Summary
Vurderingen av respiratorisk fysiologi har tradisjonelt stoles på teknikker som krever beherskelse eller sedasjon av dyret. Unrestrained hele kroppen pletysmografi, men gir presis, ikke-invasiv, kvantitativ analyse av respiratorisk fysiologi i dyremodeller. I tillegg, tillater teknikken gjentas respiratorisk vurdering av mus som åpner for langsgående studier.
Abstract
Åndedretts dysfunksjon er en av de viktigste årsakene til sykelighet og dødelighet i verden og dødelighet fortsette å stige. Kvantitativ vurdering av lungefunksjon i gnagermodeller er et viktig verktøy i utviklingen av fremtidige terapier. Vanligvis brukes teknikker for å vurdere lungefunksjon inkludert invasive pletysmografi og tvunget pendling. Selv om disse teknikker gir verdifull informasjon, kan datainnsamlings være fylt med gjenstander og eksperimentell variabilitet på grunn av behovet for anestesi og / eller invasiv instrumentering av dyret. I kontrast, hemningsløs hele kroppen pletysmografi (UWBP) tilbyr en presis, ikke-invasiv, kvantitativ måte ved å analysere luftveis parametere. Denne teknikken unngår bruk av anestesi og begrensninger, noe som er vanlig for tradisjonelle pletysmografi teknikker. Denne videoen vil demonstrere UWBP prosedyren inkludert utstyret satt opp, kalibrering og lungefunksjon opptak. Detvil forklare hvordan å analysere de innsamlede data, samt identifisere eksperimentelle uteliggere og gjenstander som resultater fra dyrebevegelsen. Respiratoriske parametre oppnådd ved bruk av denne teknikken inkluderer tidevolum, minuttvolum, inspirasjonsdriftssyklus, inspiratorisk flow rate og forholdet til inspirasjon tid til utløpstidspunkt. UWBP ikke er avhengig av spesialisert kompetanse og er billig å utføre. Et viktig trekk ved UWBP, og mest tiltalende for potensielle brukere, er evnen til å utføre gjentatte målinger av lungefunksjonen på samme dyr.
Introduction
Lunge dysfunksjon er en av de viktigste årsakene til sykdom og død i verden. Tilstanden er preget av utilstrekkelig oksygenutveksling, synonymt med hoste, brystsmerter og åndenød. Luftveissykdom representerer ~ 10% av dødelighet på verdensbasis en. Ifølge Verdens helseorganisasjon, er dødeligheten satt til å stige på grunn av vedvarende røyking, forurensning og yrkes irritanter. UWBP er et nyttig tillegg til å studere lungefysiologi, som sterkt komplimenter tradisjonelle biokjemiske og histologiske analyser to. Andre prosedyrer som brukes for lunge vurdering ikke gir de samme fordelene som UWBP. Invasiv pletysmografi er en vanlig brukt teknikk som krever at dyret kan bedøvet 3,4 og således, som følge av luftveis målinger er ikke nødvendigvis representativ for en naturlig tilstand. Videre er behovet for mekanisk ventilasjon og kjemiske utfordringer utelukker fremtidige målinger 3,4.En annen fremgangsmåte for å samle inn data respiratorisk er ved tvungen svingning, som er mer følsom for finere forandringer i luftveisparametere sammenlignet med UWBP 5. Tvunget svingning er imidlertid en invasiv teknikk og krever dyr terminering for datainnsamling 5-7.
