Summary
وقد اعتمد تقييم الفيزيولوجيا التنفسي تقليديا على التقنيات، التي تتطلب ضبط النفس أو تخدير للحيوان. غير المقيد تخطيط التحجم كامل الجسم، ومع ذلك، يوفر دقيق، غير الغازية، والتحليل الكمي للفسيولوجيا الجهاز التنفسي في النماذج الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، تسمح تقنية تكرار تقييم الجهاز التنفسي في الفئران مما يسمح للدراسات طولية.
Abstract
ضعف الجهاز التنفسي هي واحدة من الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في العالم، وتستمر معدلات الوفيات في الارتفاع. التقييم الكمي وظائف الرئة في نماذج القوارض هو أداة هامة في تطوير العلاجات المستقبلية. التقنيات المستخدمة عادة لتقييم وظيفة الجهاز التنفسي بما في ذلك تخطيط التحجم الغازية والتذبذب القسري. وبينما توفر هذه التقنيات المعلومات القيمة، ويمكن جمع البيانات تكون محفوفة المصنوعات اليدوية وتقلب التجريبية نظرا للحاجة للتخدير و / أو الأجهزة الغازية من الحيوان. في المقابل، غير المقيد تخطيط التحجم كامل الجسم (UWBP) يقدم غير الغازية، وطريقة دقيقة، والكمية التي يمكن من خلالها تحليل المعلمات الجهاز التنفسي. هذا الأسلوب يتجنب استخدام التخدير والقيود، وهو أمر شائع لتقنيات تخطيط التحجم التقليدية. وهذا الفيديو يظهر الإجراء UWBP بما في ذلك معدات انشاء والمعايرة وظيفة الرئة تسجيل. ذلكسوف يشرح كيفية تحليل البيانات التي تم جمعها، وكذلك تحديد القيم المتطرفة والتحف الفنية التجريبية التي تنتج من حركة الحيوان. وتشمل المعلمات الجهاز التنفسي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية حجم المد والجزر، وحجم دقيقة، دورة العمل الشهيق، ومعدل تدفق الشهيق ونسبة الوقت إلهام لوقت انتهاء الصلاحية. UWBP لا تعتمد على المهارات المتخصصة وغير مكلفة لأداء. ومن السمات الرئيسية لUWBP، والأكثر جاذبية للمستخدمين المحتملين، هو القدرة على أداء التدابير المتكررة من وظائف الرئة في نفس الحيوان.
Introduction
ضعف الرئة هو واحد من الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في العالم. وتتميز حالة عدم كفاية الأكسجين الصرف، مرادفا السعال، وآلام الصدر وضيق التنفس. حسابات أمراض الجهاز التنفسي ل~ 10٪ من الوفيات في جميع أنحاء العالم 1. وفقا لمنظمة الصحة العالمية، يتم تعيين معدلات الوفيات في الارتفاع بسبب التدخين المستمر، والتلوث والمهيجات المهنية. UWBP هو إضافة مفيدة لدراسة علم وظائف الأعضاء الرئة، التي تكمل بقوة البيوكيميائية والنسيجية التقليدية تحليلات 2. الإجراءات الأخرى المستخدمة لتقييم الرئة لا توفر نفس المزايا على النحو UWBP. تخطيط التحجم الغازية هي تقنية تستخدم عادة يتطلب أن يكون تخدير الحيوان 3،4 وبالتالي، مما أدى قياسات الجهاز التنفسي لا يعكس بالضرورة حالة طبيعية. علاوة على ذلك، شرط التحديات التهوية الميكانيكية والكيميائية يمنع القياسات المستقبلية 3،4.طريقة أخرى لجمع البيانات عن طريق الجهاز التنفسي هو التذبذب القسري، التي هي أكثر حساسية للتغيرات في ادق المعلمات الجهاز التنفسي مقارنة UWBP 5. التذبذب القسري، ومع ذلك، تقنية الغازية ويتطلب إنهاء الحيوان لجمع البيانات 5-7.
