Summary
ההערכה של פיזיולוגיה נשימה הסתמכה באופן מסורתי על טכניקות, הדורשות איפוק או הרגעה של בעלי החיים. plethysmography כל הגוף בלתי מרוסן, לעומת זאת, מספק ניתוח מדויק, לא פולשנית, כמותי של פיזיולוגיה נשימה במודלים של בעלי חיים. בנוסף, הטכניקה מאפשרת חוזרת ונשנית בדרכי הנשימה הערכה של עכברים המאפשרים למחקרים ארוכים טווח.
Abstract
תפקוד לקוי של נשימה הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה בעולם ושיעורי התמותה ממשיכים לעלות. הערכה כמותית של תפקוד ריאות במודלים של מכרסמים היא כלי חשוב בפיתוח טיפולים עתידיים. בדרך כלל השתמש בטכניקות להערכת תפקוד מערכת הנשימה כולל plethysmography פולשנית ותנודה בכפייה. בעוד טכניקות אלה מספקים מידע רב ערך, איסוף הנתונים יכול להיות כרוך עם חפצים והשתנות ניסיונית בשל הצורך בהרדמה ו / או מכשור פולשני של בעלי החיים. בניגוד לכך, plethysmography בלתי מרוסן של כל הגוף (UWBP) מציע דרך מדויקת, לא פולשנית, כמותי, שעל ידי ניתוח פרמטרים בדרכי הנשימה. טכניקה זו תמנע את השימוש בהרדמה ומעצורים, המשותף לטכניקות plethysmography מסורתיות. וידאו זה מדגים את הליך UWBP כולל הציוד להגדיר הקלטת פונקצית כיול וריאות,. זהיסביר כיצד לנתח את הנתונים שנאספו, כמו גם לזהות את חריגים ניסיוניים וחפצים, הנובע מתנועה של בעלי החיים. הפרמטרים הנשימה שהושגו באמצעות טכניקה זו כוללים נפח של גאות ושפל, נפח דקה, מחזור עבודת שאיפה, קצב זרימת שאיפה ויחס של זמן השראה לזמן תפוגה. UWBP אינו מסתמך על כישורים מיוחדים והוא זול לביצוע. תכונה מרכזית של UWBP, ומושכת ביותר למשתמשים פוטנציאליים, היא היכולת לבצע מדידות חוזרות של תפקוד ריאות באותו בעל חיים.
Introduction
תפקוד לקוי של ריאות הוא אחד הגורמים המובילים לתחלואה ותמותה בעולם. המצב מאופיין בחילופי חמצן לקויים, לשם נרדפים לשיעול, כאבים בחזה וקוצר נשימה. חשבונות מחלה בדרכי הנשימה ל~ 10% מהתמותה בעולם 1. על פי ארגון הבריאות העולמי, שיעורי תמותה נקבעים לעלות עקב עישון מתמשך, זיהום וחומרים מגרים בעיסוק. UWBP היא תוספת שימושית לחקר פיזיולוגיה של ריאות, אשר מאוד מחמאות ביוכימיים מסורתיים והיסטולוגית מנתח 2. נהלים אחרים המשמשים להערכת ריאות אינם מספקים את אותם יתרונות שUWBP. plethysmography פולשנית היא טכניקה נפוץ הדורשת את בעל החיים לanesthetised 3,4 ובכך, מדידות בדרכי הנשימה וכתוצאה מכך אינן בהכרח משקפות את מצב טבעי. יתר על כן, הדרישה לאתגרי אוורור וכימי מכאניים מונעת מדידות עתיד 3,4.שיטה נוספת של איסוף נתונים בדרכי הנשימה היא על ידי תנודה בכפייה, שהוא יותר רגיש למעודן שינויים בפרמטרים בדרכי הנשימה בהשוואה לUWBP 5. תנודת כפייה היא, עם זאת, טכניקה פולשנית ודורשת הפסקה של בעלי חיים לאיסוף נתונים 5-7.
