Summary
Vurderingen af respirationsfysiologi har traditionelt påberåbes teknikker, der kræver fiksering eller sedering af dyret. Uhæmmet hele kroppen plethysmografi giver imidlertid præcis, ikke-invasiv, kvantitativ analyse af respirationsfysiologi i dyremodeller. Desuden giver den teknik gentagne respiratoriske vurdering af mus giver mulighed for longitudinelle studier.
Abstract
Respiratorisk dysfunktion er en af de førende årsager til sygelighed og dødelighed i verden og de dødelighed fortsætter med at stige. Kvantitativ vurdering af lungefunktionen i gnavermodeller er et vigtigt redskab i udviklingen af fremtidens behandlingsformer. Almindeligt anvendte metoder til vurdering af respiratorisk funktion, herunder invasiv plethysmografi og tvungen svingning. Mens disse teknikker give værdifulde oplysninger, kan dataindsamlingen være fyldt med artefakter og eksperimenterende variabilitet på grund af behovet for anæstesi og / eller invasiv instrumentering af dyret. I modsætning hertil uhæmmet hele kroppen plethysmografi (UWBP) tilbyder en præcis, non-invasiv, kvantitativ måde ved at analysere respiratoriske parametre. Denne teknik undgår anvendelsen af anæstesi og begrænsninger, der er fælles for de traditionelle plethysmografi teknikker. Denne video vil demonstrere UWBP proceduren herunder udstyr sat op, kalibrering og lungefunktion optagelse. Detvil forklare, hvordan at analysere de indsamlede data, samt identificere eksperimentelle outliers og artefakter, der skyldes flytning af dyr. De respiratoriske parametre opnået ved hjælp af denne teknik omfatter tidalvolumen, minutvolumen, inspiratorisk arbejdscyklus, inspiratorisk flow og forholdet mellem inspiration tid til udløbet tid. UWBP ikke stole på specialiserede kompetencer og er billige at udføre. Et centralt element i UWBP og mest tiltalende for potentielle brugere, er evnen til at udføre gentagne målinger af lungefunktion på det samme dyr.
Introduction
Lunge dysfunktion er en af de førende årsager til sygelighed og dødelighed i verden. Tilstanden er karakteriseret ved utilstrækkelig ilt udveksling, synonymt med hoste, brystsmerter og dyspnø. Respiratorisk sygdom tegner sig for ~ 10% af dødeligheden på verdensplan 1. Ifølge World Health Organization, er dødeligheden vil stige på grund af vedvarende rygning, forurening og erhvervsbetingede irritanter. UWBP er en nyttig tilføjelse til undersøgelse lunge fysiologi, som kraftigt komplimenter traditionel biokemiske og histologiske analyser 2. Andre procedurer, der anvendes til lunge vurdering ikke giver de samme fordele som UWBP. Invasiv plethysmografi er en almindeligt anvendt teknik, der kræver, at dyr, der skal bedøvet 3,4 og dermed ikke nødvendigvis afspejler en naturlig tilstand som følge respiratoriske målinger. Endvidere er kravet om mekanisk ventilation og kemiske udfordringer udelukker fremtidige målinger 3,4.En anden metode til at indsamle respiratorisk data ved tvungen oscillation, som er mere følsom til finere ændringer i respiratoriske parametre i forhold til UWBP 5. Tvungen svingning er imidlertid en invasiv teknik og kræver dyr opsigelse til dataindsamling 5-7.