UWBP ينطوي على وضع الحيوان داخل غرفة المتخصصة. خلال الإلهام، وارتفعت درجة حرارة الهواء المد والجزر وترطيب داخل الرئتين زيادة ضغط بخار الماء ويسبب التمدد الحراري من الغاز 8. هذا التأثير يسبب التغير في حجم الهواء يؤدي إلى حدوث ارتفاع في الضغط داخل غرفة مخطاط التحجم 8. يحدث العكس أثناء انتهاء خلق الموجي التنفسي من الحيوان. ثم يتم استخدام التحليل الموجي لقياس من تتبع الجهاز التنفسي: معدل التنفس (الأنفاس / دقيقة)، ومجموع وقت دورة التنفس (ثانية)، إلهام / وقت انتهاء الصلاحية (تي / تي، وثانية) والتغيرات في الضغط بسبب كل حجم المد والجزر (P T). يوفر UWBP دقيق، غير الغازية، والتحليل الكمي للفسيولوجيا الجهاز التنفسي في النماذج الحيوانية، ويمكن استخدامها لقياس تطور أمراض الجهاز التنفسي وظيفة الرئة 6،9. خلافا للتقنيات تخطيط التحجم أخرى، UWBP يتجنب استخدام التخدير، والقيود والتلاعب الغازية التي تنتج المصنوعات اليدوية والتجريبية تقلب 6،9. التخدير يمكن قمع التنفس،تغيير معدل ضربات القلب ويمكن أن يكون تحديا لتنظيم 10. القيود تحفز زيادة في التنفس بسبب الإجهاد الإضافي عن طريق الكورتيزون والادرينالين الافراج 11،13. ويتكرر سمة أساسية من سمات UWBP تقييم الفسيولوجية مما يجعلها قابلة للدراسات طولية. ويوصى بشدة UWBP لتقييم الطولي للعلم وظائف الأعضاء الرئة ويقدم مهارة قيمة لتقييم المخدرات التنفسي في المستقبل. وقد استخدمت بليوميسين، ألبومين البيض، ونقص الأكسجة للحث على التحديات الجهاز التنفسي في العديد من الدراسات وUWBP ويقاس بنجاح الرئة دقيقة تقييم الفسيولوجية 7،9،13-16. تم تصميم بروتوكول صفها للفئران المختبر الكبار القياسية. ومع ذلك، فقد تم تكييف UWBP إلى الحيوانات الأخرى مثل الفئران والخنازير الغينية، والرئيسيات غير البشرية 17-20. لا يقتصر UWBP فقط لتقييم الخلل الوظيفي الرئوي ولكن كما استخدمت لتقييم نضج الرئة 3.وقد أنشأت براعة والبساطة واستنساخ UWBP تقنية ممتازة لتقييم وظائف الرئة في الحيوانات. سيطلب البرامج المختلفة (انظر الجدول المواد والمعدات) لمتابعة هذا الإجراء. سيكون عالم ذوي الخبرة تكون قادرة على أداء هذا البروتوكول مع ماوس في حدود 1 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على إجراء التجارب التالية من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوان في جامعة موناش وأجريت وفقا للقانون الأسترالي الممارسات لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية (2006). تم الحصول على الإناث البالغات C57BL / 6 الفئران المستخدمة لتوليد نتائج ممثلة من خدمات تنظيم الأعراس موناش. وتم إيواء الفئران في الممرض الحر ودرجة الحرارة والرطوبة غرفة محددة تسيطر عليها مع دورة ضوء الظلام 12 ساعة. وكان لهذه الفئران حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
1. الإعداد الأولي
- ربط أجهزة الكمبيوتر المحمول / سطح المكتب إلى الجهاز الحصول على البيانات لتسجيل عن طريق كابل USB.
- توصيل مكبر للصوت جسر من "الناتج 1 'إلى' مدخلات 1" الجهاز الحصول على البيانات عن طريق كابل BNC.
- إدراج محول الضغط على "القناة 1" أوكتال للجسر الأمبير. تحويل الجهاز على الحصول على البيانات وفتح برامج التحليل. البرنامج ينبغي السياراتmatically كشف الإعداد المعدات (انظر الجدول المواد والمعدات).
- إعدادات القناة المفتوحة الموجودة في شريط الأدوات الإعداد للبرنامج. تغيير عدد من القنوات التي سجلت إلى 1.
- إعداد مقياس لقياس ضغط الغرفة وجهاز عمود الماء لمعايرة مكبر للصوت بريدج. ويتضمن الجهاز عمود الماء الماصات حقنة اثنين من 5 مل المصلية متصلة بواسطة أنابيب بلاستيكية.
- ملء الأعمدة بالماء وضمان مناسيب المياه هي متوازنة مع حاكم. ربط قطعة واحدة من أنابيب بلاستيكية إلى أعلى كل ماصة الشكل 2 يوضح تعيين عمود الماء فوق.
2. جسر مكبر للصوت المعايرة
ملاحظة: لمعايرة مكبر للصوت جسر ضخ الهواء إلى عمود الماء هو مطلوب لخلق 1 سم H 2 O انحراف. يحدث هذا تحت مجموعة واحدة من الشروط وتعتمد على جهاز المستخدم. لتوضيح هذه الخطوات دemonstrate كيف أن هذا المختبر سيكون أداء المعايرة.
