og aktive. Sæt rørene i DAM og sørg for, at alle rørene er i samme position i forhold til dæmningen. Bemærk: Det er muligt at placere dem med hensyn til overvågning i midten af glasset, eller at skubbe alle hætteglas til siden, således at enden af røret overvåges. Bemærk: Se diskussion for variationer på denne metode.
- Dataindsamling
- Placer DAM i en 12 timers mørke, 12 h lys inkubator indstillet til 25 ° C. Slut DAM til dataindsamlingssystemet. Åbn DAM softwaren og under præferencer vælg bin længde til 10 min. Start dataindsamlingen og programmet lov til at indsamle data i 7 dage. Bemærk: Bin længde kan justeres, hvis det kræves.
- Dataanalyse
Bemærk: Procesde data for at opnå tællinger pr minut som en foranstaltning for langsigtet spontan bevægelse.- Åbent DAM fil scan program og adgang overvåge data ved at klikke på Vælg datainput.
- Vælg passende skærm rækkevidde, og vælg bin længde til 10 min intervaller.
- I output filtype vælge kanal filer. Lad alle andre indstillinger som standard.
- Klik på scannede data og gemme til en udpeget mappe.
- Importer data i en døgnrytmen dataanalyse software til at få tællinger pr min. Bemærk: Ved dataanalyse Clocklab software er almindeligt anvendt. Andre muligheder er også tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila Startle-induceret Locomotion assay
Vildtype, kanton-S, fluer viste en robust negativ geotactic respons med kun cirka 88% og 5% af fluer i den øverste og nederste sektioner henholdsvis af dobbelt-hætteglasset apparat efter 30 sek (figur 1). Fluer udsat for 125 m og 250 um rotenon 3 dage viste et lille fald i antallet af fluer i den øverste del og svag stigning i antallet af fluer i nederste sektion. Fluer udsat for 500 uM rotenon viste signifikant defekt benægtende geotactic respons (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis sammenligning) som det fremgår af færre fluer i den øverste sektion og flere fluer i nederste del i forhold til at kontrollere fluer (figur 1). Denne defekt i negativ geotactic respons på grund af manglende evne til hurtigt at klatre i apparatet er tegn på en defekt i startle-inproduceret bevægelse.
Drosophila Spontan Locomotion Assay
Vildtype, kanton-S, fluer viste 0,57 tællinger per minut som et mål for spontan mobilitet på den fjerde dag i DAM (figur 2). Fluer udsat for 125 uM rotenon viste et tilsvarende niveau for spontan bevægelse. Derimod flyver udsat for 250 pM og 500 pM rotenon viste omtrent 50% lavere foranstaltninger (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis sammenligning) af spontan bevægelse (figur 2). Disse fluer flyttes omkring 0,20 tællinger per minut, hvilket er tegn på en rotenon-induceret defekt i spontan bevægelse.
At redegøre for de første uoverensstemmelser (hvis nogen) i bevægelse ikke er forårsaget af rotenon eksponering, vi trækkes bevægelseskomponenter data mellem dag 4 og dag 3. Kontrol fluer viste en stigning på omkring 0,1 tællinger per minut i spontaneoos bevægelse mellem dage, mens fluer eksponeret for 125 uM rotenon udviste et lille fald på omkring 0,15 tællinger per minut (Figur 3). Fluer udsat for 250 pM og 500 pM rotenon vises mere alvorlige fald i bevægelse mellem dage med forskelle er cirka 0,3 og 0,5 (p <0,05 ANOVA, Bonferroni parvise sammenligning) tæller per minut hhv. Disse data tyder på en mangel på spontan bevægelse over tid med udsættelse for rotenon og bekræfter enkelt dag analyse nævnt ovenfor - fluer udsat for højere doser af rotenon viste et fald i spontan bevægelse. Kombinationen af disse metoder pålideligt måle Rotenon-induceret mangler i spontan og overraske-induceret bevægelse.
Figur 1. Startle-induceret bevægelse plot affluer udsat for stigende doser af rotenon. Vildtype Canton-S blev mandlige fluer udsat for forskellige doser af rotenon i 3 dage og efterladte fluer (8-12) blev derefter tappet ind i bunden af den dobbelte hætteglas apparatet. Fluer udsat for 500 uM rotenon viser et signifikant fald i procent af fluer i toppen (A) og stigning i procent af fluer i bundsektionen (B) af apparatet efter 30 sek. Dette er tegn på en mangel i startle response i fluer udsat for rotenon. Kolonner repræsenterer den gennemsnitlige procentdel af 6 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis sammenligning.
Figur 2. Spontan bevægelse plot af fluer udsat for stigende dosiss rotenon. Vildtype, Canton-S, blev mandlige fluer udsat for forskellige doser af rotenon og tællinger pr minut på den fjerde dag efter eksponering blev afbildet. Tællinger blev målt i en DAM. Fluer udsat for 250 pM og 500 pM rotenon viser en reduktion i tællinger per minut. Dette er tegn på en mangel på spontan bevægelse i fluer udsat for rotenon. Kolonner repræsenterer de gennemsnitlige tællinger pr min på fjerde dag af 5 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis sammenligning.
