Summary
L'évaluation de la physiologie respiratoire a traditionnellement compté sur des techniques, qui nécessitent une contention ou sédation de l'animal. Effrénée pléthysmographie corps entier, cependant, fournit une analyse précise et non invasive, quantitative de physiologie respiratoire dans des modèles animaux. En outre, la technique permet une évaluation répétée de souris respiratoire permettant d'études longitudinales.
Abstract
Dysfonctionnement respiratoire est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde et les taux de mortalité continuent d'augmenter. L'évaluation quantitative de la fonction pulmonaire chez les rongeurs est un outil important dans le développement de futures thérapies. Communément utilisé des techniques pour évaluer la fonction respiratoire, y compris pléthysmographie invasive et oscillation forcée. Bien que ces techniques fournissent des informations précieuses, la collecte de données peut être lourde avec des objets et de la variabilité expérimentale en raison de la nécessité d'une anesthésie et / ou instrumentation invasive de l'animal. En revanche, sans retenue pléthysmographie corps entier (UWBP) offre un moyen quantitatif précis, non invasif qui pour analyser les paramètres respiratoires. Cette technique permet d'éviter l'utilisation de dispositifs de retenue et l'anesthésie, qui est commun aux techniques traditionnelles de pléthysmographie. Cette vidéo montrera la procédure UWBP y compris l'équipement mis en place, l'étalonnage et les poumons fonction enregistrement. Ilexpliquera comment analyser les données recueillies, ainsi que d'identifier les valeurs aberrantes expérimentales et des objets qui résulte de mouvements d'animaux. Les paramètres respiratoires obtenus en utilisant cette technique comprennent le volume courant, le volume minute, le rapport cyclique inspiratoire, le débit inspiratoire et le rapport du temps d'inspiration au temps d'expiration. UWBP ne repose pas sur des compétences spécialisées et est peu coûteux. Une caractéristique clé de UWBP, et plus attrayant pour les utilisateurs potentiels, est la possibilité d'effectuer des mesures répétées de la fonction pulmonaire sur le même animal.
Introduction
Dysfonction du poumon est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La condition est caractérisée par l'échange d'oxygène insuffisante, synonyme de la toux, des douleurs thoraciques et dyspnée. Les maladies respiratoires pour ~ 10% de mortalité dans le monde 1. Selon l'Organisation mondiale de la santé, les taux de mortalité vont augmenter à cause du tabagisme persistant, la pollution et les irritants au travail. UWBP est un complément utile pour l'étude de la physiologie du poumon, qui complète fortement biochimique traditionnelle et analyse histologique 2. D'autres procédures utilisées pour l'évaluation du poumon ne fournissent pas les mêmes avantages que UWBP. Pléthysmographie invasive est une technique couramment utilisée qui exige que l'animal soit anesthésié 3,4 et donc, des mesures respiratoires résultant ne sont pas nécessairement le reflet d'un état naturel. En outre, l'exigence de ventilation et chimiques défis mécaniques n'empêche mesures futures 3,4.Une autre méthode de collecte de données respiratoire est en oscillation forcée, qui est plus sensible aux changements dans les plus fins par rapport aux paramètres respiratoires UWBP 5. Oscillation forcée est, cependant, une technique invasive et nécessite résiliation animal pour la collecte de données 5-7.