- سحب حقنة 1 مل إلى 300 ميكرولتر. نعلق حقنة لمحبس في نهاية الأنبوب على الجانب الأيمن من عمود الماء. ملاحظة: تأكد من أن محبس مفتوح للحقنة وعمود الماء، وأغلق إلى هواء الغرفة. إذا لم يتم متوازنة مستويات المياه عند هذه النقطة، وتحويل محبس بحيث يكون مفتوحا للهواء الغرفة وعمود الماء، وهذا سوف إعادة توازن الماء. يجب أن تكون متصلا أنابيب على الجانب الأيسر من العمود المياه إلى محول الضغط لقياس التغير في الضغط الناجم عن اغراق الحقنة.
- إرفاق أنابيب من عمود الماء على الجانب الأيسر للموصل محول الضغط على (عصابة العليا للمحول).
- حدد القائمة التمرير إلى أسفل وجدت بجانب توجيه 1 في الشاشة الرئيسية على الجانب الأيمن من البرنامج وحدد "أمبير جسر" (انظر الجدول المواد والمعدات).
- أدخلالإعدادات إلى 5 بالسيارات، 20 هرتز الترددات المنخفضة، وضع علامة في مربع "عكس" وانقر على "الصفر". انقر على "الصفر" لتعيين أثر في ~ 0 بالسيارات. تقليل حجم الإطار إلى 4: 1 لعرض أسهل.
- مع كل إعداد، كساد حقنة 1 مل، وتركها لمدة 3 ثانية. هذا وسوف تظهر ارتفاعا مفاجئا على البرنامج لأن الضغط قد تغير. عند الاكتئاب ميكرولتر 300 الضغط سينتقل الماء في عمود الماء بمقدار 1 سم. سوف تساعد هذه القيمة المعروفة معايرة مكبر للصوت بريدج.
ملاحظة: إن زيادة الضغط في الغرفة بسبب الاكتئاب ميكرولتر 300 يتوافق مع قيمة P K تستخدم لإجراء العمليات الحسابية في وقت لاحق. - اختر 'وحدات الإدخال' وجدت في أسفل الزاوية اليسرى من النافذة جسر الأمبير.
- تسليط الضوء على "أثر الخلفية" قبل ارتفاع المعروف باسم "المنطقة صفر".
- انقر فوق السهم بجوار "النقطة 1 'وهذه سوف تنتج البكالورياإشارة kground ضمن مجموعة من -0.002 MV-0.002 بالسيارات (لن تكون أبدا قيمة بالضبط في 0 فولت).
- نوع "0" في الإطار المجاور للنافذة إشارة الخلفية.
- تسليط الضوء على "زيادة الضغط من منطقة الرسم البياني" من الاكتئاب عند الحقنة. انقر فوق السهم بجانب النقطة 2 ويجب أن تكون القيمة في نطاق 0.9-1.2 بالسيارات.
- نوع "1" في الإطار بجوار النافذة "ضغوطا متزايدة". لتوضيح البصرية على الخطوات 2.7 و 2.8 الرجوع إلى الشكل 3. القيم الموجودة خارج نطاقات محددة قد تشير إلى الأضرار التي لحقت أوكتال جسر الأمبير.
- اذهب إلى "تحديد الوحدات التي عثر عليها في الزاوية اليمنى العليا من النافذة وحدد" CMH 2 O ". إذا كان هذا الخيار غير متاح، يمكن إدخالها يدويا. انقر فوق موافق.
- العودة إلى القائمة "جسر الأمبير" (راجع 2.1). حدد 1 بالسيارات ووضع مكبر للصوت إلى "الصفر"؛ وهذا استكمال المعايرة ويمكن أن يكون بأمان إزالة عمود الماء.
وظيفة 3. تسجيل الرئة
- وزن الماوس (ز). ملاحظة: أسبوع واحد قبل تقييم الفسيولوجية إدخال الماوس إلى بيئة غرفة تخطيط التحجم. هذا وسوف تساعد في التأقلم والحد من التوتر عند تنفيذ هذا الإجراء في وقت لاحق. لالتخطيطي الشامل يدل على الإعداد UWBP، يرجى الرجوع إلى الشكل 4.
- قياس درجة حرارة الجسم مع ميزان حرارة المستقيم. تليين الحرارة مع الفازلين قبل الإدراج. تسجيل قراءة درجة الحرارة وتنظيف زيوت التشحيم قبالة مع 80٪ (V / V) الايثانول. في حالة استخدام الحيوانات الصغيرة جدا مثل الجراء الماوس حديثي الولادة، يمكن تحديد متوسط قيمة درجة حرارة الجسم مع حرارة الأشعة تحت الحمراء بدلا من ذلك.
