Summary
Bedömningen av andningsfysiologi har traditionellt förlitat sig på teknik, som kräver återhållsamhet eller sedering av djuret. Ohämmad helkropps pletysmografi tillhandahåller emellertid exakt, icke-invasivt, kvantitativ analys av andningsfysiologi i djurmodeller. Dessutom gör tekniken upprepade andnings bedömning av möss som möjliggör longitudinella studier.
Abstract
Andnings dysfunktion är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen och dödligheten fortsätter att stiga. Kvantitativ bedömning av lungfunktionen i gnagarmodeller är ett viktigt verktyg i utvecklingen av framtida behandlingar. Vanligt använda metoder för att bedöma andningsfunktion inklusive invasiv pletysmografi och tvångs svängning. Även om dessa tekniker ge värdefull information, kan datainsamling vara förenat med artefakter och experimentell variation på grund av behovet av anestesi och / eller invasiv instrumentering av djuret. Däremot ohämmad hela kroppen pletysmografi (UWBP) erbjuder en exakt, icke-invasiv, kvantitativt sätt genom att analysera andningsparametrar. Denna teknik undviker användningen av anestesi och begränsningar, som är gemensam för traditionell pletysmografi tekniker. Denna video kommer att visa UWBP förfarandet inklusive utrustning inrättas, kalibrering och lungfunktion inspelning. Detkommer att förklara hur man analyserar insamlade data, samt identifiera experimentella extremvärden och artefakter som är resultatet av djurförflyttningar. Andnings parametrarna, som erhölls med denna teknik inkluderar tidalvolym, minutvolym, inandningsarbetscykel, inandningsflödet och förhållandet mellan inspiration då och förfallotiden. UWBP inte förlitar sig på specialiserade kunskaper och är billig att utföra. En viktig egenskap hos UWBP och mest tilltalande för potentiella användare, är förmågan att utföra upprepade mätningar av lungfunktionen på samma djur.
Introduction
Lung dysfunktion är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen. Tillståndet kännetecknas av bristande syreutbyte, synonymt med hosta, bröstsmärtor och andnöd. Andnings konton sjukdoms för ~ 10% av dödligheten i världen 1. Enligt Världshälsoorganisationen, är dödligheten kommer att öka på grund av ihållande rökning, föroreningar och yrkes irriterande. UWBP är ett bra komplement för att studera lungfysiologi, som starkt komplimanger traditionella biokemiska och histologiska analyser 2. Andra metoder som används för lung bedömning ger inte samma fördelar som UWBP. Invasiv pletysmografi är en vanligt förekommande teknik som kräver att djur som ska anestesi 3,4 och därmed resulterande andnings mätningar inte nödvändigtvis reflekterar ett naturligt tillstånd. Vidare kravet på mekanisk ventilation och kemiska utmaningar utesluter framtida mätningar 3,4.En annan metod för att samla in andningsdata är genom påtvingad svängning, vilken är mer känslig för finare förändringar i respiratoriska parametrar jämfört med UWBP 5. Tvingad svängning är dock en invasiv teknik och kräver djur uppsägning för datainsamling 5-7.