UWBP consiste à placer un animal à l'intérieur d'une chambre spécialisée. Pendant l'inspiration, la marée air est réchauffé et humidifié à l'intérieur des poumons de plus en plus la pression de vapeur d'eau et provoque la dilatation thermique de gaz 8. Cet effet provoque une variation nette de la quantité d'air créant une augmentation de pression dans la chambre de pléthysmographe 8. L'inverse se produit lors de l'expiration créer une forme d'onde respiratoire à partir de l'animal. analyse de forme d'onde est ensuite utilisé pour mesurer à partir de la trace respiratoire: fréquence respiratoire (respirations / min), le temps de cycle de la respiration totale (s), d'inspiration / heure d'expiration (Ti / Te, sec) et les variations de pression dues à chaque volume courant (P T). UWBP fournit une analyse précise et non invasive, quantitative de physiologie respiratoire chez des modèles animaux et peut être utilisé pour mesurer la progression de la maladie des voies respiratoires et des poumons 6,9. Contrairement à d'autres techniques de pléthysmographie, UWBP évite l'utilisation de l'anesthésie, les restrictions et les manipulations invasives qui produisent des artefacts et expérimentale variabilité 6,9. Anesthésie peut supprimer la respiration,modifier le rythme cardiaque et peut être difficile à régler 10. Restrictions induisent une augmentation de la respiration due à un stress supplémentaire via la corticostérone et l'adrénaline libèrent 11,13. La principale caractéristique de UWBP est répété évaluation physiologique rendant prêtent à des études longitudinales. UWBP est fortement recommandé pour l'évaluation longitudinale de la physiologie du poumon et offre une compétence précieuse pour l'avenir de l'évaluation des médicaments respiratoires. Bléomycine, l'ovalbumine et l'hypoxie ont été utilisés pour induire défis respiratoires dans plusieurs études et UWBP a réussi à mesurer poumon précis évaluation physiologique 7,9,13-16. Le protocole décrit est conçu pour les souris de laboratoire adulte standard. Cependant, UWBP a été adaptée à d'autres animaux tels que les rats, les cobayes et les primates non humains de 17 à 20. UWBP ne se limite pas seulement à l'évaluation de la dysfonction pulmonaire mais a également été utilisée pour l'évaluation de la maturation pulmonaire 3.La polyvalence, la simplicité et la reproductibilité des UWBP ont établi une excellente technique pour l'évaluation de la fonction pulmonaire chez les animaux. Divers logiciels (voir matériaux et la table de l'équipement) sera tenu de suivre cette procédure. Un scientifique expérimenté serait en mesure d'effectuer ce protocole avec une souris dans 1 heure.
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Protocol
REMARQUE: La procédure expérimentale suivante est approuvé par le Comité d'éthique animale à l'Université Monash et réalisée conformément aux dispositions du Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (2006). Adultes C57BL / 6 femelles souris utilisées pour générer les résultats représentatifs ont été obtenues à partir des Services animaliers de Monash. Les souris ont été logées dans un local spécifique de l'agent pathogène, température et humidité contrôlées avec un cycle de lumière-obscurité de 12 heures. Ces souris avaient un accès libre à la nourriture et de l'eau.
1 Configuration initiale
- Connectez l'ordinateur portable / de bureau à la machine d'acquisition de données pour l'enregistrement via un câble USB.
- Connectez l'amplificateur pont de 'sortie 1' à 'entrée 1' de la machine d'acquisition de données via un câble BNC.
- Insérez le capteur de pression en «voie 1» de la Octal Pont Amp. Mettez l'appareil d'acquisition de données et ouvrir le logiciel d'analyse. Le logiciel devrait autodétecter automatiquement la configuration de l'équipement (voir tableau des matériaux et de l'équipement).
- Les réglages des canaux ouverts trouvés dans la barre d'outils de configuration du logiciel. Changer le nombre de canaux en cours d'enregistrement à 1.
- Mettre en place le baromètre pour mesurer la pression ambiante et l'appareil de colonne d'eau pour calibrer l'amplificateur Bridge. Appareil de colonne d'eau comprend deux pipettes de seringue 5 ml sérologiques reliés par des tubes en plastique.
- Remplissez les colonnes avec de l'eau et s'assurer que les niveaux d'eau sont équilibrés avec une règle. Raccorder une section de tube en matière plastique à la partie supérieure de chaque pipette. Figure 2 montre la colonne d'eau créée.
2 Pont Amplificateur étalonnage
Remarque: Pour étalonner l'amplificateur de pont d'une injection d'air dans la colonne d'eau est nécessaire pour créer un 1 cm H 2 O déviation. Cela se produit dans un seul ensemble de conditions et dépend de l'appareil de l'utilisateur. Pour plus de précisions ces étapes demonstrate comment ce laboratoire serait effectuer l'étalonnage.