- وضع درجة الحرارة / الرطوبة النسبية التحقيق في نهاية فتحة واحدة للغرفة تخطيط التحجم. تسجيل درجة الحرارة والرطوبة وbarometrجيم الضغط داخل غرفة تخطيط التحجم قبل وضع الماوس داخل.
- ضع الماوس في غرفة تخطيط التحجم، وتغطي نهاية مفتوحة قليلا. وهذا يسمح الماوس للتأقلم. إغلاق الغرفة.
- مع التحقيق درجة الحرارة / الرطوبة إدراجها في جانب من الغرفة تخطيط التحجم مع فتحة واحدة، أدخل الآن محول وحقنة في الجانب الآخر مع اثنين من الثقوب.
- "ابدأ" الصحافة على برنامج حاسوبي وسجل لحوالي 15-45 ثانية. سجل 5-10 ثانية من البيانات حيث الحيوان لا يتحرك. سوف يغير حركة فسيولوجيا الجهاز التنفسي القاعدية الحيوان وتوفر النتائج السيئة. التنفس يجب أن تتذبذب في المسار الخطي على البرنامج. هذه هي بيانات صالحة للاستخدام. ملاحظة: التبول أو التغوط يمكن أن يؤدي إلى زيادة في درجة الحرارة والرطوبة داخل غرفة تخطيط التحجم. هذا وسوف تحجب النتائج أثناء التحليل. في حالة التبول أو التغوط، وإيقاف التسجيل فورا وتنظيف ررغرفة ethysmography مع 80٪ (V / V) الايثانول. الرجوع إلى الشكل 6 لتمثيل مرئي للنتائج دون المستوى الأمثل، حيث يجب رفض البيانات.
- بعد تسجيل لمدة 45 ثانية، اضغط على 'وقف' على برنامج (انظر الجدول المواد والمعدات) البرنامج. إزالة الماوس من غرفة تخطيط التحجم وتسجيل درجة حرارة الغرفة على الفور والرطوبة. لا تسجل بشكل مستمر لأكثر من 45 ثانية لأن ذلك قد نشدد على الحيوان.
- العودة الماوس لفي القفص، الرش ومسح الغرفة مع 80٪ (V / V) الايثانول.
- السماح للغرفة لتجف والعودة إلى درجة الحرارة والرطوبة الأساسية قبل الانتقال إلى الماوس المقبل. كرر الخطوات من 3،1-3،9 للحيوانات اللاحقة. ملاحظة: إذا كان يتم دراستها الحيوانات متعددة، تأكد من أن درجة حرارة الغرفة والرطوبة عودة إلى القيم الأساسية القريب قبل كل حيوان جديد يوضع في الغرفة.
4. تحليل تخطيط التحجم
لاالشركة المصرية للاتصالات: لحساب المعلمات الجهاز التنفسي مثل حجم المد والجزر (V T) وحجم دقيقة تحتاج المتغيرات التالية للقياس: معدل التنفس (الأنفاس / دقيقة)، ومجموع التنفس دورة الزمن (ثانية)، إلهام / وقت انتهاء الصلاحية (تي / تي، و ثانية) وتغير في ضغط بسبب كل حجم المد والجزر (P T). الشكل 1 يوضح المتغيرات التي يمكن قياسها من أثر. الخطوات التالية تستخدم برنامج (انظر الجدول المواد والمعدات) لقياس هذه المتغيرات. عند تحليل، وتجنب مناطق التتبع التي تحتوي على استنشاق أو الحركة. للحصول على نتائج استنساخه، لا يقل عن 5 ثوان من أثر جيد في التنفس هو مطلوب. للحصول على مثال من آثار مختلفة في التنفس الرجوع إلى الشكل 5 و 6.
- فتح الشاشة لملء الشاشة، تعيين بغية 1: 1 وحدد 5 ثانية من البيانات قابلة للاستخدام. وأظهرت لقطة تمثيلية من هذا في الشكل 5.
- فتح نافذة مصغرة لوحة البيانات التي عثر عليها في الجزء العلوي من الموالينغرام في علامة التبويب DataPad. اختيار القناة 1 وحدد "القياسات دورة" في العمود الأيسر و "ارتفاع متوسط دوري" في العمود الأيمن.
- اختر 'الخيار' وتعيين الحد الأدنى لنطاق الكشف الذروة إلى 1 (ميللي ثانية). هذا سيسمح الكشف عن كل قيمة الذروة ويصبح من المهم للغاية عند استخدام الحيوانات الصغيرة التي تنتج التذبذبات الصغيرة.