UWBP innebærer å plassere et dyr inne i et spesialisert kammer. Under inspirasjon, er tidevanns luften varmet og fuktet i lungene økende press vanndamp og forårsaker termisk ekspansjon av gass åtte. Denne effekten fører til en netto endring i luftvolum skaper en økning i trykket i plethysmograph kammeret åtte. Det motsatte skjer under utånding skape en respirasjonssyklusen fra dyret. Waveform analyse blir så brukt til å måle fra luft spor: respirasjonsfrekvens (pust / min), total pustesyklus (sek), inspirasjon / utløpsdato (Ti / Te, sek) og endringer i trykket som følge hver tidevolum (P T). UWBP gir nøyaktig, ikke-invasiv, kvantitativ analyse av respiratorisk fysiologi i dyremodeller, og kan brukes for å måle utviklingen av luftveissykdommer og lungefunksjon 6,9. I motsetning til andre pletysmografi teknikker, unngår UWBP bruk av anestesi, begrensninger og invasive manipulasjoner som produserer gjenstander og eksperimentell variabilitet 6,9. Anestesi kan undertrykke respirasjon,endre hjertefrekvens og kan være utfordrende å regulere 10. Begrensninger indusere en økning i respirasjon på grunn av ekstra stress via corticosterone og adrenalin slipper 11,13. Det sentrale trekk ved UWBP gjentas fysiologiske vurdering gjør det mottagelig for longitudinelle studier. UWBP anbefales sterkt for den langsgående vurdering av lungefysiologi og tilbyr en verdifull kompetanse for fremtidig luft narkotika vurdering. Bleomycin, ovalbumin, og hypoksi har blitt brukt til å indusere luftveis utfordringer i flere studier og UWBP har lykkes målt nøyaktig lunge fysiologiske vurdering 7,9,13-16. Protokollen er beskrevet er beregnet for standard voksen laboratoriemus. Imidlertid har UWBP blitt tilpasset til andre dyr slik som rotter, marsvin, og ikke-humane primater 17-20. UWBP er ikke begrenset bare til å vurdere nedsatt lungefunksjon, men har også blitt brukt for vurdering av lungemodnings tre.Allsidighet, enkelhet og reproduserbarhet UWBP har etablert en utmerket teknikk for å vurdere lungefunksjonen hos dyr. Diverse programvare (se materialer og utstyr tabellen) vil bli pålagt å følge denne prosedyren. En erfaren forsker ville være i stand til å utføre denne protokollen med en mus innen 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende eksperimentelle prosedyren er godkjent av dyreetikk Utvalget ved Monash University og utført i samsvar med den australske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål (2006). Voksne kvinnelige C57BL / 6 mus som brukes til å generere representative resultater ble oppnådd fra Monash Animal Services. Musene ble plassert i et bestemt patogen frie, temperatur og fuktighetskontrollert rom med en 12 timers lys-mørke-syklus. Disse musene hadde fri tilgang til mat og vann.
1. Grunn oppsett
- Koble laptop / desktop til datainnsamling maskin for opptak via en USB-kabel.
- Koble Bridge Forsterker fra 'utgang 1' til 'inngang 1 "av datainnsamling maskin via en BNC kabel.
- Sett trykkgiveren til "kanal 1" av Oktal Bridge Amp. Snu datainnsamling maskinen og åpne analyse programvare. Programvaren skal automatisk oppdage utstyret oppsettet (se materialer og utstyr tabell).
- Åpen kanal innstillinger funnet i oppsett verktøylinjen av programvaren. Endre antall kanaler blir tatt opp til 1.
- Sett opp barometer for å måle apparatet vannsøylen for å kalibrere Bridge Amplifier rom press og. Apparat vannsøylen inkluderer to 5 ml serologiske sprøyte pipetter forbundet med plastrør.
- Fyll kolonnene med vann og sikre vannstanden er avbalansert med en linjal. Koble ett stykke av plastrøret til toppen av hver pipette. Figur 2 viser vannsøylen satt opp.
2. Bridge Forsterker Kalibrering
Merk: For å kalibrere broen forsterker en injeksjon av luft i vannsøylen er nødvendig for å skape en 1 cm H 2 O nedbøyning. Dette vil skje under ett sett av betingelser, og er avhengig av brukerens apparat. For avklaring disse trinnene demonstrate hvordan dette laboratoriet ville utføre kalibreringen.
- Trekk en 1 ml sprøyte til 300 mL; feste sprøyten til stengeventilen ved utløpet av slangen på høyre side av vannsøylen. MERK: Kontroller at vannkranen er åpen for sprøyten og vannsøylen, og stengt for luften i rommet. Hvis vannstanden ikke er balansert på dette punktet, slår stoppekranen slik at det er åpent for rommet luft og vannsøylen, vil dette balansere vannet. Den rør på venstre side av vannsøylen skal være koblet til trykkgiver for å måle endringen i trykket indusert ved å dyppe sprøyten.
- Fest slangen fra vannsøylen på venstre side til kontakten på trykkgiver (toppringen av svingeren).