UWBP כולל הצבת בעלי חיים בתוך תא מיוחד. במהלך השראה, האוויר של גאות ושפל הוא חימם וhumidified בתוך ריאות הגדלת לחץ אדי מים וגורם להתפשטות תרמית של גז 8. אפקט זה גורם לשינוי נטו בנפח אוויר יצירת עלייה בלחץ בתוך תא plethysmograph 8. ההפך מתרחש במהלך פקיעת יצירת צורת גל נשימה מהחיה. ניתוח צורת גל לאחר מכן נעשה שימוש כדי למדוד מעקבות נשימה: קצב נשימה (נשימות / דקה), סך הכל זמן מחזור הנשימה (שניות), השראה / זמן תפוגה (Ti / טה, שניות) ושינויים בלחץ בשל כל כרך של גאות ושפל (P T). UWBP מספק ניתוח מדויק, לא פולשנית, כמותי של פיזיולוגיה נשימה במודלים של בעלי חיים והוא יכול לשמש למדידת ההתקדמות של מחלה בדרכי הנשימה ו6,9 תפקוד ריאות. בניגוד לטכניקות plethysmography אחרות, UWBP ימנע את השימוש בהרדמה, מעצורים ומניפולציות פולשנית המייצרות חפצים ו6,9 השתנות ניסיוניים. הרדמה יכולה לדכא נשימה,לשנות את קצב לב ויכול להיות מאתגר להסדיר 10. מגבלות לגרום לעלייה בנשימה עקב מתח נוסף באמצעות corticosterone ואפינפרין לשחרר 11,13. התכונה המרכזית של UWBP חוזרת על עצמו הערכה פיזיולוגית שהופכת אותו נוח למחקרים ארוכים טווח. UWBP מומלץ מאוד להערכת האורך של פיזיולוגיה ריאות ומציעה מיומנות חשובה להערכת תרופה בדרכי הנשימה בעתיד. בלאומיצין, ovalbumin, והיפוקסיה כבר נוצלו כדי לגרום לאתגרים בדרכי הנשימה במספר מחקרים וUWBP מודד את ההערכה פיזיולוגית ריאות מדויקות 7,9,13-16 בהצלחה. הפרוטוקול המתואר מיועד לעכברי מעבדה מבוגר סטנדרטיים. עם זאת, UWBP הותאם לבעלי חיים אחרים כגון חולדות, חזירי ים, ופרימטים שאינם בני אדם 17-20. UWBP אינו מוגבל רק להערכת תפקוד ריאתי, אך שימש גם להערכת ריאות התבגרות 3.צדדיות, הפשטות והשחזור של UWBP הקימו טכניקה מצוינת להערכת תפקוד הריאתי בבעלי חיים. תוכנה שונות (ראה חומרים ושולחן ציוד) תידרש לבצע הליך זה. מדען מנוסה יהיה מסוגל לבצע פרוטוקול זה עם עכבר בתוך שעה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הליך הניסוי הבא הוא אושר על ידי ועדת האתיקה בעלי החיים באוניברסיטת מונאש ונערך בהתאם לקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (2006). C57BL / 6 עכברים נקבה בוגרים השתמשו כדי ליצור את תוצאות הנציג התקבלו מהשירותים לבעלי חי מונאש. העכברים שוכנו במבוקר חדר הפתוגן חופשי, טמפרטורה ולחות ספציפית עם מחזור אור כהה 12 שעות. היו לי עכברים אלו גישה חופשית למזון ומים.
.1 הגדרה ראשונית
- חבר את המחשב הנייד / שולחן העבודה למחשב נתונים רכישה להקלטה באמצעות כבל USB.
- חבר את מגבר הגשר מ'פלט 1 'ל' קלט 1 'של המכונה רכישת נתונים באמצעות כבל BNC.
- הכנס את מתמר לחץ ל'ערוץ 1 'של אוקטלי גשר Amp. כבה את מכשיר רכישת נתונים על ולפתוח את תוכנת הניתוח. התוכנה צריך אוטומטיmatically לזהות התקנת הציוד (ראה חומרים ושולחן ציוד).