- انقر على "موافق". هذا وسوف يقدم "انحراف الضغط بسبب كل حجم المد والجزر" (P T) القياس.
- في لوحة البيانات مصغرة، حدد "القياسات دورة" تليها "عد الحدث" وانقر فوق "موافق". هذا وسوف يقدم "التردد" (و) القياس.
- يحتاج تردد يمكن تحويلها إلى الأنفاس / دقيقة. يتم ذلك عن طريق ضرب القيمة بنسبة 60 ثانية وتقسيم الإجابة في الوقت الإجمالي للتسجيل (دقيقة).
- في لوحة البيانات مصغرة، حدد "قبرصيالقياسات شركة كلي "تليها" فترة "وانقر على 'موافق'. هذا وسوف يقدم "مجموع وقت دورة التنفس" (T TOT، ثانية) القياس.
- وتستخدم الخطوات التالية لإنشاء macroinstruction لتوليد الشهيق والزفير قيم وقت الذروة. ضمان المؤشر مباشرة على أقصى ذروة / الحوض وإضافة تعليق على 9 قمم متعاقبة وهبوطا. تبدأ ذروة التذبذب كما هو مبين في الشكل 5.
- بعد ذلك، حدد نافذة: لوحة البيانات والعمود 1. في النافذة التي تظهر انقر على 'اختيار المعلومات "في العمود الأيسر،' المدة 'في العمود الأيمن وانقر على" موافق ".
- حدد ماكرو وجدت في الجزء العلوي من البرنامج ومن ثم بدء التسجيل. الآن حدد الأوامر: 'البحث'، 'الذهاب'، 'ابدأ من الملف "وانقر على' البحث '.
- حدد الأوامر: "البحث" و "البحث عن تعليقات". اكتب نفس العبارة المكتوبة لمربع تعليق في 'تحتوي على' مربع المقدمة. اختيار "حدد إلى النقطة السابقة" التبويب و "البحث".
- حدد الأوامر: "إضافة إلى لوحة البيانات. بعد ذلك، حدد ماكرو: أوامر الماكرو والبدء في تكرار. يجب تعيين تكرار عد الإطار الذي يظهر عند 9.
- حدد الأوامر: "بحث عن التالي". حدد الأوامر: "إضافة إلى لوحة البيانات. أخيرا تحديد أوامر الماكرو ونهاية تكرار.
- الآن حدد الماكرو وإيقاف التسجيل. حفظ واسم الماكرو بعد عدد الحيوانات. ملاحظة: إعداد ماكرو لكل حيوان تسمح الماكرو لاستخدامها في الدراسات الطولية ويوفر الوقت.
- يمكن الآن تشغيل الماكرو للحصول على الإلهام (T ط) وانتهاء (T ه) الوقت بين كل تعليق. سوف تظهر البيانات تحت قناة 1 من datapad. انتهاء والإلهام يحدث تباعا وسوف تظهر البيانات في هذا النظام.
- تحتاج البيانات إلى أن تقسيم يدويا في الشهيق والزفير القيم. متوسط قيم البيانات أربعة من كل معلمة للحصول على متوسط T و T ط ه.
- مرة واحدة وقد استمدت القيم الأساسية حجم المد والجزر (V T، مل) يمكن حساب. للحصول على حجم المد والجزر ويستخدم معادلة Drorbaugh وفين 8:
V T (مل) = (P T / P K) × (V K) × ((T CORE (P B - C P)) / (T CORE (P B - C P) - T C (P B - P CORE)))
حيث
V T: حجم المد والجزر
P ك: انحراف الضغط بسبب كل حقنة 1 مل (يرجى الرجوع إلى الخطوة 2.5)
T أساسية هي: درجة الحرارة الأساسية من كل حيوان
P C: ضغط بخار الماء في درجة حرارة الغرفة X الرطوبة النسبية في تشاmber
T C: درجة الحرارة في الغرفة الحيوانية
P الأساسية: الضغط في درجة حرارة الجسم (ضغط بخار الماء في درجة حرارة الجسم × 1.0)
P T: انحراف الضغط المناسب لكل حجم المد والجزر
V ك: حقن حجم التداول للمعايرة
B P: الضغط الجوي - مرة واحدة وقد تم حساب حجم المد والجزر المعلمات التالية يمكن أيضا أن تحدد:
- حجم دقيقة (مل / دقيقة) = V T XF
- حجم الدقيقة (مل / دقيقة / كغم) = (V T XF) / وزن الجسم (كجم)
- V T (مل / كغ) = V T (مل) / وزن الجسم (كجم)
- دورة العمل الشهيق (٪) = ط T / T TOT
- الشهيق معدل التدفق (مل / ثانية) = V T / T ط
- نسبة الوقت إلهام لوقت انتهاء الصلاحية ط = T / T الإلكترونية
- مجموع دورة الزمن (قEC) = الوقت الإلهام (ثانية) + وقت انتهاء الصلاحية (ثانية)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما اتبعت هذا الإجراء بشكل صحيح، يتم إنشاء أي أثر تتأرجح يتفق على برنامج تحليل البيانات. يوفر الإجراء أثر التنفسي في غضون بضع دقائق بعد الإعداد مع حسابات الحوسبة بسيطة لتحديد المعلمات الجهاز التنفسي المدرجة. الشكل 5 يمثل أثر التنفس مناسبة من عنصر تحكم (صحي) الماوس. ويتم إنتاج البيانات تتأرجح المناسب عند الحيوان لا يتحرك بنشاط.