- Retirer une seringue de 1 ml à 300 pi; fixer la seringue au robinet d'arrêt à l'extrémité de la tubulure sur le côté droit de la colonne d'eau. REMARQUE: Assurez-vous que le robinet est ouvert à la seringue et la colonne d'eau, et fermé à l'air ambiant. Si les niveaux d'eau ne sont pas équilibrés, à ce stade, tourner le robinet de sorte qu'il est ouvert à l'air ambiant et la colonne d'eau, ce sera à rééquilibrer l'eau. Le tube sur le côté gauche de la colonne d'eau doit être connecté au transducteur de pression pour mesurer la variation de pression provoquée par la chute de la seringue.
- Fixer le tube de la colonne d'eau sur le côté gauche du connecteur sur le transducteur de pression (supérieure annulaire du transducteur).
- Sélectionnez le menu déroulant en bas trouvé près de la voie 1 à l'écran principal sur le côté droit du logiciel et sélectionnez "ampli Bridge" (voir tableau des matériaux et de l'équipement).
- Entrerles paramètres à 5 mV, 20 Hz passe-bas, cocher la case «inverti» et cliquez sur «zéro». Cliquez sur 'zéro' pour fixer la trace à ~ 0 mV. Réduire la taille de la fenêtre à 4: 1 pour faciliter la visualisation.
- Avec tout mis en place, appuyer sur la seringue de 1 ml, laissant pendant 3 sec. Cela fera apparaître une hausse soudaine sur le logiciel parce que la pression a changé. Lorsque les 300 ul est enfoncée la pression déplace l'eau dans la colonne d'eau de 1 cm. Cette valeur connue aidera calibrer l'amplificateur Bridge.
NOTE: L'augmentation de la pression dans la chambre en raison de la dépression 300 pi correspond à la valeur P K utilisée pour des calculs ultérieurs. - Sélectionnez «unités d'entrée», trouvées sur le coin inférieur gauche de la fenêtre Bridge Amp.
- Mettez en surbrillance le "trace de fond" avant le pic autrement connu comme la «Région zéro».
- Cliquez sur la flèche à côté de «point 1» et cela produira le bacsignal de kground dans la gamme de -0.002 mV 0,002 mV (la valeur ne sera jamais exactement à 0 mV).
- Type de «0» dans la fenêtre adjacente à la fenêtre du signal de fond.
- Mettez en surbrillance le "zone de pression accrue de graphique" à partir de quand la seringue est enfoncé. Cliquez sur la flèche au point 2 et la valeur doit être dans la gamme de 0,9-1,2 mV.
- Type «1» dans la fenêtre à côté de la fenêtre "pression accrue". Pour une clarification visuelle sur les mesures 2.7 et 2.8 se référer à la Figure 3. Valeurs trouvées en dehors des plages spécifiées peuvent indiquer des dommages à l'octal Pont Amp.
- Aller à «définir des unités» qui se trouve dans le coin supérieur droit de la fenêtre et sélectionnez "cmH 2 O". Si cette option n'est pas disponible, elle peut être saisie manuellement. Cliquez sur OK.
- Retour au menu «Pont Amp» (voir 2.1). Sélectionnez 1 mV et réglez l'amplificateur à «zéro»;. Cela viendra compléter l'étalonnage et la colonne d'eau peut être retiré en toute sécurité.
Fonction 3 Enregistrement du poumon
- Peser la souris (g). REMARQUE: Une semaine avant l'évaluation physiologique introduire la souris à l'environnement de la chambre de pléthysmographie. Cela aidera à réduire le stress et l'acclimatation lors de l'exécution de cette procédure à une date ultérieure. Pour un schéma d'ensemble montrant la configuration UWBP, s'il vous plaît se référer à la Figure 4.