Figur 3. Ændring i spontan bevægelse plot af fluer udsat for stigende doser af rotenon. Vildtype, Canton-S, blev mandlige fluer udsat for forskellige doser af rotenon, og forskellen i tællinger pr min on den tredje og fjerde dag efter eksponering blev afbildet. Tællinger blev målt i en DAM. Der er en dosisafhængig tendens til fald i spontan bevægelse med fluer udsat for højere doser med en mere negativ ændring i bevægelse. Dette er tegn på en nedgang i bevægelse. Kolonner repræsenterer den gennemsnitlige ændring i bevægelse per minut af 5 uafhængige forsøg. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien; * P <0,05 ANOVA, Bonferroni parvis sammenligning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskriver vi to procedurer for måling af både langsigtede spontan bevægelse og kortsigtede chok-induceret bevægelse i en rotenon-induceret Drosophila model af Parkinsons sygdom. Man kan også måle disse bevægelseskomponenter karakteristika fluer udsat for andre farmakologiske midler, der vides at modellere Parkinsons sygdom f.eks paraquat 14 genetiske modeller af Parkinsons sygdom fx alfa-synuclein mutanter 15 og andre flyve modeller af sygdomme hos bevægelse. For begge fremgangsmåder kan alternative metoder og modifikationer overvejes. Fluer kan bedøves ved hjælp af is, som kunne afhjælpe begrænsninger af CO 2 bedøvelse for eksempel forsinkelse i dataindsamling for at lade CO 2 effekt fortager sig.
I startle-induceret bevægelse assay eftersom fluer viser cirkadiske variation i mobilitet, er det vigtigt at indsamle data på samme tidspunktdag mellem eksperimenter. Det er også vigtigt at indføre fluer i testapparatet uden bedøvelse. I modsætning til de fleste forskrækkelsesrespons bevægelseskomponenter assays, som er baseret på et øjebliksbillede af at passere en tærskel i en forudbestemt tid 10,11,15,16, vores tilgang, svarende til hurtige iterative negative geotaxis (ring) Indhold 17,18, overvåger bevægelse på hinanden flere forekomster over en periode. Denne tilgang af kontinuerlig overvågning af fordelingen af fluer i forskellige zoner kan løse subtile forskelle mellem behandlingsgrupper. Derudover kan vores tilgang til beregning af procentdelen af fluer i flere zoner i arenaen at minimere bidraget fra udsving i dataene.
Vi har også systematisk besluttede på hvilket tidspunkt at tage data til at sammenligne behandlingsgrupper. Efter at have taget data hvert 5 sek i 1 min, vi plottede data, og fandt, at de mest bemærkelsesværdige forskelle mellem behandlingerne kunne be ses på 30 sek. Efter dette tidspunkt, fluer udsat for rotenon er i stand til at kompensere for deres lokomotoriske defekter. Derfor anbefaler vi brugerne til at optimere timingen af dataopsamling til bedst løse forskellene mellem deres kontrol og eksperimentelle sæt. Denne fremgangsmåde har også den fordel at bestemme relative bevægeapparatet mangler mellem farmakologiske midler og / eller genetiske modeller. For eksempel kan en mere giftigt kemikalie end rotenon vise mest bemærkelsesværdige forskelle tidligere end 30 sek tidspunkt.
For den langsigtede spontan bevægelse analyse, da fluer er bedøvet at indføre dem i rørene, ikke anser data fra første 24-48 timer at give mulighed for anæstesi til at bære-off og akklimatisering af fluer i monitoren rør. En anden overvejelse til denne analyse er den relative position af røret og bevægelsesføleren i DAM, som vi mener kan påvirke de spontane bevægelseskomponenter data. Vi placerede de rør, der indeholder fluer på skærmensåledes, at sensoren er overvågning af en tredjedel span af røret længst væk fra fødevarer og ikke i midten af røret, som er normalt gøres i traditionelle brug af DAM i døgnrytmen studier. Dette tillod os at undersøge evnen af fluerne til at krydse mindst to tredjedele af rørets længde og ført til mere konsistente data. Det er sandsynligt, at aktiviteten tæller kan blive påvirket i rotenon-fodret fluer på grund af bevægelse brister og / eller trækninger fænotype. Andre mulige forstyrrende faktorer for aktiviteten tæller kunne være en gustatoriske og / eller en olfaktoriske modvilje / tiltrækning mod rotenon og andre kemikalier af interesse for brugeren. Derfor ekstra video sporing 17,19 kan anvendes til at supplere de DAM data for en mere grundig analyse af bevægelse fænotype.
I et scenario, hvor eksperimentelle fluer har lignende aktivitet tæller i forhold til kontrol fluer, er det muligt, at de adskiller sig i døgnrytmen fordeling bevægelighed Da fløgne er mere aktive omkring lys on / off og off / on overgang i en 12 timers lys-12 timers mørke. Derfor ville det være nyttigt at bestemme de tællinger pr min ved forskellige tidspunkter og bin længder i en 24-timers periode at fastslå den nøjagtige fordeling af bevægelse. Konklusionen er, at dette assay på grund af sin evne til at vurdere bevægelse egenskaber ikke er begrænset til flytning som reaktion på startle give ny indsigt i bevægelseskomponenter defekter og karakterisering af afhjælpende strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Qiuli Wang, sprog Resource Center, Colby College, om teknisk bistand til videobehandling og Eric Thomas, afdelingen for musik, Colby College, for at give baggrundsmusik. Dette projekt blev støttet af tilskud fra National Center for Forskning Ressourcer, INBRE (P20RR016463-12), Det Nationale Institut for General Medical Sciences (P20 GM103423-12), Nationals Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL og LWM blev støttet af tilskud fra Summer Scholar Fund, Colby College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard narrow vials | Genesee Scientific | 32-120 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Store in freezer, make fresh for each experiment |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | Solvent for rotenone |
| Instant Drosophila medium | Carolina Biological | Formula 4-24 | |
| Drosophila activity monitor (DAM) | Trikinetics | DAM2 | trikinetics.com |
| DAM tubes | Trikinetics | Tubes 5 X 65 mm | |
| Recipe for Rotenone + food (125 mM dose) | Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO; For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water. |
References
- Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
- Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
- Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
- Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
- St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
- Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
- Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640 (2011).
- Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
- Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
- Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
- Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).