- הגדרות ערוץ פתוחות שנמצאו בסרגל התקנת הכלי של התוכנה. לשנות את מספר הערוצים שנרשם ל1.
- הגדר את הברומטר למדידת לחץ חדר ומנגנון העמודה מים לכייל את מגבר הגשר. מנגנון העמודה מים כולל טפטפות מזרק שני 5 מ"ל סרולוגיות מחוברת על ידי צינורות פלסטיק.
- מלא את העמודות במים ולהבטיח את רמות המים הן מאוזנות עם שליט. חבר צינור פלסטי לחלק העליון של כל פיפטה אחד. איור 2 מציג את העמודה המים שהוקמה.
2 גשר מגבר כיול
הערה: כדי לכייל את מגבר גשר הזרקה של אוויר לתוך העמודה המים נחוץ ליצירת סטיית H 2 O 1 סנטימטר. זה יתרחש תחת קבוצה אחת של תנאים ותלוי במנגנון של המשתמש. להבהרת פעולות הבאות דemonstrate איך מעבדה זו הייתה לבצע הכיול.
- לסגת מזרק 1 מ"ל ל300 μl; לצרף את המזרק לברזלים בסוף בצינור בצד ימין של העמודה המים. הערה: ודא שהברזלים פתוח למזרק ועמודת המים, וסגור לאוויר החדר. אם מפלס המים אינם מאוזנת, בשלב זה, להפוך את ברזלים כך שהוא פתוח לאוויר חדר ועמודת המים, זה יהיה לאזן מחדש את המים. צינורות בצד השמאלי של העמודה המים צריכים להיות מחוברים למתמר הלחץ כדי למדוד את השינוי בלחץ הנגרם על ידי צולל המזרק.
- צרף את צינורות מעמודת המים בצד שמאל למחבר במתמר הלחץ (טבעת העליונה של המתמר).
- בחר בתפריט הגלילה למטה מצא ליד ערוץ 1 במסך הראשי בצד ימין של התוכנה ובחר באפשרות "מגבר גשר" (ראה חומרים ושולחן ציוד).
- הזןההגדרות ל5 mV, נמוך לעבור 20 הרץ, וסמן את התיבה 'הפוך' ולחצו על 'אפס'. לחץ על 'אפס' כדי להגדיר את העקבות ב ~ 0 mV. להקטין את גודל החלון ל4: 1 לצפייה קלה.
- עם כל מה שהקים, לדכא את מזרק 1 מ"ל, והשאיר אותו במשך 3 שניות. זה ייראה ספייק פתאומי בתוכנה בגלל הלחץ השתנה. כאשר 300 μl מדוכא הלחץ יעבור מים בעמודת המים על ידי 1 סנטימטר. ערך ידוע זה יעזור לכייל את מגבר הגשר.
הערה: עליית הלחץ בתא בשל דיכאון μl 300 תואמת את ערך P K המשמש לחישובים מאוחר יותר. - בחירה 'יחידות קלט' שנמצאו בפינה השמאלית התחתונה של חלון הגשר Amp.
- סמן את "עקבות רקע" לפני ספייק הידוע בשם "Zero האזור".
- לחץ על החץ שליד 'נקודת 1' וזה יהיה לייצר bacאות kground בטווח של -0.002 mV-0.002 mV (מעולם לא הערך תהיה בדיוק ב0 mV).
- סוג '0' בחלון סמוך לחלון אות רקע.
- סמן את "אזור הלחץ המוגבר של גרף" מכאשר המזרק הוא בדיכאון. לחץ על החץ ליד להצביע 2 והערך צריך להיות בטווח של .9-1.2 mV.
- סוג '1' בחלון ליד החלון "לחץ מוגבר". להבהרה חזותית על צעדים 2.7 ו2.8 מתייחסים לאיור 3. ערכים נמצאו מחוץ לטווחים שצוינו עלול להצביע על נזק לאוקטלי גשר Amp.
- עבור אל 'מגדיר את היחידות שנמצאו בפינה הימנית העליונה של החלון ובחר באפשרות "CMH 2 O". אם אפשרות זו אינה זמינה, ייתכן שהוזן באופן ידני. לחץ על אישור.