UWBP indebærer at placere et dyr inde i en specialiseret afdeling. Under inspiration, er tidevandsenergi luft varmes og fugtes i lungerne vanddamptryk stigende og forårsager termisk ekspansion af gas 8. Denne virkning medfører en nettoændring luftmængde skabe en forøgelse i trykket i plethysmograf kammeret 8. Det modsatte sker under udånding skabe en respiratorisk bølgeform fra dyret. Waveform analyse anvendes derefter til at måle fra det respiratoriske spor: respirationsfrekvens (vejrtrækninger / min), total vejrtrækning cyklus tid (sek), inspiration / udløbstid (Ti / Te, sek) og ændringer i trykket på grund af hver tidalvolumen (P T). UWBP giver præcis, non-invasiv, kvantitativ analyse af respirationsfysiologi i dyremodeller og kan anvendes til måling af progression af luftvejssygdomme og lungefunktion 6,9. I modsætning til andre plethysmografi teknikker UWBP undgår brugen af anæstesi, begrænsninger og invasive manipulationer, der producerer artefakter og eksperimentel variabilitet 6,9. Anæstesi kan undertrykke respirationændre puls og kan være udfordrende at regulere 10. Begrænsninger fremkalde en stigning i respiration på grund af yderligere stress via corticosteron og adrenalin frigive 11,13. Det centrale element i UWBP gentages fysiologisk vurdering gør det muligt at foretage longitudinelle studier. UWBP kan stærkt anbefales til den langsgående vurdering af lunge fysiologi og tilbyder en værdifuld færdighed for fremtidig respiratorisk vurdering stof. Bleomycin, ægalbumin, og hypoxi er blevet anvendt til at inducere respiratoriske udfordringer i flere studier og UWBP har med succes målt nøjagtig lunge fysiologiske vurdering 7,9,13-16. Den beskrevne protokol er designet til standard voksen laboratoriemus. Imidlertid har UWBP blevet tilpasset til andre dyr, såsom rotter, marsvin og primater 17-20. UWBP er ikke begrænset kun at vurdere lungedysfunktion men er også blevet brugt til vurdering af lunge modning 3.Alsidighed, enkelhed og reproducerbarhed UWBP har etableret en fremragende teknik til vurdering af pulmonal funktion i dyr. Forskellige software (se materialer og udstyr tabel) vil være forpligtet til at følge denne fremgangsmåde. En erfaren videnskabsmand ville være i stand til at udføre denne protokol med en mus inden for 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende eksperimentelle procedure er godkendt af Det Dyreetiske udvalget på Monash University og udføres i overensstemmelse med den australske Code of Practice for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål (2006). Voksne C57BL / 6 mus, der anvendes til at generere de repræsentative resultater blev opnået fra Monash Animal Services. Musene blev anbragt i et specifikt patogenfri, temperatur og fugtighed kontrolleret rum med en 12 timers lys-mørke-cyklus. Disse mus havde fri adgang til mad og vand.
1. Indledende opsætning
- Slut den bærbare computer / skrivebordet til datafangst maskine til optagelse via et USB-kabel.
- Slut Bridge Forstærker fra "udgang 1 'til' indgang 1" af dataopsamling maskinen via et BNC-kabel.
- Sæt tryktransducer i 'kanal 1 «i oktal Bridge Amp. Drej datafangst maskinen, og åbn analyse software. Den software skal autotisk opdage setup udstyr (se materialer og udstyr tabel).
- Åbne Kanalindstillinger fundet i opsætningen værktøjslinjen af softwaren. Ændre antallet af kanaler, der optages til 1.
- Opsætning af barometeret til at måle rum pres og vandsøjlen apparat at kalibrere Bridge forstærker. Apparat vandsøjlen omfatter to 5 ml serologiske sprøjte pipetter forbundet med plastrør.
- Fyld kolonnerne med vand og sikre vandstanden er balanceret med en lineal. Tilslut et stykke plastslange til toppen af hver pipette. Figur 2 viser vandsøjlen oprettet.
2. Bridge Forstærker kalibrering
Bemærk: For at kalibrere bro forstærker en injektion af luft i vandsøjlen er forpligtet til at skabe en 1 cm H2O afbøjning. Dette vil ske under et enkelt sæt betingelser, og er afhængig af brugerens apparat. Til afklaring disse trin demonstrate hvordan dette laboratorium ville udføre kalibreringen.
- Trække en 1 ml sprøjte til 300 pi; fastgøre sprøjten til stophanen ved enden af slangen på den højre side af vandsøjlen. BEMÆRK: Sørg for, at stophanen er åben til sprøjten, og vandsøjlen, og lukket for luften i rummet. Hvis vandstanden ikke er afbalanceret på dette punkt, drej stophanen, så det er åbent for rumluft og vandsøjlen, vil dette afbalancere vandet. Slangen på venstre side af vandsøjlen skal tilsluttes tryktransduceren at måle trykændringen induceret ved at kaste sprøjten.
- Fastgør slangen fra vandsøjlen på venstre side til stikket på tryktransducer (øverste ring transducer).
- Vælg rullemenuen fundet ved siden af kanal 1 på hovedskærmen på højre side af softwaren og vælg "Bro amp" (se materialer og udstyr tabel).