- Mesurer la température du corps avec un thermomètre rectal. Graisser le thermomètre avec de la vaseline avant l'insertion. Enregistrez la lecture de la température et de nettoyer le lubrifiant hors 80% (v / v) d'éthanol. Si l'on utilise de très petits animaux tels que les souriceaux nouveau-nés, la valeur moyenne de la température corporelle peut être déterminée avec un thermomètre infrarouge à la place.
- Placer la sonde d'humidité / température par rapport à l'extrémité d'un trou de la chambre de pléthysmographie. Enregistrer la température, l'humidité et barometric pression à l'intérieur de la chambre de pléthysmographie avant de passer à l'intérieur de la souris.
- Placez la souris dans la chambre de la pléthysmographie, couvrir légèrement l'extrémité ouverte. Cela permet à la souris pour s'acclimater. Fermez la chambre.
- Avec la sonde de température / humidité inséré dans le côté de la chambre de pléthysmographie avec un trou, maintenant insérer la seringue dans le transducteur et de l'autre côté avec les deux trous.
- Appuyez sur 'Start' sur le logiciel et d'enregistrer pendant environ 15-45 secondes. Fiche 5-10 sec de données où l'animal ne se déplace pas. Mouvement va modifier la physiologie respiratoire de base de l'animal et de fournir des résultats médiocres. La respiration doit osciller sur un trajet linéaire sur le programme. Ce sont des données utilisables. Remarque: la miction ou la défécation peut conduire à une augmentation de la température et de l'humidité à l'intérieur de la chambre de pléthysmographie. Cela occulter les résultats lors de l'analyse. Dans le cas de la miction ou la défécation, arrêter immédiatement l'enregistrement et nettoyer la plchambre de ethysmography avec 80% (v / v) d'éthanol. Reportez-vous à la figure 6 pour une représentation visuelle des résultats sous-optimaux, où les données doivent être rejetés.
- Après avoir enregistré pendant 45 secondes, appuyez sur «Stop» sur le logiciel (voir matériels et ustensiles de table) programme. Débranchez la souris de la chambre de pléthysmographie et enregistrer immédiatement la température et de l'humidité chambre. Ne pas enregistrer continuellement pendant plus de 45 secondes comme cela peut souligner l'animal.
- Retour de la souris dans sa cage, vaporiser et essuyer la chambre avec 80% (v / v) d'éthanol.
- Laisser la chambre à sécher et revenir à la température et l'humidité de base avant de passer à la prochaine souris. Répétez les étapes 3.1 à 3.9 pour les animaux suivants. Remarque: Si plusieurs animaux sont à l'étude, s'assurer que la température de la chambre et le retour de l'humidité à des valeurs de référence proches avant chaque nouvel animal est mis dans la chambre.
4. pléthysmographie analyse
Aucunte: Pour calculer les paramètres respiratoires tels que le volume courant (V T) et le volume minute, les variables suivantes doivent être mesurées: le taux de respiration (respirations / min), la respiration totale du temps de cycle (s), d'inspiration / heure d'expiration (Ti / Te, secondes) et le changement de la pression due à chaque volume courant (P T). Figure 1 illustre les variables qui peuvent être mesurées à partir d'une trace. Les étapes suivantes utilisent un logiciel (voir matériaux et de la table de l'équipement) pour mesurer ces variables. Lors de l'analyse, d'éviter les régions de la trace contenant renifler ou mouvement. Pour obtenir des résultats reproductibles, au moins 5 secondes de la bonne trace respiratoire est nécessaire. Pour un exemple de différentes traces de respiration se référer à la Figure 5 et 6.
- Ouvrez l'écran en plein écran, réglez vue de 1: 1 et sélectionnez 5 secondes de données utilisables. Un cliché représentatif de ceci est montré dans la Figure 5.
- Ouvrez la mini-fenêtre de tampon de données se trouve en haut de la programme dans l'onglet Datapad. Sélectionnez le canal 1 et sélectionnez «mesures de cycle» dans la colonne de gauche et la «hauteur moyenne cyclique» dans la colonne de droite.
- Sélectionnez «Option» et définir l'échelle pour la détection de crête minimum de 1 (ms). Cela permettra la détection de chaque valeur de crête et devient extrêmement important lors de l'utilisation de petits animaux qui produisent de petites oscillations.