UWBP هو تقييم مفيد للغاية ويمكن الاعتماد عليها من وظائف الرئة بين السيطرة والتليف الرئوي فوج الشكل 7 يدل على وظائف الرئة على فأرة الحاسوب يعانون من التليف الرئوي الناجم عن بليوميسين في يوم 14. وبالمقارنة مع الرسم البياني السيطرة، ويوضح الشكل 7 فرق البصري بما يتفق مع الإدارة بليوميسين 7. كما نوقش سابقا، ويمكن تكرار الإجراء مما يسمح لنا لمراقبة التغيرات في paramete التنفسيالتمرير مع مرور الوقت بين هاتين المجموعتين.
النتائج التي تم الحصول عليها هي أن يعبر عنه يعني ± SEM. فمن المستحسن لنسخ ولصق البيانات التي تم جمعها في جداول البيانات إكسل بسيط. هذا وسوف تصبح مفيدة لتنفيذ العمليات الحسابية التي تمت مناقشتها في الخطوات 4.13 و 4.14. وظيفة الجهاز التنفسي يمكن مقارنة بصريا بين مجموعتين كما هو موضح في الشكل 8.
الرقم 1. مكونات مختلفة من دورة التنفس يتضح باستخدام تخطيط التحجم الجوي. يوضح هذا الرسم البياني أ) التغير في الضغط بسبب إلهام (ΔPi)، ب) التغير في الضغط بسبب كل حجم المد والجزر (PT)، ج) تغيير في ضغط بسبب انتهاء (ΔPe)، د) وقت الإجمالية دورة التنفس (Ttot)، ه) الساعة إلهام (تي) و) وقت انتهاء الصلاحية (تي). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. التمثيل المرئي للإعداد مقياسا والمياه العمود. تم تصميم هذا الرقم لمساعدة القارئ في وضع مقياسا والمياه عمود لعملية المعايرة. لاحظ مستوى المياه داخل عمودين بمساعدة الحاكم. وترتبط العمودين عبر 15 سم من الأنابيب البلاستيكية. يتم توصيل الأنابيب على اليمين (65 سم) لحقنة 1 مل وإلى اليسار (75 سم) محول الضغط مرتبطة إلى الجهاز الحصول على البيانات. ملاحظة: طول أنابيب يحدد حجم (300 ميكرولتر) المطلوبة للتحرك 1 سم من الماء انقر هنا لعرضصورة أكبر.
الرقم 3. تنفيذ الخطوات 2.4 و 2.5 من جسر الأمبير المعايرة. ويوضح هذا الرقم الخطوات 2.7 و 2.8 لمعايرة المعدات. لا بد من تصحيح جسر الأمبير للحصول على نتائج دقيقة. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 4. التخطيطي العام لإعداد UWBP. إلى اليسار هو مسبار الرطوبة / درجة حرارة متصلة جانب واحد من غرفة تخطيط التحجم تحتوي على الحيوان. إلى اليمين هو معايرة حقنة ومحول الضغط الرائدةمن غرفة تخطيط التحجم لنظام الحصول على البيانات المنتجة أثر التنفسي على الكمبيوتر. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 5. مثال على أثر التنفس التنفسي من عنصر تحكم الماوس C57BL / 6 التي تم الحصول عليها عند استخدام UWBP. يوضح هذا أثر التنفس المناسبة، بيانات متسقة من حيوان السيطرة. تضاف تسعة تعليقات متتالية في القمم وهبوطا من التنفس التذبذبات الحصول على الجهاز التنفسي المعلمات المدرجة باتباع الخطوات 4،1-4،13. ويمثل الوقت على طول محور س (ثانية) وتغيرات الضغط على طول المحور الصادي (cm.H 2 O). اضغط هنا للالسادسمصريات صورة أكبر.