- Indtastindstillingerne til 5 mV, 20 Hz low pass, skal du markere 'invertsukker' boksen og klik på 'nul'. Klik på 'nul' for at indstille optagelsen på ~ 0 mV. Reducer vinduets størrelse til 4: 1 det nemmere at se.
- Med alt sat op, tryk 1 ml sprøjte, men overlader det til 3 sek. Dette vil vise en pludselig stigning på software, fordi trykket er ændret. Når 300 pi nedtrykkes vil trykket flytte vandet i vandsøjlen 1 cm. Denne kendte værdi vil hjælpe kalibrere Bridge forstærker.
BEMÆRK: trykstigning i kammeret på grund af den 300 pi depression svarer til P K-værdi, der anvendes til senere beregninger. - Vælg "input enheder« findes i nederste venstre hjørne af broen Amp vinduet.
- Fremhæv "baggrund trace" forud for spike ellers kendt som "Zero regionen«.
- Klik på pilen ved siden af 'punkt 1', og dette vil frembringe BACkground signal inden for området -0.002 mV-0,002 mV (værdien vil aldrig være nøjagtigt på 0 mV).
- Indtast "0" i vinduet ved siden af baggrunden signal vinduet.
- Fremhæv "øget pres region graf" fra, når sprøjten er trykket. Klik på pilen ved siden af punkt 2, og værdien bør være inden for rækkevidde af 0,9-1,2 mV.
- Indtast "1" i vinduet ved siden af "øget pres" vinduet. For en visuel afklaring på trin 2.7 og 2.8 se Figur 3. Værdier fundet uden for de specificerede områder kan indikere skader på oktal Bridge Amp.
- Gå til "definerer enheder« findes i øverste højre hjørne af vinduet og vælg "cmH 2 O". Hvis denne indstilling ikke er tilgængelig, kan den indtastes manuelt. Klik på OK.
- Retur til »Bridge Amp menuen (se 2.1). Vælg 1 mV og indstil forstærker til "nul";. Dette vil fuldende kalibrering og vandsøjlen kan sikkert fjernes.
3. Registrering lungefunktion
- Musen (g) afvejes. BEMÆRK: En uge før fysiologisk vurdering introducere musen til det plethysmografi kammer miljø. Dette vil hjælpe i akklimatisering og reducere stress, når de udfører denne procedure på et senere tidspunkt. For en samlet skematisk demonstrerer UWBP opsætning henvises til figur 4.
- Mål kropstemperaturen med en rektal termometer. Smør termometer med vaseline før indføring. Optag temperaturmåling og rengør smøremiddel ud med 80% (v / v) ethanol. Hvis du bruger meget små dyr såsom neonatale museunger, kan den gennemsnitlige kropstemperatur værdi blive fastsat med en infrarød termometer i stedet.
- Placer temperatur / relativ fugtighed sonde på en hul ende af plethysmografi kammeret. Optag temperatur, luftfugtighed og barometric trykket inde i plethysmografi kammer før at placere musen inden.
- Placer musen i plethysmografi kammer, dækker den åbne ende en smule. Dette gør det muligt for musen til at akklimatisere. Kammeret lukkes.
- Med temperatur / fugtighed sonde indsat i den side af plethysmografi kammer med et hul, nu indsætte transduceren og sprøjten i den anden side med de to huller.
- Tryk på 'Start' på programmet og rekord for cirka 15-45 sek. Optag 5-10 sek af data hvor dyret ikke bevæger sig. Bevægelsen vil ændre dyrenes basale respirationsfysiologi og give dårlige resultater. Respiration bør svinge i en lineær bane på programmet. Disse er anvendelige data. Bemærk: vandladning eller afføring kan føre til en stigning i temperatur og luftfugtighed inde i plethysmografi kammeret. Dette vil tilsløre resultater i løbet af analysen. I tilfælde af vandladning eller afføring, stoppe optagelsen straks og rengør plethysmography kammer med 80% (v / v) ethanol. Se figur 6 for en visuel repræsentation af suboptimale resultater, hvor data skal forkastes.
- Efter optagelse i 45 sekunder, skal du trykke på 'Stop' på softwaren (se materialer og udstyr tabel) program. Fjern musen fra plethysmografi kammeret og umiddelbart registrere temperaturen kammeret og fugtighed. Må ikke hele tiden optage i mere end 45 sekunder, da dette kan understrege dyret.