- Cliquez sur 'OK'. Ce présentera 'déviation de la pression due à chaque volume courant "(P T) de mesure.
- Dans le mini-tampon de données, sélectionnez «mesures de cycle» suivi de «nombre d'événements 'et cliquez sur' OK '. Ce présentera la «fréquence» (f) mesure.
- La fréquence doit être converti de respirations / min. Cela se fait en multipliant la valeur de 60 secondes et en divisant le résultat par la durée totale d'enregistrement (min).
- Dans le mini-tampon de données, sélectionnez cy »mesures de cle 'suivi de' période 'et cliquez sur' OK '. Cela présente le «temps total de cycle de respiration» (T tot, s) mesure.
- Les prochaines étapes sont utilisés pour créer une macro-instruction pour générer inspiration et d'expiration des valeurs de pointe de temps. Assurez-vous que le curseur est directement au-dessus du maximum du pic / creux et ajouter un commentaire sur 9 pics et les creux successifs. Commencer avec le sommet de l'oscillation, comme illustré sur la figure 5.
- Par la suite, sélectionnez la fenêtre: tampon de données et de la colonne 1 Dans la fenêtre qui apparaît, cliquez sur "information de sélection» dans la colonne de gauche, la «durée» dans la colonne de droite et cliquez sur 'OK'.
- Sélectionnez macro se trouve en haut de programme et puis commencer l'enregistrement. Maintenant, sélectionnez les commandes: 'Rechercher', 'Go', 'début du fichier "et cliquez sur" Rechercher ".
- Sélectionner des commandes à: 'Rechercher' et 'Rechercher commentaires'. Tapez la même phrase typé pour la boîte de commentaire dans le 'contenant' case prévue. Choisissez l'onglet "Sélectionner pour point précédent 'et' Rechercher '.
- Sélectionnez les commandes: «Ajouter au tampon de données. Ensuite, sélectionnez la macro: macro-commandes et de commencer la répétition. La fenêtre de comptage de répétition qui apparaît devrait être fixé à 9.
- Sélectionnez la commande: «Rechercher le suivant». Sélectionnez la commande: «Ajouter au tampon de données. Enfin, sélectionnez macro-commandes et la répétition de fin.
- Maintenant, sélectionnez la macro et arrêter l'enregistrement. Enregistrez et nommez la macro après le nombre d'animaux. REMARQUE: La mise en place de la macro pour chaque animal permet la macro à utiliser pour les études longitudinales et gagner du temps.
- La macro peut maintenant être exécuté pour obtenir l'Inspiration (T i) et d'expiration (T e) le temps entre chaque commentaire. Les données apparaissent sous la voie 1 du bloc de données. Expiration et l'inspiration se produit consécutivement et les données apparaîtront dans cet ordre.
- Les données doivent être répartis manuellement dans les valeurs d'inspiration et d'expiration. Faire la moyenne des quatre valeurs de données de chaque paramètre afin d'obtenir la moyenne T i et T e.
- Une fois que les valeurs de base ont été dérivées du volume courant (V T, ml) peut être calculée. Pour obtenir le volume de marée de l'équation de Drorbaugh et Fenn 8 est utilisé:
V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - P C) - T C (P B - P CORE)))
Où
V T: Volume courant
P k: déviation de la pression due à l'injection de 1 ml (Reportez-vous à l'étape 2.5)
T de base: la température de base de chaque animal
P C: pression de vapeur d'eau à température chambre X humidité relative de chambre
T C: la température dans la chambre animaux
P noyau: la pression à la température du corps (pression de vapeur de l'eau à la température corporelle x 1,0)
P t: déviation de la pression due à chaque volume courant
V k: injection de volume pour l'étalonnage
P B: pression barométrique - Une fois que le volume courant a été calculé les paramètres suivants peuvent également être déterminés:
- Volume minute (ml / min) = V T xf
- Volume minute (ml / min / kg) = (V T xf) / poids corporel (kg)
- V T (ml / kg) = V T (ml) / poids corporel (kg)
- Duty cycle inspiratoire (%) = T i / T tot
- Inspiratoire Débit (ml / sec) = V T / T i
- Ratio du temps d'inspiration au temps d'expiration = T i / T e
- Durée totale du cycle (sec) = temps de Inspiration (s) + temps d'expiration (s)
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Representative Results
Lorsque cette procédure a été correctement suivie, une trace d'oscillation cohérente est créé sur le logiciel d'analyse de données. La procédure prévoit une trace des voies respiratoires en quelques minutes après l'installation des calculs informatiques simples pour déterminer les paramètres respiratoires énumérés. Figure 5 représente une trace respiratoire approprié d'une gestion de la souris (en bonne santé). Données oscillant approprié est produit lorsque l'animal ne bouge pas activement.