UWBP innebär att placera ett djur i en specialiserad kammare. Under inspiration, är det tidvatten luften värms och fuktas i lungorna ökar vatten ångtryck och orsakar termisk expansion av gas 8. Denna effekt orsakar en nettoförändring i luftvolymen skapar en ökning av trycket inuti pletysmografen kammaren 8. Det motsatta inträffar under utandning skapar en andningsvågform från djuret. Wave analys används sedan för att mäta från andnings spår: andningsfrekvens (andetag / min), total andningscykel (sek), inspiration / utgångstiden (Ti / Te, sek) och förändringar i tryck på grund av varje tidalvolym (P T). UWBP ger exakt, icke-invasiv, kvantitativ analys av andningsfysiologi i djurmodeller och kan användas för att mäta utvecklingen av luftvägssjukdomar och lungfunktion 6,9. I motsats till andra pletysmografi tekniker, UWBP undviker användningen av anestesi, begränsningar och invasiva manipulationer som producerar artefakter och experimentell variabilitet 6,9. Anestesi kan undertrycka andning,förändrar hjärtfrekvens och kan vara en utmaning att reglera 10. Begränsningar inducerar en ökning av andningen på grund av ytterligare stress via kortikosteron och adrenalin släpper 11,13. Det viktigaste inslaget i UWBP upprepas fysiologisk bedömning gör den mottaglig för longitudinella studier. UWBP rekommenderas starkt för längsgående bedömning av lungfysiologi och erbjuder en värdefull färdighet för framtida andningsdrogbedömning. Bleomycin, ovalbumin, och hypoxi har använts för att inducera utmaningar respirator i flera studier och UWBP har framgångsrikt mätas exakt lunga fysiologisk bedömning 7,9,13-16. Protokollet som beskrivs är avsedd för vanliga vuxna laboratoriemöss. Emellertid har UWBP anpassats till andra djur, såsom råttor, marsvin, och icke-mänskliga primater 17-20. UWBP är inte begränsad enbart till att bedöma pulmonell dysfunktion, men har också använts för bedömningen av lungmognad 3.Den mångsidighet, enkelhet och reproducerbarhet UWBP har etablerat en utmärkt teknik för att bedöma lungfunktionen hos djur. Olika program (se material och utrustning tabell) kommer att krävas för att följa den här proceduren. En erfaren vetenskapsman skulle kunna utföra detta protokoll med en mus inom 1 timme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande experimentella förfarandet godkänns av djuretikkommittén vid Monash University och genomförs i enlighet med den australiska uppförandekod för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål (2006). Vuxna C57BL / 6 möss som används för att generera de representativa resultat erhölls från Monash Animal Services. Mössen inhystes i en specifik patogenfri, kontrollerad temperatur och luftfuktighet rum med en 12 h ljus-mörker-cykel. Dessa möss hade fri tillgång till mat och vatten.
1 Inledande installation
- Anslut den bärbara datorn / skrivbordet till datainsamling maskinen för inspelning via en USB-kabel.
- Anslut Bridge förstärkare från "utgång 1" till "ingång 1" av datainsamling maskinen via en BNC-kabel.
- Sätt i tryckgivaren i "kanal 1" av Octal Bridge Amp. Vrid datainsamling maskinen och öppna analysprogram. Programvaran ska autotiskt upptäcka utrustningen installationsprogrammet (se material och utrustning tabell).
- Öppna Kanalinställningar som finns i inställnings verktygsfältet av programvaran. Ändra antalet kanaler som spelas in till 1.
- Ställ in barometern för att mäta rumstryck och vattenpelaren apparaten för att kalibrera Bridge förstärkare. Vattenmassan apparaten innefattar två 5 ml serologiska sprutpipetter som förbinds med plaströr.
- Fyll kolonnerna med vatten och se till att vattennivåerna är balanserade med en linjal. Anslut en bit plastslang till toppen av varje pipett. Figur 2 visar vattenmassan inrättas.
2 Bridge Förstärkare Kalibrering
OBS: För att kalibrera bryggförstärkaren en injektion av luft i vattenmassan krävs för att skapa en 1 cm H2O nedböjning. Detta kommer att ske under en enda uppsättning förhållanden och är beroende av användarens apparat. För förtydligande dessa steg demonstrate hur detta laboratorium skulle utföra kalibreringen.
- Dra en 1 ml spruta till 300 l; Fäst sprutan vid kranen i slutet av slangen på höger sida av vattenmassan. OBS: Se till att kranen är öppen för sprutan och vattenmassan, och stängde till rumsluften. Om vattennivån inte är balanserade på denna punkt, vrid kranen så att den är öppen för rumsluft och vattenmassan, kommer detta att balansera vattnet. Slangen på vänster sida av vattenpelaren ska anslutas till tryckgivaren för att mäta förändringen i trycket inducerad av störta sprutan.
- Anslut slangen från vattnet på vänster sida till kontakten på tryckgivaren (övre ringen på givaren).
- Välj rullmenyn finns bredvid kanal 1 på huvudskärmen på höger sida av programmet och välj "Bridge amp" (se material och utrustning tabell).