- Retur musen til sit bur, spray og tørre kammeret med 80% (v / v) ethanol.
- Lad kammeret tørre og vende tilbage til basislinjen temperatur og fugtighed før man går videre til den næste mus. Gentag trin 3.1 3.9 for efterfølgende dyr. Bemærk: Hvis flere dyr bliver undersøgt, sikre, at temperaturen kammer og fugtighed tilbagevenden til værdier tæt på baseline før hver ny dyr sættes i kammeret.
4. plethysmografi Analyse
Nejte: At beregne respiratoriske parametre såsom tidalvolumen (V T) og minutvolumen følgende variabler skal måles: respirationsfrekvens (vejrtrækninger / min), total vejrtrækning cyklus tid (sek), inspiration / udløbstid (Ti / Te, sekunder) og trykændring som følge af hver respirationsvolumen (P T). Figur 1 illustrerer de variabler, der kan måles fra et spor. Følgende trin bruge en software (se materialer og udstyr tabellen) for at måle disse variabler. Når man analyserer, undgå områder af spor, der indeholder sniffing eller bevægelse. For reproducerbare resultater, er mindst 5 sekunder god vejrtrækning spor påkrævet. For et eksempel på forskellige vejrtrækning spor se figur 5 og 6.
- Åbne skærmen til fuld skærm, skal du indstille visning til 1: 1 og vælg 5 sek af brugbare data. Et repræsentativt øjebliksbillede af dette er vist i figur 5.
- Åbn mini data pad vindue findes på toppen af program under fanen Datapad. Vælg kanal 1 og vælg 'cyklus målinger «i venstre kolonne og» gennemsnitlig cyklisk højde «i højre kolonne.
- Vælg 'Option' og indstil skalaen for minimum topdetektion til 1 (ms). Dette vil muliggøre detektion af hver spidsværdi og bliver ekstremt vigtigt, når du bruger små dyr, der producerer små svingninger.
- Klik på 'OK'. Dette vil præsentere 'Pressure udbøjningen fra hver tidalvolumen «(P T) måling.
- I mini data pad, skal du vælge 'cyklus målinger «efterfulgt af» begivenhed tæller' og klik 'OK'. Dette vil præsentere den "frekvens" (f) måling.
- Frekvens skal konverteres til vejrtrækninger / min. Dette gøres ved at multiplicere værdien med 60 sek og dividere resultatet med den samlede tid for optagelse (min).
- I mini data pad, vælg 'cyCLE målinger «efterfulgt af» periode «og klik på 'OK'. Dette vil præsentere den »totale vejrtrækning cyklus tid '(t Tot, sek) måling.
- De næste trin bruges til at skabe en macroinstruction at generere peak inspiration og udløbstid værdier. Sørg for, at markøren er direkte over maksimum af top / trug og skrive en kommentar på 9 sekventielle højdepunkter og lavpunkter. Begynd med toppen af svingningen, som vist i figur 5.
- Efterfølgende skal du vælge vindue: data pad og kolonne 1. I det vindue, der vises klik på 'udvælgelse oplysninger "i venstre kolonne,» varighed «i højre kolonne, og klik på' OK '.
- Vælg makro findes i toppen af programmet og derefter starte optagelsen. Nu vælge kommandoer: 'Find', 'OK', 'Start af File ", og klik på" Find ".
- Vælg kommandoer: 'Find' og 'Find kommentarer'. Indtast den samme sætning indtastet til kommentarfeltet i ", der indeholder" boks. Vælg 'Vælg til foregående punkt "fanen og" Find ".
- Vælg kommandoer: 'Føj til data pad'. Dernæst skal du vælge makro: makro-kommandoer og begynde gentag. Gentagelsen tæller vindue, der vises bør fastsættes på 9.
- Vælg kommandoen: 'Find næste ". Vælg kommandoen: 'Føj til data pad'. Endelig skal du vælge makro-kommandoer og ende gentag.
- Vælg nu makroen og stopper optagelsen. Gem og navngive makroen, efter at dyret nummer. BEMÆRK: Opsætning af makro for hvert dyr giver makroen skal bruges til longitudinelle studier og sparer tid.