UWBP est une évaluation extrêmement utile et fiable de la fonction pulmonaire entre le contrôle et la fibrose pulmonaire cohorte. Figure 7 montre la fonction de poumon d'une souris avec une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine au jour 14 en comparaison à la courbe de commande, la figure 7 illustre une différence visuelle compatible avec l'administration de la bléomycine 7. Comme indiqué précédemment, la procédure peut être répétée qui nous permet d'observer les changements dans paramete respiratoirers au fil du temps entre ces deux groupes.
Les résultats obtenus sont exprimés en tant que moyenne ± SEM. Il est recommandé de copier et coller les données recueillies dans un tableur Excel simple. Ce sera utile pour effectuer des calculs évoqués dans les étapes 4,13 et 4,14. La fonction respiratoire peut être comparé visuellement entre deux groupes comme le montre la figure 8.
Figure 1: Les différents composants du cycle respiratoire illustrés par la pléthysmographie barométrique. Ce graphique illustre a) le changement de pression dû à l'inspiration (ΔPi), b) la variation de pression due à chaque volume courant (PT), c) le changement de pression due à l'expiration (ΔPe), d) du temps de cycle de la respiration totale (Ttot), e) le temps de l'inspiration (Ti) et f) date d'expiration (Te). Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2: Représentation visuelle de l'installation de la colonne de baromètre et de l'eau. L'illustration est conçu pour aider le lecteur à mettre en place la colonne de baromètre et de l'eau pour le processus d'étalonnage. Notez l'eau est de niveau dans les deux colonnes aidés par le souverain. Les deux colonnes sont reliées par l'intermédiaire de 15 cm d'un tube en plastique. Le tube situé sur la droite (65 cm) est relié à une seringue de 1 ml et à gauche (75 cm) du transducteur de pression relié à l'appareil d'acquisition de données. Remarque:. La longueur du tube détermine le volume (300 pi) nécessaire pour déplacer 1 cm d'eau Cliquez ici pour voiragrandir l'image.
Figure 3 effectuer les étapes 2.4 et 2.5 du pont Amp étalonnage. Cette figure illustre les étapes 2.7 et 2.8 pour l'étalonnage de l'équipement. Il est essentiel de corriger le pont Amp à obtenir des résultats précis. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4 Un schéma général de l'installation UWBP. A gauche se trouve la sonde d'humidité / température relié à un côté de la chambre de pléthysmographie contenant l'animal. A droite se trouve la seringue d'étalonnage et capteur de pression de premier plande la chambre de pléthysmographie au système d'acquisition de données produisant une trace respiratoire sur l'ordinateur. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 5 Un exemple d'une trace de protection respiratoire, d'une gestion de la souris C57BL / 6 obtenue lors de l'utilisation UWBP. Cette trace de respiration illustre échéant, des données cohérentes d'un animal témoin. Neuf commentaires consécutifs sont ajoutés les pics et les creux de la respiration oscillations pour obtenir les paramètres respiratoires énumérés en suivant les étapes 4.1 à 4.13. Le temps est représenté le long de l'axe x (s) et les variations de pression le long de l'axe y (cm.H 2 O). Cliquer ici à view agrandir l'image.