- Enterinställningarna till 5 mV, 20 Hz lågpass, kryssa i "invertera" rutan och klicka på "noll". Klicka på "noll" för att ställa in spår vid ~ 0 mV. Minska fönstrets storlek till 4: 1 för enklare visning.
- Med allt ställa in, tryck 1 ml sprutan och lämnar den i 3 sek. Detta kommer att visa en plötslig spik på programvaran eftersom trycket har förändrats. När 300 | il är nedtryckt kommer trycket att flytta vattnet i vattenmassan genom en cm. Det kända värdet kommer att hjälpa kalibrera Bridge förstärkare.
OBS: Den ökade trycket i kammaren på grund av den 300 ^ il fördjupning motsvarar den P K-värde som används för senare beräkningar. - Välj "inmatningsenheter" som finns på den nedre vänstra hörnet av bron Amp fönstret.
- Markera "bakgrundsspår" innan spiken annars känd som "Zero Regionen".
- Klicka på pilen bredvid "punkt 1", och detta kommer att ge den background signal inom intervallet -0.002 mV-0.002 mV (värdet kommer aldrig att vara exakt vid 0 mV).
- Skriv '0' i fönstret intill bakgrundssignalen fönstret.
- Markera "ökat tryck region diagram" från när sprutan är nedtryckt. Klicka på pilen bredvid till punkt 2 och värdet bör ligga i intervallet 0,9-1,2 mV.
- Skriv "1" i fönstret bredvid "ökat tryck" fönstret. För en visuell klargörande steg 2.7 och 2.8 se Figur 3. Värden som finns utanför de intervall som anges kan tyda på skador på Octal Bridge Amp.
- Gå till "definiera enheter" längst upp till höger i fönstret och välj "cmH 2 O". Om det här alternativet inte är tillgängligt, kan det skrivas in manuellt. Klicka på OK.
- Gå tillbaka till "Bridge Amp"-menyn (se 2.1). Välj 1 mV och ställ förstärkaren till "noll";. Detta kommer att slutföra kalibreringen och vattnet kan säkert tas bort.
3 Inspelning Lung Function
- Väg den mus (g). OBS: En vecka före fysiologisk bedömning införa musen till pletysmografi kammarmiljön. Detta kommer att hjälpa till acklimatisering och minska stress när de utför denna procedur vid ett senare tillfälle. För en övergripande schema demonstrerar UWBP installation, se Figur 4.
- Mät kroppstemperaturen med en rektal termometer. Smörj termometer med vaselin före införandet. Anteckna den uppmätta temperaturen och rengör smörjmedlet bort med 80% (vol / vol) etanol. Om du använder mycket små djur som nyfödda musungar kan medelkroppstemperatur värdet bestämmas med en infraröd termometer istället.
- Placera temperatur / relativ fuktighet sond å ena hål ände pletysmografi kammaren. Anteckna temperatur, fuktighet och barometric trycket inuti pletysmografi kammaren före placering musen inom.
- Placera musen i pletysmografi kammaren, täcker den öppna änden något. Detta gör att musen för att acklimatisera. Stäng kammaren.
- Med temperaturen / fuktgivare in i sidan av pletysmografi kammare med ett hål, nu sätter givaren och sprutan i den andra sidan med de två hålen.
- Tryck på "Start" på programvara och rekord för ca 15-45 sek. Record 5-10 s av data där djuret inte rör sig. Rörelsen kommer att förändra djurets basala andningsfysiologi och ge dåliga resultat. Respiration ska svänga i en linjär bana på programmet. Dessa är användbara data. Anm: urinering eller defekation kan leda till en ökning av temperaturen och fuktigheten i pletysmografi kammaren. Detta kommer att skymma resultat under analysen. Vid urinering eller defekation, stoppa inspelningen omedelbart och rengör plethysmography kammare med 80% (vol / vol) etanol. Se figur 6 för en visuell representation av suboptimala resultat, där data bör förkastas.
- Efter inspelning under 45 sekunder, tryck på "Stop" på programmet (se material och utrustning tabell) program. Ta bort musen från pletysmografi kammaren och omedelbart spela in kammartemperatur och luftfuktighet. Inte ständigt spela in mer än 45 sekunder eftersom det kan betona djuret.