الرقم 6. أمثلة على آثار الأمثل مختلفة تم الحصول عليها من C57BL / 6 عند استخدام الماوس UWBP. النتائج المثلى يمكن الخلط كما البيانات المناسبة وهو المصدر الأكثر شيوعا لتحليل الفقراء. ويوضح هذا الرقم آثار الأمثل الأكثر شيوعا التي لا ينبغي أبدا أن تستخدم للتحليل. وتظهر هذه الآثار في التنفس سجلت أ) تتبع التنفس في حين أن الحيوان هو استنشاق وتتحرك تغيير فسيولوجيا الجهاز التنفسي القاعدية الحيوان. ب) عادة ما تسبب تتبع سجلت زيادة الناتج التذبذبات تدريجيا مع مرور الوقت عن طريق التكثيف والرطوبة بناء. ومع ذلك، يمكن تصحيح التتبع عن طريق محو غرفة تخطيط التحجم مع الإيثانول أو بتكرار الخطوات المعايرة. ج) تتبعسجلت خلال حركة غرفة تخطيط التحجم في حين أن الحيوان أو الباحث هو الانخراط مع المعدات. ويمثل الوقت على طول محور س (ثانية) وتغيرات الضغط على طول المحور الصادي (cm.H 2 O). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 7. مثال على أثر التنفس الحصول عليها من C57BL / 6 الماوس مع التليف الرئوي الناجم عند استخدام UWBP. يوضح هذا أثر التنفس المناسبة، بيانات متسقة من حيوان مع الرئوي الناجم عن الحصول عليها عند استخدام الإجراء UWBP الموضحة في هذه المقالة. تضاف تسعة تعليقات متتالية في القمم وهبوطا من التنفس التذبذبات الحصول على الجهاز التنفسي المعلمات المدرجة باتباع الخطوات 4،1-4،13. الوقت هو repreتقديهم على طول محور س (ثانية) وتغيرات الضغط على طول المحور الصادي (cm.H 2 O). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 8. وظيفة الجهاز التنفسي مقارنة بين السيطرة وبليوميسين تحدى C57BL / 6 الفئران. إجراء تحليل تخطيط التحجم بعد استخدام UWBP سوف تسمح للمستخدم نتائج مماثلة لما الممثلة هنا. هذا الرقم يدل على الفروق الفسيولوجية بين بليوميسين تحدى الحيوانية (خط رمادي منقط) والحيوانات التحكم (خط أسود خالص). تظهر هذه الرسوم البيانية المقارنة في) وقت انتهاء الصلاحية (ثانية)، ب) وقت إلهام (ثانية)، ج) واجب دورة إلهام (٪)، د) معدل تدفق الشهيق (مل / ثانية)ه) معدل التنفس (الأنفاس / دقيقة)، و) حجم الدقيقة (مل / دقيقة / كغم)، ز) حجم المد والجزر (مل / كجم) وح) مجموع دورة الزمن (ثانية). تم جمع البيانات وظائف الرئة طوليا في نفس فوج من الحيوانات في أيام 0، 7، و 14 بعد التحدي بليوميسين. تم تكييفها بيانات تمثيلية من مورفي وآخرون (2012) 16. انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية الموضحة هنا هي طريقة غير الغازية لتقييم المعلمات الجهاز التنفسي من الفئران غير المقيد وunanesthetized. وتشمل نقاط القوة في هذا البروتوكول بساطته والدقة لقياس وظائف الرئة طوليا مع الحد الأدنى من القطع الأثرية. هناك، ومع ذلك، بعض القيود والخطوات الحاسمة لأن يلاحظ حول الإجراء. أولا والأهم من ذلك، يجب على الماوس البقاء هادئا داخل غرفة لمدة لا تقل عن خمس ثوان. وأضاف الإجهاد سيؤدي إلى اختلال نمط التنفس من الفأرة وبالتالي تقديم نتائج متغيرة (الشكل 6A). وهذا العيب المرجح أن تظل وأمر متوقع في بعض الأحيان. ومع ذلك، لتحل محل الفأرة في قفص له في الداخل والسماح لها الوقت لإعادة توطين سيتم تصحيح هذا بسهولة. ومن الأهمية بمكان أن الحيوان يشعر بالراحة داخل بيئة الغرفة للحصول على خمس ثوان من / صالحة للاستخدام البيانات المناسبة. مطلوب مواصلة النظر فيها فيما يتعلق بالبيئة الغرفة. البيئة، شnrelated لميكانيكا الجهاز التنفسي، ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج. ومدة الزيادات التقييم، والرطوبة ودرجة الحرارة من الزيادات غرفة، فضلا عن تناقص الأكسجين المتاحة، مما يؤثر بشكل كبير على التهوية. توقيت التهوية يزيد من الرطوبة ودرجة حرارة الغرفة وكذلك انخفاض الأكسجين المتاح 21. تسرب صغير في الغرفة يمكن أن تساعد في الحد من الانجرافات الحرارية التي تم إنشاؤها من إنتاج الحرارة 22،23. بروتوكول ناقش تقتصر على المعدات والأجهزة المدرجة. والمعايرة من مكبر للصوت جسر في القسم الثاني تعتمد على المعدات القارئ. إذا العوامل مثل طول أنابيب مختلفة على حقن 300 ميكرولتر من الهواء قد لا يسبب 1 cm.H 2 O انحراف.