- Makroen kan nu køre for at få Inspiration (T i) og udløb (T e) tiden mellem hver kommentar. Dataene vises under kanal 1 i Datapad. Udløb og inspiration sker fortløbende og data vises i denne rækkefølge.
- Dataene skal manuelt opdelt i indånding og udånding værdier. Gennemsnittet af fire dataværdier for hver parameter for at opnå den gennemsnitlige Ti og T e.
- Når de primære værdier er afledt af den respirationsvolumen (VT, ml), kan beregnes. For at opnå den respirationsvolumenet ligning Drorbaugh og Fenn 8 anvendes:
V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - P C) - T K (P B - P CORE)))
Hvor
V T: tidalvolumen
P k: Pres udbøjningen hver injektion på 1 ml (Se trin 2.5)
T-kerne: kernetemperatur på hvert dyr
P C: Vand damptryk ved kammertemperatur X Relativ fugtighed i Chamber
T C: temperatur i dyrenes kammer
P kerne: Tryk ved legemstemperatur (vand damptryk ved kropstemperatur x 1,0)
P t: Pres udbøjningen fra hver tidalvolumen
VK: Volume indsprøjtning til kalibrering
P B: barometertryk - Når tidalvolumen er blevet beregnet følgende parametre kan også bestemmes:
- Minut Volumen (ml / min) = V T xf
- Minut Volumen (ml / min / kg) = (V T xf) / Legemsvægt (kg)
- V-T (ml / kg) = V T (ml) / Legemsvægt (kg)
- Inspiratorisk driftscyklus (%) = T i / T Tot
- Inspiratoriske flow (ml / sek) = V T / T i
- Forholdet mellem inspiration tid til udløbet tid = T i / t E
- Samlet cyklustid (sEF) = Inspiration (sek) + Udløbsdato (sek)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne procedure er blevet fulgt korrekt, er en konsekvent oscillerende spor skabt på dataanalyse software. Proceduren giver en respiratorisk spor inden for et par minutter efter opsætning med simple computing beregninger for at bestemme respiratoriske angivne parametre. Figur 5 repræsenterer en passende vejrtrækning spor fra en kontrol (sunde) mus. Passende oscillerende data er produceret, når dyret ikke aktivt bevæger sig.
UWBP er en yderst nyttig og pålidelig vurdering af lungefunktionen mellem kontrol og lungefibrose kohorte. Figur 7 viser lungefunktionen af en mus med bleomycin-induceret lungefibrose på dag 14. I sammenligning med kontrol graf 7 viser en visuel forskel overensstemmelse med bleomycin administration 7. Som tidligere omtalt, kan proceduren gentages tillader os at observere ændringer i luftvejene parameters over tid mellem disse to grupper.
De opnåede resultater udtrykkes som middelværdier ± SEM. Det anbefales at kopiere og indsætte de indsamlede i en simpel Excel-regneark data. Dette vil blive nyttige til at udføre beregninger, der diskuteres i trin 4.13 & 4.14. Respiratoriske funktion kan sammenlignes visuelt mellem to grupper som vist i figur 8.
Figur 1. Forskellige komponenter af vejrtrækning cyklus illustreres ved hjælp af barometriske plethysmografi. Denne graf illustrerer a) ændringen i trykket på grund af inspiration (ΔPi), b) ændringen i trykket på grund af hver tidalvolumen (PT), c) ændre trykket på grund af udløb (ΔPe), d) den samlede vejrtrækning cyklus tid (T til T), e) inspiration (Ti) og f) udløbstid (Te). Klik her for at se et større billede.
Figur 2. Visuel repræsentation af barometer og vandsøjle setup. Figuren er designet til at hjælpe læseren med at oprette barometeret og vandsøjlen for kalibreringen. Bemærk vandet er niveau inden for de to kolonner hjulpet af linealen. De to kolonner er forbundet via 15 cm plastrør. Slangen til højre (65 cm) er forbundet til en 1 ml sprøjte og til venstre (75 cm) tryktransduceren knyttet til dataopsamling maskinen. Bemærk:. Længden af slangen bestemmer lydstyrken (300 ul) kræves for at flytte 1 cm vand Klik her for at sestørre billede.
Figur 3. udføre trin 2.4 og 2.5 for Bridge Amp kalibrering. Denne figur illustrerer de trin 2.7 og 2.8 til kalibrering af udstyret. Det er afgørende at rette Bridge Amp for at opnå præcise resultater. Klik her for at se et større billede.