Figure 6: Exemples de différents sous-optimaux traces obtenues à partir de souris C57BL / 6 lors de l'utilisation UWBP. Résultats non optimale peut être confondue avec les données appropriées et est la source la plus fréquente de la mauvaise analyse. Cette figure illustre les traces sous-optimales les plus courantes qui ne devraient jamais être utilisés pour l'analyse. Ces traces de respiration démontrent a) Une trace de respiration enregistré alors que l'animal renifle et le déplacement de modifier la physiologie respiratoire de base de l'animal. B) Une trace enregistrée oscillations résultant augmente progressivement au fil du temps est généralement causée par la condensation et l'humidité s'accumuler. Toutefois, le tracé peut être corrigé par l'essuyage de la chambre de pléthysmographie à l'éthanol ou par la répétition des étapes d'étalonnage. C) Une traceenregistrée au cours de la pléthysmographie mouvement de chambre alors que l'animal ou le chercheur se livre avec l'appareil. Le temps est représenté le long de l'axe des x (s) et les changements de pression le long de l'axe des ordonnées (cm.H 2 O). Cliquez ici pour agrandir l'image.
La figure 7 un exemple d'une trace de respiration provenant d'une souris C57BL / 6 avec une fibrose pulmonaire induite par l'utilisation de UWBP. Cette trace respiratoire illustre échéant, des données cohérentes d'un animal avec pulmonaire induite obtenue lors de l'utilisation de la procédure UWBP décrit dans cet article. Neuf commentaires consécutifs sont ajoutés les pics et les creux de la respiration oscillations pour obtenir les paramètres respiratoires énumérés en suivant les étapes 4.1 à 4.13. Le temps est représenté le long de l'axe des x (s) et les changements de pression le long de l'axe des ordonnées (cm.H 2 O). Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 8: La fonction respiratoire par rapport entre le contrôle et la bléomycine contesté C57BL / 6 souris. Effectuer une analyse de la pléthysmographie après l'utilisation UWBP permettra à l'utilisateur à des résultats similaires à ce qui est représenté ici. Ce chiffre illustre les différences physiologiques entre la bléomycine contesté animaux (ligne grise parsemée) et les animaux de contrôle (solide ligne noire). Ces graphiques montrent les comparaisons en a) le temps d'expiration (s), b) temps de Inspiration (s), c) cycle d'Inspiration (%), d) débit inspiratoire (ml / sec)e) La fréquence respiratoire (respirations / min), f) Volume minute (ml / min / kg), g) Volume courant (ml / kg) et h) durée totale du cycle (s). Les données de la fonction pulmonaire ont été recueillies longitudinalement dans la même cohorte d'animaux aux jours 0, 7 et 14 après la provocation de la bléomycine. Données représentant a été adapté de Murphy et al. (2012) 16. Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
La technique décrite ici est une méthode non-invasive pour l'évaluation des paramètres respiratoires des souris effrénés et non anesthésiés. Les points forts de ce protocole sont sa simplicité et de précision pour mesurer la fonction pulmonaire longitudinalement avec des objets minimaux. Il ya, cependant, des limitations et des étapes critiques à noter à propos de la procédure. Tout d'abord et surtout, la souris doit rester calme dans la chambre pour un minimum de cinq secondes. Stress supplémentaire va perturber le rythme respiratoire de la souris et donc fournir des résultats variables (Figure 6a). Cet inconvénient sera probablement rester et on peut s'attendre à certains moments. Toutefois, le remplacement de la souris dans sa maison-cage et de lui permettre de se réinstaller temps sera facilement corriger cela. Il est essentiel que l'animal sent à l'aise dans l'environnement de la chambre pour obtenir les cinq secondes données appropriées / utilisables. Un examen plus approfondi est nécessaire en ce qui concerne l'environnement de la chambre. L'environnement, unrelated à la mécanique respiratoire, peuvent affecter significativement les résultats. Comme la durée des augmentations d'évaluation, l'humidité et la température de la chambre augmente, ainsi que la diminution de l'oxygène disponible, une incidence significative sur la ventilation. Le moment de ventilation augmente l'humidité et de la température de la chambre ainsi que la diminution d'oxygène 21. Une petite fuite dans la chambre peut aider à réduire les dérives thermiques créés à partir de la production de chaleur 22,23. Le protocole discuté est spécifique à l'équipement et de l'instrumentation énumérés. Calibration de l'amplificateur de pont dans la deuxième section dépendra de l'équipement du lecteur. Si des facteurs tels que la longueur de tube sont différentes d'une injection de 300 ul de l'air ne doit pas provoquer une cm.H 1 2 O déviation.