- Velge rullegardinmenyen funnet ved siden av kanal 1 på hovedskjermen på høyre side av programvaren og velg "Bridge amp" (se materialer og utstyr tabell).
- Enterinnstillingene til 5 mV, 20 Hz low pass, merk den "invert" boksen og klikk "null". Klikk "null" for å sette sporings på ~ 0 mV. Reduser vindusstørrelsen til 4 på: 1 for enklere visning.
- Med alt satt opp, trykk ned en ml sprøyte, slik at det for 3 sek. Dette vil vise en plutselig pigg på programvaren fordi trykket har endret seg. Når de 300 ul trås trykket vil bevege seg i vannet i vannsøylen med 1 cm. Dette kjente verdien vil hjelpe kalibrere Bridge forsterker.
MERK: trykkøkning i kammeret på grunn av den 300 mL depresjon tilsvarer P K-verdien som brukes for senere beregninger. - Velg 'inngangs enhetenes funnet på nedre venstre hjørne av Bridge Amp vinduet.
- Marker "bakgrunnen trace" før pigg ellers kjent som "Zero-regionen".
- Klikk på pilen ved siden av 'punkt 1' og dette vil produsere background signal innenfor området fra -0,002 0,002 mV mV-(verdien aldri vil være nøyaktig på 0 mV).
- Type '0' i vinduet tilstøtende til bakgrunnssignalet vinduet.
- Marker "økt press regionen graf" fra når sprøyten er deprimert. Klikk på pilen ved siden av punkt 2 og verdien bør være innenfor rekkevidde av 0,9 til 1,2 mV.
- Type '1' i vinduet ved siden av "forhøyet trykk"-vinduet. For en visuell avklaring på trinn 2.7 og 2.8 se Figur 3. Verdier funnet utenfor området som er angitt kan indikere skade på Oktal Bridge Amp.
- Gå til "definere enheter 'funnet øverst i høyre hjørne av vinduet og velg" CMH 2 O ". Hvis dette alternativet ikke er tilgjengelig, kan det legges inn manuelt. Klikk ok.
- Gå tilbake til "Bridge Amp-menyen (se 2.1). Velg en mV og satt forsterker til "null";. Dette vil fullføre kalibrering og vannsøylen kan trygt tas ut.
3. Opptaks lungefunksjon
- Vei mus (g). MERK: En uke før fysiologiske vurdering introdusere musen til pletysmografi kammermiljøet. Dette skal hjelpe til akklimatisering og redusere stress når du utfører denne prosedyren på et senere tidspunkt. For en samlet skjematisk demonstrere UWBP oppsett, se figur 4.
- Mål kroppstemperatur med et rektalt termometer. Smør termometeret med vaselin før innsetting. Noter temperaturavlesning og rense smøremiddelet med 80% (v / v) etanol. Ved bruk av svært små dyr som neonatale mus pups, kan den midlere kroppstemperaturverdi bestemmes med en infrarød termometer stedet.
- Plasser temperatur / relativ fuktighet probe på den ene hull ende av pletysmografi kammeret. Registrere temperatur, fuktighet og barometric trykket inne i kammeret pletysmografi før anbringelse av mus innenfor.
- Plasser musen i pletysmografi kammer, dekker den åpne enden litt. Dette gjør at musen til å akklimatisere. Lukk kammeret.
- Ved en temperatur / fuktighet probe innsatt i siden av pletysmografi kammer med et hull, nå sett transduseren og sprøyten i den andre siden med de to hullene.
- Trykk Start på programmet og gjør opptak i ca 15-45 sek. Record 5-10 sek av data der dyret ikke er i bevegelse. Bevegelsen vil endre dyrets basal luft fysiologi og gi dårlige resultater. Åndedrett bør svinge i en lineær sti på programmet. Dette er brukbare data. Merk: vannlating eller avføring kan føre til en økning i temperatur og fuktighet inne i kammeret pletysmografi. Dette vil skjule resultatene under analysen. Ved vannlating eller avføring, stoppe opptaket umiddelbart og rengjør plethysmography kammer med 80% (v / v) etanol. Se Figur 6 for en visuell representasjon av suboptimale resultater, hvor data skal bli avvist.