Figur 4. En samlet skematisk af UWBP opsætningen. Til venstre er den fugtighed / temperatur-probe forbundet med den ene side af plethysmografi kammer indeholdende dyret. Til højre er det kalibreringssprøjte og tryktransducer førendefra plethysmografi kammeret til dataopsamlingssystem producerer en respiratorisk spor på computeren. Klik her for at se et større billede.
Figur 5. Et eksempel på en respiratorisk vejrtrækning spor fra en C57BI / 6 kontrol mus opnået ved anvendelse UWBP. Denne vejrtrækning spor illustrerer relevante, konsistente data fra en kontrol dyr. Ni sammenhængende kommentarer er tilføjet på højdepunkter og lavpunkter af vejrtrækning svingninger for at opnå de respiratoriske parametre, der er anført ved at følge trin 4,1-4,13. Tiden er repræsenteret langs x-aksen (SEC) og trykændringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klik her for at besÃew større billede.
Figur 6. Eksempler på forskellige suboptimale spor opnået fra en C57BI / 6 mus, når du bruger UWBP. Suboptimale resultater kan forveksles som relevante data, og er den mest almindelige kilde til dårlig analyse. Denne figur illustrerer de mest almindelige suboptimale spor, som aldrig bør anvendes til analyse. Disse vejrtrækning spor demonstrere a) En vejrtrækning spor optaget, mens dyret sniffing og bevæger ændre dyrets basale respirationsfysiologi. B) En spor optaget resulterende svingninger gradvis stigende over tid er normalt forårsaget af kondens og fugt opbygge. Imidlertid kan spor korrigeres ved at aftørre plethysmografi kammer med ethanol eller ved at gentage kalibreringstrin. C) Et sporoptaget under plethysmografi kammer bevægelse, mens dyret eller forsker er engagerende med udstyret. Tiden er repræsenteret langs x-aksen (SEC) og trykændringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klik her for at se et større billede.
Figur 7. Et eksempel på en vejrtrækning spor opnået fra en C57BI / 6 mus med induceret lungefibrose, når du bruger UWBP. Denne vejrtrækning spor illustrerer relevante, konsistente data fra et dyr med induceret pulmonal opnået ved brug af UWBP proceduren beskrevet i denne artikel. Ni sammenhængende kommentarer er tilføjet på højdepunkter og lavpunkter af vejrtrækning svingninger for at opnå de respiratoriske parametre, der er anført ved at følge trin 4,1-4,13. Tiden er repræsenterede langs x-aksen (SEC) og trykændringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klik her for at se et større billede.
Figur 8. Åndedrætsværn funktion sammenlignet mellem kontrol og bleomycin udfordret C57BL / 6 mus. Performing plethysmografi analyse efter brug UWBP vil tillade brugeren at lignende resultater, hvad der er repræsenteret her. Denne figur viser de fysiologiske forskelle mellem bleomycin udfordret dyr (stiplede grå linje) og kontroldyr (fast sort linje). Disse grafer viser sammenligninger i a) Udløbsdato (sek), b) Inspiration (sek), c), Inspiration intermittens (%), d) inspiratorisk flow (ml / sek)e) Respirationshastighed (vejrtrækninger / min) f) Minut volumen (ml / min / kg), g), Tidalvolumen (ml / kg) og h) Samlet cyklustid (sek). Lungefunktion blev indsamlet på langs i den samme kohorte af dyr på dag 0, 7 og 14, efter bleomycin udfordring. Repræsentant data er blevet tilpasset fra Murphy et al. (2012) 16. Klik her for at se et større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne teknik er en ikke-invasiv metode til vurdering af respiratoriske parametre for uhæmmet og unanesthetized mus. Styrkerne i denne protokol omfatter dens enkelhed og præcision til at måle lungefunktion på langs med minimal artefakter. Der er dog visse begrænsninger og kritiske trin bemærkes om proceduren. Først og vigtigst af alt, skal musen forblive rolig i kammeret i mindst fem sekunder. Tilføjet stress vil forstyrre vejrtrækning mønster af musen og dermed give variable resultater (figur 6a). Denne ulempe vil sandsynligvis forblive og der kan forventes til tider. Dog erstatter musen i sin hjem-buret og lade det tid til at genbosætte vil nemt rette dette. Det er afgørende, at dyret føler sig godt tilpas i kammeret miljø for at opnå fem sekunder fra relevante / brugbare data. Yderligere overvejelse er nødvendig med hensyn til kammeret miljø. Miljø, unrelated til respiratoriske mekanik, kan have stor indflydelse resultater. Da varigheden af vurdering stiger, fugtighed og temperatur i salen stiger, samt faldende ilt, væsentlig indvirkning på ventilationen. Timingen af ventilation øger luftfugtighed og temperatur i kammeret samt faldende ilt 21. En lille utæthed i kammeret kan hjælpe med at reducere termiske driver oprettet fra varmeproduktion 22,23. Protokollen diskuteret er specifikt for udstyr og instrumenter på listen. Kalibrering af broen forstærker i afsnit to vil afhænge af læserens udstyr. Hvis faktorer såsom slangelængde er anderledes en 300 gl injektion af luft må ikke forårsage en 1 cm.H 2 O afbøjning.