Il existe également des différences physiologiques selon le moment de l'analyse. Les rongeurs sont des créatures naturellement nocturnes et les cycles circadiens, qui génèrent finalement des changements dansrespiration, doit être prise en compte lors de la synchronisation des expériences 24. Il est donc nécessaire de temps et de planifier les expériences telles que les données expérimentales peuvent être comparées avec précision entre les cohortes. Il est également important de prendre note du mouvement de trace. Si les oscillations ne sont pas en cours d'exécution dans un modèle linéaire, il est généralement dû à une accumulation de condensation ou d'humidité dans la chambre (Figure 6b), ou joint inefficace sur la chambre. En fin de compte, ces limitations peuvent être prises en compte et le processus UWBP effectuées de façon appropriée pour fournir une mesure précise des voies respiratoires. Il est également important de noter que ce procédé devra être modifié (plus petite dimension de la chambre) pour mesurer les variations respiratoires chez les souris de laboratoire standard néonatale (par exemple, <2 semaines C57BL / 6), afin de détecter les changements de pression dans la respiration des animaux de cette taille .
Bien UWBP démontre des avantages considérables, il porte aussi la controverse.Les enquêteurs doivent se familiariser avec le débat et prendre une décision éclairée si cette technique est appropriée pour la question de recherche. Dans un premier temps, et Drorbaugh Fenn (1955) 8 ont estimé que l'augmentation de la pression dans la chambre est provoquée par l'air inspiré est réchauffé et humidifié à des valeurs pulmonaires; l'inverse s'est produit dans expiration. Cela a permis le calcul du volume de marée. Des recherches ultérieures ont estimé que les changements de pression sont causées par changement de la pression alvéolaire au cours de la génération du flux d'air 25. Ce travail a déclaré l'utilisation de la pléthysmographie pour le calcul de la résistance des voies aériennes. Enhorning et al. (1998) 26 ont donné la preuve que le volume courant, la fréquence respiratoire et de la résistance des voies aériennes influence toutes les fluctuations de pression dans la chambre de Plethysmographie. Quand l'air dans la chambre est chauffé et humidifié à des conditions de variations de la pression du corps sont réduites par les deux tiers et sont amplifiés par l'augmentation des résistances <sup> 21. Comme tous ces éléments reflètent les fluctuations de pression il ya une controverse si les mesures de paramètres a respiratoires particuliers sont exacts. En conséquence, il a été conclu que le volume courant obtenu à partir de la pléthysmographie est qualitative plutôt que quantitative évaluation 26. Les résistances des voies aériennes supérieures et inférieures sont des composants du système de pléthysmographie de créer une incertitude dans la mesure de 27 bronchoconstriction. Il est de l'avis de l'auteur que UWBP doit être utilisé sur l'autre avec des analyses envahissantes. Il est, en fait, la politique de certains journaux que les manuscrits uniquement basée sur des données de UWBP ne sera pas accepté. Ce sera une autre considération pour le lecteur.
En résumé, UWBP est une méthode utile pour mesurer les changements des paramètres respiratoires chez les rongeurs de laboratoire standard, notamment prêtent à des études longitudinales. Les principaux avantages de cette technique sont d'éviter les procédures invasives, chimiquesles défis et les besoins de l'anesthésie. Cela permet aux chercheurs de recueillir des données physiologiques qui représentent plus près les événements qui se produisent naturellement et réduire la variabilité expérimentale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
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