- Återgå musen till sin bur, spray och torka kammaren med 80% (vol / vol) etanol.
- Tillåt kammaren för att torka och återgår till baslinjen temperatur och fuktighet innan man går vidare till nästa mus. Upprepa steg från 3,1 till 3,9 för efterföljande djur. OBS: Om flera djur studeras, se till att kammaren temperatur och fuktighet återgång till värden nära baslinjen före varje nytt djur sätts i kammaren.
4. pletysmografi Analys
Ingente: För att beräkna andnings parametrar såsom tidalvolym (Vt) och minutvolym följande variabler behöver mätas: andningsfrekvens (andetag / min), total andningscykel (sek), inspiration / utgångstiden (Ti / Te, sekunder) och förändring i tryck på grund av varje tidalvolym (P T). Figur 1 visar de variabler som kan mätas från ett spår. Följande steg använder en programvara (se material och utrustning tabell) för att mäta dessa variabler. Vid analys, undvik regioner i spår som innehåller sniffa eller rörelse. För reproducerbara resultat, är minst 5 sekunder för god andnings spår krävs. För ett exempel på olika andnings spår se figur 5 och 6.
- Öppna skärmen till helskärm, ställa inför 1: 1 och välj 5 sek av användbara data. En representativ bild av detta visas i figur 5.
- Öppna miniuppgifter pad fönster finns på toppen av den program på fliken DataPad. Välj kanal 1 och välj "cykelmätningar" i den vänstra kolumnen och "genomsnittlig cyklisk höjd" i den högra kolumnen.
- Välj "Alternativ" och ställa in skalan för minimal toppdetektering till 1 (ms). Detta kommer att möjliggöra upptäckt av alla toppvärde och blir oerhört viktigt när man använder små djur som producerar små svängningar.
- Klicka på "OK". Detta kommer att presentera "Tryck nedböjning på grund av varje tidalvolym" (P T) mätning.
- I mini uppgifter pad väljer "cykelmätningar" följt av "event count" och klicka på "OK". Detta kommer att presentera den "frekvens" (f) mätning.
- Frekvens måste omvandlas till andetag / min. Detta görs genom att multiplicera värdet med 60 sek och dividera svaret med den totala tiden för inspelning (min).
- I mini uppgifter pad, välj "cycle mätningar "följt av" period "och klicka" Ok ". Detta kommer att presentera den "totala andningscykeltiden" (T tot, sek) mätning.
- Nästa steg används för att skapa en makroinstruktion att generera topp inspiration och utgångstidsvärden. Se till att markören är direkt över maximitoppen / tråg och lägga till en kommentar på 9 sekventiella toppar och dalar. Börja med den topp av svängningen som visas i figur 5.
- Därefter väljer fönster: uppgifter pad och kolumn 1 I fönstret som visas klickar du på "informations val" i den vänstra kolumnen, "längd" i högra kolumnen och klicka på "OK".
- Välj makro fann överst i programmet och sedan inspelningen. Nu väljer kommandon: "Sök", "Go", "Början på File" och klicka på "Sök".
- Välj kommandon: "Hitta" och "Hitta kommentarer". Skriv samma fras skrivit för kommentaren rutan i "som innehåller" rutan. Välj "Välj till föregående Point" fliken och "Sök".
- Välj kommandon: "Lägg till uppgifter pad". Välj sedan makro: makro-kommandon och börja repetera. Repetitionsfönster räknas som visas bör fastställas till 9.
- Välj kommandot: "Sök nästa". Välj kommandot: "Lägg till uppgifter pad". Slutligen väljer makrokommandon och slut repeat.
- Välj nu makrot och stoppa inspelningen. Spara och namnge makrot efter djurnummer. OBS: Ställa in makro för varje djur gör makrot som ska användas för longitudinella studier och sparar tid.
- Makrot kan nu köra för att få Inspiration (Ti) och Slutdag (T e) tid mellan varje kommentar. Uppgifterna kommer att visas under kanal 1 i datapad. Upphörande och inspiration sker i följd och uppgifterna kommer att visas i denna ordning.