- Etter innspillingen for 45 sek, trykk "Stopp" på programvaren (se materialer og utstyr tabell) program. Fjern musen fra pletysmografi kammeret og umiddelbart ta opp kammeret temperatur og fuktighet. Ikke kontinuerlig opp i mer enn 45 sek, da dette kan stresse dyret.
- Returnere musen til buret sitt, spray og tørk kammeret med 80% (v / v) etanol.
- Tillat kammeret for å tørke og opprinnelig temperatur og fuktighet før fortsetter videre til neste mus. Gjenta trinn 03.01 til 03.09 for påfølgende dyr. Merk: Hvis flere dyr er under utredning, sikre at kammeret temperatur og fuktighet tilbake til baselineverdiene i før hver ny dyr blir satt i kammeret.
4. pletysmografi Analyse
NeiTe: For å beregne respiratoriske parametre som tidevolum (V T) og minuttvolum følgende variabler må måles: respirasjonsfrekvens (pust / min), total pustesyklus (sek), inspirasjon / utløpsdato (Ti / Te, sekunder) og trykkendring på grunn av hver tidevolumet (P T). Figur 1 illustrerer de variable som kan måles fra et spor. Følgende trinn bruker en programvare (se materialer og utstyr tabell) for å måle disse variablene. Når du analyserer, unngå regioner av spor som inneholder sniffing eller bevegelse. For reproduserbare resultater, er minst 5 sekunder med god puste spor nødvendig. For et eksempel på ulike puste spor se Figur 5 og 6.
- Åpne skjermen til full skjerm, satt visning til 1: 1 og velg 5 sek av brukbare data. Et representativt bilde av dette er vist i figur 5.
- Åpne mini data pad vindu funnet på toppen av program i kategorien DataPad. Velge kanal 1 og velg "syklus målinger" i venstre kolonne og "gjennomsnittlig syklisk høyde 'i høyre kolonne.
- Velg "Option" og sette skalaen for minimum peak deteksjon til 1 (msek). Dette vil tillate påvisning av alle toppverdi og blir ekstremt viktig når du bruker små dyr som produserer små svingninger.
- Klikk 'OK'. Dette vil presentere 'Trykk nedbøyning på grunn av hver tidevolum' (P T) måling.
- I mini data pad, velger 'sykkel målinger "fulgt av" event count "og klikk" OK ". Dette vil presentere 'frekvens' (f) målingen.
- Frekvens må konverteres til åndedrag / min. Dette gjøres ved å multiplisere verdien med 60 sek og dividere svaret ved den samlede tid for opptaket (min).
- I mini data pad, velger 'cycle målinger 'etterfulgt av' periode 'og klikk på' OK '. Dette vil presentere den "totale pustesyklus tid '(T tot, sek) måling.
- De neste trinnene brukes til å lage en macroinstruction å generere maksimal inspirasjon og utløpstidsverdier. Sørg for at markøren er direkte over maksimalt toppen / bunnen og legge til en kommentar på 9 sekvensielle topper og bunner. Begynn med toppen av den svingning som vist i figur 5.
- Deretter velger du vindu: data pad og kolonne 1. I vinduet som kommer opp klikk "valg informasjon" i venstre spalte, "varighet" i høyre kolonne og klikk 'OK'.
- Velg makro funnet på toppen av programmet og deretter starte innspillingen. Nå velger kommandoer: "Finn", "gå", "Start av File" og klikk "Finn".
- Velge kommandoer: "Finn" og "Finn kommentarer '. Skriv inn samme setning skrevet for kommentarboksen i 'inneholder' boksen. Velg 'Velg å Forrige Point "fanen og" Finn ".
- Velge kommandoer: "Legg til data pad". Deretter velger makro: makrokommandoer og begynne gjenta. Gjentakelsestellingen vinduet som vises bør settes på ni.
- Velg kommando: 'Finn neste ". Velg kommando: 'Legg til data pad ". Til slutt velger makro kommandoer og end repeat.
- Nå velger makro og stoppe opptaket. Lagre og navngi makroen etter at dyret nummeret. MERK: Sette opp makro for hvert dyr gjør at makroen skal brukes for longitudinelle studier og sparer tid.
- Makroen kan nå kjøres for å få inspirasjon (T i) og utløps (T e) tid mellom hver kommentar. Dataene vises under kanal 1 av datapad. Utløp og inspirasjon skjer fortløpende og dataene vil vises i denne rekkefølgen.