Der er også fysiologiske forskelle afhængigt af tidspunktet for analyse. Gnavere er naturligvis natlige skabninger og døgnrytmen, hvilket i sidste ende generere ændringer iåndedræt, bør tages i betragtning, når timing forsøgene 24. Det er derfor nødvendigt at tid og planlægge forsøgene sådan, at eksperimentelle data kan sammenlignes mellem kohorter. Det er også vigtigt at notere sig spor bevægelse. Hvis svingningerne ikke kører i et lineært mønster, er det normalt på grund af en ophobning af kondensvand eller fugtigheden i kammeret (figur 6b), eller ineffektiv tætning på kammeret. I sidste ende kan disse begrænsninger forklares og UWBP processen udføres hensigtsmæssigt at give præcise respiratorisk måling. Det er også vigtigt at bemærke, at denne metode vil kræve modifikation (mindre kammer størrelse) til måling af respiratoriske ændringer i neonatale standardlaboratoriemetoder mus (fx <2 uger C57BL / 6) for at detektere trykændringer i åndedræt af dyr af denne størrelse .
Selvom UWBP demonstrerer betydelige fordele det også bærer kontroverser.Efterforskere bør sætte sig ind i debatten og træffe en informeret beslutning om, hvorvidt denne teknik er egnet til forskning spørgsmål. Oprindeligt Drorbaugh og Fenn (1955) 8, mente, at en stigning i trykkammeret er forårsaget af inspireret luft bliver opvarmet og befugtet til pulmonale værdier; modsat forekom i udløbet. Dette tillod beregning af tidalvolumen. Efterfølgende forskning fandt, at trykændringer var forårsaget af skiftende alveolære tryk under genereringen af luftstrømmen 25. Dette arbejde erklærede brugen af plethysmografi til beregning modstand i luftvejene. Enhorning et al. (1998) 26 dokumenterede, at tidalvolumen, respirationsfrekvens og luftvejsmodstand alle indflydelse trykfluktuationer indenfor plethysmografi kammer. Når luften i kammeret opvarmes og befugtes til kroppens betingelser tryksvingninger er reduceret med to tredjedele, og forstærkes gennem øgede modstande <sup> 21. Da alle disse komponenter afspejler trykfluktuationer der er uenighed om, hvorvidt målinger af en bestemt respiratoriske parametre er korrekte. Som et resultat er det blevet konkluderet, at tidalvolumen opnås fra plethysmografi er en kvalitativ snarere end kvantitativ vurdering 26. Både øvre og nedre luftvejs modstande er komponenter i plethysmografi systemet skaber usikkerhed i målingen bronkokonstriktion 27. Det er forfatterens opfattelse, at UWBP bør anvendes gensidigt med invasive analyser. Det er i virkeligheden den politik af visse tidsskrifter, manuskripter udelukkende baseret på UWBP data vil ikke blive accepteret. Dette vil være en anden overvejelse for læseren.
Sammenfattende UWBP er en nyttig metode til at måle ændringer i respiratoriske parametre i standardlaboratoriemetoder gnavere, specielt modtagelige for longitudinelle studier. Vigtige fordele ved denne teknik er undgåelse af invasive procedurer, kemiskeudfordringer og krav af anæstesi. Dette gør det muligt for forskerne at indsamle fysiologiske data, der bedst repræsenterer naturligt forekommende begivenheder og reducere eksperimenterende variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M.
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