- Uppgifterna måste manuellt uppdelad i inandning och utandning värden. Medelvärdet fyra datavärdena för varje parameter för att få den genomsnittliga T i och T e.
- När de primära värden har härletts tidalvolymen (Vt, ml) kan beräknas. För att få tidalvolym ekvation Drorbaugh och Fenn 8 används:
V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - P C) - T K (P B - P CORE)))
Där
V T: tidalvolym
Pk: Tryck nedböjning på grund av varje injektion av 1 ml (Se steg 2,5)
T core: Kärntemperatur för varje djur
P C: Vatten ångtryck vid kammartemperaturen X Relativ fuktighet i chamber
T C: temperaturen i djurkammare
P core: Tryck vid kroppstemperatur (vatten ångtryck vid kroppstemperatur x 1,0)
P t: Tryck nedböjning på grund av varje tidalvolym
V k: Volym injektion för kalibrering
P B: Barometertryck - När tidalvolymen har beräknats följande parametrar kan också bestämmas:
- Minutvolym (ml / min) = V T xf
- Minutvolym (ml / min / kg) = (V ^ xf) / Kroppsvikt (kg)
- V T (ml / kg) = V ^ (ml) / Kroppsvikt (kg)
- Inandningsdriftscykel (%) = T i / T tot
- Inandningsflödeshastighet (ml / sek) = Vt / Ti
- Förhållandet mellan inspiration då och förfallotiden = Ti / T e
- Total cykeltid (erec) = Inspiration (sek) + Utgångs (sek)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När detta förfarande har följts korrekt, är en konsekvent oscillerande spår skapas på dataanalys programvara. Förfarandet ger en respiratorisk spår inom några minuter efter installationen med enkla datorberäkningar för att bestämma andnings parametrar som anges. Figur 5 representerar en lämplig andnings spår från en kontroll (friska) mus. Lämplig oscillerande uppgifter produceras när djuret inte aktivt flytta.
UWBP är en extremt användbar och tillförlitlig bedömning av lungfunktionen mellan kontroll och lungfibros kohorten. Figur 7 demonstrerar lungfunktion hos en mus med bleomycin-inducerad lungfibros vid dag 14 I jämförelse med kontroll graf, Figur 7 illustrerar en visuell skillnad förenlig med bleomycin administration 7. Som diskuterats tidigare, kan förfarandet upprepas tillåter oss att observera förändringar i andnings parameters över tiden mellan dessa två grupper.
Erhållna resultaten är som skall uttryckas som medelvärden ± SEM. Det rekommenderas att kopiera och klistra in data som samlas in i en enkel Excel-ark. Detta kommer att bli till nytta för att utföra beräkningar som diskuteras i steg 4.13 och 4.14. Andnings funktion kan jämföras visuellt mellan två grupper som visat i figur 8.
Figur 1. Olika komponenter i andningscykeln illustreras med barometer pletysmografi. Diagrammet visar a) förändringen i tryck på grund av inspiration (ΔPi), b) förändringen i tryck på grund av varje tidalvolym (PT), c) förändring i tryck på grund av utandning (ΔPe), d) total andnings cykeltid (Ttot), e) inspiration tiden (Ti) och f) utgångstid (Te). Klicka här för att se en större bild.
Figur 2 Visuell representation av barometern och vattenpelaren setup. Figuren är utformad för att hjälpa läsaren att inrätta barometern och vattenpelaren för kalibreringen. Lägg märke till att vattnet är nivån inom de två kolonnerna och med hjälp av linjalen. De två kolonnerna är anslutna via 15 cm av plaströr. Slangen till höger (65 cm) är ansluten till en 1 ml spruta och till vänster (75 cm) på tryckomvandlare kopplad till datainsamlings maskinen. Notera:. Längd slang bestämmer volym (300 l) som krävs för att flytta en cm vatten Klicka här för att sestörre bild.
Figur 3 att steg 2.4 och 2.5 i Bridge Amp kalibrering. Denna figur illustrerar de steg 2,7 och 2,8 för kalibrering av utrustningen. Det är viktigt att korrigera Bridge Amp för att få exakta resultat. Klicka här för att se en större bild.