- Dataene må manuelt delt inn inspirasjon og utløps verdier. Gjennomsnittlig de fire dataverdier for hver parameter for å oppnå gjennomsnittlig T i og T e.
- Når de primære verdiene er avledet av tidevolumet (V T, ml) kan beregnes. For å få den tidevolum ligningen for Drorbaugh og Fenn 8 er brukt:
V T (ml) = (P-T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - P C) - T C (P B - P CORE)))
Hvor
V T: tidevolum
P k: Trykk nedbøyning på grunn av hver injeksjon av 1 ml (Se trinn 2.5)
T kjerne: Kjernetemperatur for hvert dyr
P C: Vann damptrykk ved kammertemperatur X Relativ luftfuktighet i chamber
T C: temperaturen i dyre kammer
P Kjerne: Trykk ved kroppstemperatur (vanndamptrykk ved kroppstemperatur x 1,0)
P t: Trykk nedbøyning på grunn av hver tidevolum
V k: Volume injeksjon for kalibrering
P B: Barometertrykk - Når tidevolum er beregnet følgende parametere kan bestemmes:
- Minuttvolum (ml / min) = V T XF
- Minuttvolum (ml / min / kg) = (V T XF) / Kroppsvekt (kg)
- V T (ml / kg) = V T (ml) / Kroppsvekt (kg)
- Inspirasjons Duty Cycle (%) = T i / T tot
- Inspirasjons Flow Rate (ml / sek) = V T / T i
- Forhold av inspirasjon tid til utløpstiden = T i / T e
- Total syklustid (sec) = Inspirasjon (sek) + utløps (sek)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne prosedyren er fulgt på riktig måte, er en konsekvent oscillerende spor opprettet på dataanalyse programvare. Prosedyren gir en luftveis spor i løpet av få minutter etter oppsett med enkle databeregninger for å bestemme luftveis parametre oppført. Figur 5 representerer en egnet åndedretts spor fra en kontroll (sunn) mus. Hensiktsmessig oscillerende data fremkommer når dyret ikke er aktivt i bevegelse.
UWBP er et ekstremt nyttig og pålitelig vurdering av lungefunksjonen mellom kontroll og lungefibrose kohort. Figur 7 demonstrerer lungefunksjonen av en mus med bleomycin-induserte lungefibrose hos dag 14. I forhold til kontrolldiagram, figur 7 illustrerer en visuell forskjell forenlig med bleomycin administrasjon 7. Som diskutert tidligere, kan fremgangsmåten gjentas tillater oss å observere endringer i luftveiene parameteretrs over tid mellom disse to grupper.
Resultatene som oppnås er å bli uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Det anbefales å kopiere og lime inn data samlet inn i en enkel Excel-regneark. Dette vil bli nyttig for utførelse av beregninger er diskutert i trinn 4,13 & 4,14. Åndedretts funksjon kan sammenlignes visuelt mellom to grupper som vist i figur 8.
Figur 1. Ulike komponenter av pustesyklusen illustreres ved hjelp av det barometriske pletysmografi. Denne grafen viser a) en trykkforandring på grunn av inspirasjons (ΔPi), b) en trykkendring på grunn av hver tidevolumet (PT), c) endre på trykk på grunn av utløp (ΔPe), d) total pustesyklus tid (topp mot topp), e) inspirasjon tid (Ti) og f) utløpstid (Te). Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. visuell representasjon setup barometeret og vannsøyle på. Figuren er laget for å hjelpe leseren med å sette opp barometer og vannsøylen for kalibreringsprosessen. Legg merke til vannet er nivået i løpet av de to kolonnene hjulpet av linjalen. De to kolonner er forbundet via 15 cm av plastrør. Røret til høyre (65 cm) er forbundet med en 1 ml sprøyte og til venstre (75 cm) trykktransduseren knyttet til datainnsamlings maskinen. Obs. Slangelengde bestemmer volum (300 ul) som kreves for å bevege en cm vann for å visestørre bilde.