هناك أيضا اختلافات فسيولوجية اعتمادا على الوقت من التحليل. القوارض هي مخلوقات ليلية بشكل طبيعي ودورات الإيقاعية، التي تولد في نهاية المطاف تغييرات فيالتنفس، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند توقيت التجارب 24. وبالتالي فمن الضروري الوقت والتخطيط للتجارب مثل تلك البيانات التجريبية يمكن مقارنتها بدقة بين الأفواج. ومن المهم أيضا أن يحيط علما الحركة أثر. إذا كانت التذبذبات لا تعمل في نمط الخطي، فإنه عادة ما يكون نتيجة لتراكم التكثيف أو الرطوبة داخل غرفة (الشكل 6B)، أو الختم غير فعالة في الغرفة. في نهاية المطاف، يمكن احتساب هذه القيود لوعملية UWBP إجراء مناسب لتوفير قياس التنفسي الدقيق. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب تعديل (أصغر حجم الغرفة) لقياس التغيرات في الجهاز التنفسي في الفئران المعملية القياسية حديثي الولادة (على سبيل المثال، <2 أسابيع C57BL / 6) من أجل الكشف عن تغيرات الضغط في التنفس للحيوانات بهذا الحجم .
على الرغم من UWBP يدل على أنه يحمل مزايا كبيرة أيضا الجدل.يجب أن المحققين يطلعوا على النقاش واتخاذ قرار مستنير ما إذا كان هذا الأسلوب هو مناسبة لسؤال البحث. في البداية، Drorbaugh وفين (1955) 8 يعتقد أن الزيادة في ضغط الغرفة يسببه الهواء من وحي يجري حرارة ومرطب للقيم الرئة؛ حدث العكس في انتهاء الصلاحية. هذا يسمح حساب حجم المد والجزر. تعتبر الأبحاث اللاحقة أن تغيرات الضغط سببها تغيير الضغط السنخية خلال توليد تدفق الهواء 25. وذكر هذا العمل استخدام تخطيط التحجم لحساب المقاومة الهوائية. Enhorning وآخرون (1998) 26 قدم أدلة على أن حجم المد والجزر، معدل التنفس ومقاومة مجرى الهواء عن تأثير تقلبات الضغط داخل غرفة تخطيط التحجم. عندما يتم تسخين الهواء في الغرفة وترطيب لظروف الجسم وتخفض تقلبات الضغط بمقدار الثلثين وتتضخم من خلال زيادة المقاومة <سوب> 21. وتعكس جميع هذه المكونات تقلبات الضغط هناك جدل عما إذا القياسات من المعلمات الجهاز التنفسي معينة دقيقة. ونتيجة لذلك تم التوصل إلى أن حجم المد والجزر التي تم الحصول عليها من تخطيط التحجم هو النوعية وليس التقييم الكمي 26. كلا مقاومة مجرى الهواء العلوي والسفلي هي مكونات نظام تخطيط التحجم خلق حالة عدم اليقين في قياس الشعب الهوائية 27. ومن رأي المؤلف أن UWBP ينبغي أن تستخدم بالتبادل مع التحليلات الغازية. هو، في الواقع، لن يتم قبول سياسة بعض المجلات أن المخطوطات التي تستند فقط على البيانات UWBP ذلك. وسيكون هذا اعتبار آخر للقارئ.
باختصار، UWBP هو طريقة مفيدة لقياس التغيرات في الجهاز التنفسي المعلمات القوارض في المختبر القياسية، خاصة قابلة للدراسات طولية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي تجنب الإجراءات الغازية والكيميائيةتحديات ومتطلبات التخدير. وهذا يسمح للباحثين لجمع البيانات الفسيولوجية التي تمثل بشكل وثيق الأحداث التي تحدث بشكل طبيعي وتقليل التباين التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M.
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