Figur 4 En övergripande schema över UWBP setup. Till vänster är den fukt / temperaturgivare som är ansluten till en sida av pletysmografi kammare som innehåller djuret. Till höger är kalibreringsspruta och tryckgivare ledandefrån pletysmografi kammaren till datainsamlingssystem som producerar en respiratorisk spår på datorn. Klicka här för att se en större bild.
Figur 5 Ett exempel på en andningsandnings spår från en C57Bl / 6 muskontroll erhålls vid användning UWBP. Denna andnings spår illustrerar lämpliga, enhetliga uppgifter från ett kontrolldjur. Nio i rad kommentarer läggs till vid toppar och dalar för att andas svängningar att få andnings parametrar som anges genom att följa stegen 4,1-4,13. Tid representeras längs x-axeln (sek) och tryckförändringar längs y-axeln (cm.H 2 O). klicka här för att VIew större bild.
Figur 6 Exempel på olika suboptimala spår erhållna från en C57Bl / 6 musen när du använder UWBP. Är optimala resultat kan förväxlas som lämpliga uppgifter och är den vanligaste källan till dålig analys. Denna figur illustrerar de vanligaste suboptimala spår som aldrig ska användas för analys. Dessa andnings spår visar a) En andnings spår in medan djuret sniffa och flytta förändra djurets basala andningsfysiologi. B) Ett spår inspelade resulte svängningar ökar gradvis med tiden orsakas oftast av kondens och fukt bygga upp. Emellertid kan spår korrigeras genom att torka av pletysmografi kammaren med etanol eller med kalibreringsstegen upprepas. C) Ett spårinspelad under pletysmografi kammarrörelse medan djuret eller forskare är engagerande med utrustningen. Tiden representeras längs x-axeln (sek) och tryckförändringar längs y-axeln (cm.H 2 O). Klicka här för att se en större bild.
Figur 7 Ett exempel på en andnings spår som erhållits från en C57Bl / 6 mus med inducerad lungfibros vid användning UWBP. Denna andnings spår illustrerar fall konsekventa data från ett djur med inducerad lung erhålls vid användning av UWBP förfarande som beskrivs i den här artikeln. Nio i rad kommentarer läggs till vid toppar och dalar för att andas svängningar att få andnings parametrar som anges genom att följa stegen 4,1-4,13. Tid är reprepresenteras längs x-axeln (sek) och tryckförändringar längs y-axeln (cm.H 2 O). Klicka här för att se en större bild.
Figur 8 Andnings funktion jämfört mellan kontroll och bleomycin utmanade C57BL / 6 möss. Utföra pletysmografi analys efter att ha använt UWBP gör det möjligt för användaren att resultatet liknar det som visas här. Denna figur visar de fysiologiska skillnaderna mellan bleomycin utmanade djur (prickad grå linje) och kontrolldjur (solid svart linje). Dessa diagram visar jämförelser i a) Slut tid (sek), B) Inspiration tid (sek), c) Inspiration duty cycle (%), d) Inandningsflödeshastighet (ml / sek)e) Andningsfrekvens (andetag / min), f) minutvolym (ml / min / kg), g) Tidal volym (ml / kg) och h) Total cykeltid (sek). Lungfunktions uppgifter samlades in i längdriktningen i samma kohort av djur på dag 0, 7 och 14 efter bleomycin utmaning. Representativa data har anpassats från Murphy et al. (2012) 16. Klicka här för att se en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik som beskrivs här är en icke-invasiv metod för utvärdering av andningsparametrar för ohämmade och obedövade möss. Styrkan i detta protokoll omfattar dess enkelhet och precision för att mäta lungfunktionen i längsled med minimala artefakter. Det finns dock vissa begränsningar och kritiska steg noteras om förfarandet. Först och viktigast, måste musen vara lugn i kammaren i minst fem sekunder. Inkom stressen kommer att störa andningsmönster av musen och därmed ge varierande resultat (figur 6a). Denna nackdel kommer sannolikt kvar och är att vänta ibland. Men som ersätter musen i sitt hem-bur och låta det dags att åter bosätta kommer lätt korrigera detta. Det är viktigt att djuret känner sig bekväm i kammaren miljön för att få fem sekunder av lämpliga / användbara uppgifter. Ytterligare överväganden krävs när det gäller kammarmiljön. Miljön, unrelated till andningsmekanik, kan avsevärt påverka resultaten. Eftersom giltighetstiden för höjningar bedömnings fuktighet och temperatur av kammar ökar, samt minskar tillgängligt syre, avsevärt påverkar ventilationen. Tidpunkten för ventilation ökar fuktigheten och temperaturen i kammaren samt minskar tillgängligt syre 21. En liten läcka i kammaren kan bidra till att minska värme drivor skapas från värmeproduktion 22,23. Protokollet diskuteras är specifik för utrustning och instrument listade. Kalibrering av bryggförstärkare i avsnitt två kommer att bero på läsarens utrustning. Om faktorer som slanglängden skiljer en 300 pl injektion av luft får inte orsaka en 1 cm.H 2 O nedböjning.