Figur 3. gjennomføre punkt 2.4 og 2.5 av Bridge Amp Kalibrering. Denne figuren illustrerer de trinn 2.7 og 2.8 for kalibrering av utstyret. Det er avgjørende å korrigere Bridge Amp å få nøyaktige resultater. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. En samlet skjematisk av UWBP oppsett. Til venstre er fuktigheten / temperaturføler som er koblet til den ene siden av pletysmografi kammeret inneholder dyret. Til høyre er kalibreringssprøyte og trykkgiver ledendefra pletysmografi kammeret til datainnsamlingssystemet som produserer en respiratorisk spor på maskinen. for å vise større bilde.
Figur 5. Et eksempel på en respiratorisk åndedretts spor fra C57BL / 6 mus kontroll oppnås ved anvendelse av UWBP. Denne puste spor illustrerer egnede, konsistente data fra et kontrolldyr. Ni sammenhengende kommentarer er lagt på toppene og bunnene av puste svingninger å hente de respiratoriske parametre oppført ved å følge trinn 04.01 til 04.13. Tid er representert langs x-aksen (sek) og trykkendringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klikk her for å VIew større bilde.
Figur 6. Eksempler på ulike suboptimale spor hentet fra en C57BL / 6 mus når du bruker UWBP. Suboptimale resultater kan forveksles som egnede data og er den vanligste kilden for dårlig analyse. Denne figuren illustrerer de mest vanlige suboptimale spor som aldri bør benyttes for analyse. Disse puste spor demonstrere a) En pust kurve registrert mens dyret er sniffing og flytte endre dyrets basal luft fysiologi. B) En kurve registrert resulterer svingninger gradvis økende over tid er vanligvis forårsaket av kondens og fuktighet bygge opp. Imidlertid, kan sporingen bli korrigert ved å tørke den pletysmografi kammer med etanol, eller ved å gjenta fremgangsmåten kalibrerings. C) Et sporinnspilt i løpet pletysmografi kammer bevegelse mens dyret eller forsker er engasjerende med utstyret. Tid er representert langs x-aksen (sek) og trykkendringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klikk her for å se større bilde.
Figur 7. Et eksempel på en puste spor oppnådd fra en C57BL / 6 mus med indusert pulmonal fibrose ved bruk UWBP. Denne puste spor illustrerer egnede, konsistente data fra et dyr med indusert pulmonal oppnås ved bruk av UWBP fremgangsmåten beskrevet i denne artikkelen. Ni sammenhengende kommentarer er lagt på toppene og bunnene av puste svingninger å hente de respiratoriske parametre oppført ved å følge trinn 04.01 til 04.13. Nå er representert langs x-aksen (sek) og trykkendringer langs y-aksen (cm.H 2 O). Klikk her for å se større bilde.
Figur 8. lungefunksjon sammenlignet mellom kontroll og bleomycin utfordret C57BL / 6 mus. Utføre pletysmografi analyse etter bruk UWBP vil tillate brukeren å resultater som ligner på det som er representert her. Denne figuren viser de fysiologiske forskjellene mellom bleomycin utfordret dyr (stiplet grå linje) og kontroll dyr (solid svart linje). Disse grafene viser sammenligninger i a) Utløps (sek), b) Inspirasjon (sek), c) Inspirasjon driftssyklus (%), d) Inspirasjonsstrømningshastighet (ml / sek)e) Respirasjonsfrekvens (pust / min), f) Minutt volum (ml / min / kg), g) Tidevolum (ml / kg) og h) Total syklus (sek). Lungefunksjons data ble samlet i lengderetningen i samme kohort av dyr på dag 0, 7 og 14 etter bleomycin utfordring. Representative data har blitt tilpasset fra Murphy et al. (2012) 16. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken som beskrives her er en ikke-invasiv metode for vurdering av respiratoriske parametrene for uhemmet og unanesthetized mus. Styrkene i denne protokollen inkludere sin enkelhet og presisjon for å måle lungefunksjonen i lengderetningen med minimale gjenstander. Det er imidlertid noen begrensninger og kritiske trinn skal noteres om fremgangsmåten. Først og viktigst, må det muse forbli rolig i kammeret i minst fem sekunder. Lagt stress vil forstyrre pustemønster av musen, og dermed gi varierende resultater (figur 6A). Denne ulempen vil trolig forbli og er å forvente til tider. Men erstatte musen i sitt hjem-buret og la det på tide å omplassere vil lett korrigere dette. Det er avgjørende at dyret føler seg komfortabel i kammeret miljø for å skaffe fem sekunder av passende / brukbare data. Videre vurdering er nødvendig når det gjelder kammermiljøet. Miljø, unrelated til luftveis mekanikk, i betydelig grad kan påvirke resultatene. Ettersom varigheten av vurderings øker, fuktigheten og temperaturen i kammeret økes, så vel som å redusere tilgjengelig oksygen, i betydelig grad virket inn på ventilasjon. Tidspunktet for ventilasjonen øker luftfuktigheten og temperaturen i kammeret samt avtagende tilgjengelig oksygen 21. En liten lekkasje i kammeret kan hjelpe til å redusere termiske fonner opprettet fra varmeproduksjon 22,23. Protokollen diskutert er spesifikk for utstyr og instrumentering oppført. Kalibrering av broen forsterker i to avsnitt vil være avhengig av leserens utstyr. Hvis faktorer som den slangelengde er forskjellige et 300 pl injeksjon av luft kan ikke forårsake en 1 cm.H 2 O avbøyning.
Det er også fysiologiske forskjeller avhengig av tid for analyse. Gnagere er naturlig nattdyr og biologiske sykluser, som til slutt generere endringer irespirasjon, bør tas i betraktning når timing forsøkene 24. Det er derfor nødvendig å tid og planlegger forsøkene slik at eksperimentelle data kan være nøyaktig forhold mellom kohorter. Det er også viktig å ta oppmerksom på sporet bevegelse. Dersom svingningene ikke er i drift i et lineært mønster, er det vanligvis på grunn av en opphopning av kondens eller fuktighet i kammeret (figur 6b), eller ineffektiv forsegling på kammeret. Til syvende og sist, kan disse begrensningene gjøres rede for og UWBP prosessen utføres på riktig måte for å gi presis luftmåling. Det er også viktig å merke seg at denne metoden vil kreve modifikasjon (mindre kammer størrelse) for måling av forandringer i luftveis neonatal standard laboratoriemus (f.eks, <2 uker C57BL / 6) for å påvise trykkforandringer i stoffskiftet hos dyr av at størrelsen .
Selv UWBP viser betydelige fordeler det bærer også uenighet.Etterforskerne bør gjøre seg kjent med debatten og ta en avgjørelse på om denne teknikken er hensiktsmessig for problemstillingen. I utgangspunktet Drorbaugh og Fenn (1955) 8 antatt at en økning i kammertrykket er forårsaket av inspirert luft blir varmet og fuktet til pulmonale verdier; det motsatte skjedde i utløpet. Dette tillot beregning av tidevolum. Senere forskning mente at trykkforandringer ble forårsaket ved å endre alveolar press under generering av luftstrømmen 25. Dette arbeidet er angitt bruk av pletysmografi for beregning av luftveismotstanden. Enhorning et al. (1998) 26 gitt bevis for at tidevolum, respirasjonsfrekvens og luftveismotstand alle innflytelse trykksvingninger innenfor pletysmografi kammeret. Når luften i kammeret oppvarmes og fuktes med kroppsbetingelser trykksvingninger er redusert med to tredjedeler, og forsterkes gjennom økte motstands <sup> 21. Som alle disse komponentene reflektere trykksvingninger er det uenighet om målinger av en bestemt respiratoriske parametre er nøyaktige. Som et resultat er det blitt konkludert med at tidevolum oppnådd fra pletysmografi er en kvalitativ stedet for kvantitativ vurdering 26. Både øvre og nedre luftveismotstanden er komponenter av pletysmografi system skaper usikkerhet i måling bronchoconstriction 27. Det er forfatterens mening at UWBP bør brukes gjensidig med invasive analyser. Det er faktisk politikken av visse tidsskrifter som manuskripter utelukkende basert på UWBP data vil ikke bli akseptert. Dette vil være en annen vurdering for leseren.
Oppsummert er UWBP en nyttig metode for å måle endringer i respiratoriske parametre i standard laboratorie gnagere, spesielt mottagelig for longitudinelle studier. Viktige fordeler med denne teknikken er unngåelse av invasive prosedyrer, kjemiskutfordringer og kravet til anestesi. Dette gjør forskerne å samle fysiologiske data som best representerer naturlig forekommende hendelser og redusere eksperimentell variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