Det finns också fysiologiska skillnader beroende på vilken tid på analysen. Gnagare är naturligt nattdjur och cirkadiska cykler, vilket i slutändan genererar förändringar iandning, bör beaktas när tids försöken 24. Det är därför nödvändigt att tid och planera experimenten så att försöksdata blir korrekt jämförelse mellan kohorter. Det är också viktigt att notera spårrörelsen. Om oscillationerna inte kör i ett linjärt mönster, är det vanligtvis på grund av en ansamling av kondens eller fuktigheten i kammaren (figur 6b) eller ineffektiv tätning på kammaren. I slutändan kan dessa begränsningar redovisas och UWBP process som utförs på lämpligt sätt för att ge exakt andningsmätning. Det är också viktigt att notera att denna metod kommer att kräva modifiering (mindre kammarstorlek) för mätning av luftvägsförändringar neonatal vanliga laboratoriemöss (t.ex. <2 veckor C57BL / 6) för att detektera tryckförändringar i respiration av djur av den storleken .
Även UWBP visar betydande fördelar det bär även kontroverser.Utredarna bör bekanta sig med debatten och fatta ett välgrundat beslut om huruvida denna teknik är lämplig för forskningsfrågan. Initialt Drorbaugh och Fenn (1955) 8 antages att en ökning av kammartrycket orsakas av inandad luft att värmas och befuktas till lungvärden; motsatsen inträffade i utandning. Detta tillät beräkning av andetagsvolym. Senare forskning ansåg att tryckförändringar orsakades av att ändra alveolär tryck under generering av luftflödet 25. Detta arbete uppgav att använda pletysmografi för luftvägsmotståndet beräkning. Enhörning et al. (1998) 26 fram bevisning för att tidalvolym, andningsfrekvens och luftvägsmotståndet alla påverkar tryckvariationer inom pletysmografi kammaren. När luften i kammaren värms och fuktas för kroppsförhållanden tryckvariationer minskas med två tredjedelar och förstärks genom ökade resistanser <sup> 21. Eftersom alla dessa delar återspeglar tryckvariationer finns kontroverser om mätningar av en viss andningsparametrar är korrekta. Som ett resultat har man dragit slutsatsen att tidalvolym erhålls från pletysmografi är en kvalitativ snarare än kvantitativ bedömning 26. Både övre och nedre luftvägsmotstånd är komponenter i pletysmografi systemet skapar osäkerhet vid mätning bronkkonstriktion 27. Det är författarens uppfattning att UWBP bör användas ömsesidigt med invasiva analyser. Det är i själva verket en politik för vissa tidskrifter som enbart manuskript baserat på UWBP uppgifter kommer inte att accepteras. Detta kommer att vara en annan ersättning för läsaren.
Sammanfattningsvis är UWBP en användbar metod för att mäta förändringar av andningsparametrar i de vanliga laboratorie gnagare, särskilt mottagliga för longitudinella studier. Viktiga fördelar med denna teknik är undvikande av invasiva procedurer, kemiskutmaningar och kravet på anestesi. Detta gör det möjligt för forskarna att samla in fysiologiska uppgifter som närmast representerar naturligt förekommande händelser och minska experimentell variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M.
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