- לחזור לתפריט 'גשר Amp' (עיין 2.1). בחר 1 מגבר mV ומוגדר 'אפס';. זה ישלים כיול ובבטחה ניתן להסיר את העמודה המים.
פונקצית .3 הקלטת ריאות
- לשקול את העכבר (ז). הערה: שבוע לפני ההערכה פיזיולוגית להציג את העכבר לסביבת תא plethysmography. זה יסייע בהתאקלמות ולהפחית את הלחץ בעת ביצוע הליך זה במועד מאוחר יותר. לסכמטי הכולל הוכחת התקנת UWBP, עיין באיור 4.
- מדוד את טמפרטורת הגוף עם מדחום רקטלי. לשמן את המדחום עם וזלין לפני ההחדרה. רשום את קריאת הטמפרטורה ולנקות את חומר הסיכה עם 80% (V / V) אתנול. אם שימוש בבעלי חיים קטנים מאוד כגון גורי עכבר יילודים, ערך טמפרטורת הגוף הממוצע יכול להיקבע עם מדחום אינפרא אדום במקום.
- הנח את הטמפרטורה / הבדיקה לחות היחסית בקצה אחד החור של חדר plethysmography. רשום את הטמפרטורה, לחות וbarometrלחץ ic בתוך חדר plethysmography לפני הצבת העכבר בתוך.
- מניחים את העכבר בתא plethysmography, לכסות את הקצה הפתוח מעט. הדבר זה מאפשר לעכבר כדי להתאקלם. סגור את התא.
- עם הבדיקה הטמפרטורה / לחות מוכנסת בצד השני של חדר plethysmography עם חור אחד, עכשיו תכניס את המתמר ומזרק בצד השני עם שני חורים.
- "התחל" לחץ על התוכנה ושיא לכ 15-45 שניות. שניות 5-10 רשומות של הנתונים שבו בעלי החיים לא זזו. תנועה תשנה פיזיולוגיה הנשימה הבסיסית של בעלי החיים ומספקת תוצאות עניות. נשימה צריכה להתנדנד במסלול ליניארי בתכנית. אלה הם נתונים שמישים. הערה: הטלה שתן או עשיית צרכימים יכולים להוביל לעלייה בטמפרטורה ולחות בתוך חדר plethysmography. זה לטשטש את תוצאות במהלך ניתוח. במקרה של הטלת שתן או הפרשת צואה, לעצור את ההקלטה באופן מיידי ולנקות את plקאמרי ethysmography עם 80% (V / V) אתנול. עיין באיור 6 לייצוג חזותי של תוצאות לא טובות, שבו יש לדחות נתונים.
- לאחר ההקלטה ל45 שניות, "עצור" לעיתונות על התוכנה (ראה חומרים וציוד שולחן) תכנית. הסר את העכבר מתא plethysmography ולהקליט את טמפרטורת החדר ולחות באופן מיידי. אל להקליט ללא הרף במשך יותר מ 45 שניות מכיוון שהדבר עלול להדגיש את בעלי החיים.
- החזר את העכבר לכלוב, ספריי ולנגב את החדר עם 80% (V / V) אתנול.
- לאפשר החדר לייבוש וחוזר לטמפרטורה ולחות הבסיסיות לפני שתמשיך לעכבר הבא. חזור על שלבים 3.1-3.9 לבעלי חיים שלאחר מכן. הערה: אם בעלי חיים רבים הם נחקרים, ודאו שטמפרטורת החדר והחזרת לחות לערכי בסיס ליד לפני כל חיה חדשה היא לשים בתא.
.4 Plethysmography ניתוח
לאte: כדי לחשב פרמטרים נשימה כגון נפח גאות (T V) ונפח דקת המשתנים הבאים צריכים להימדד: קצב נשימה (נשימות / דקה), נשימה כוללת זמן מחזור (שניות), השראה / זמן תפוגה (Ti / טה, שניות) ושינוי בלחץ בשל כל כרך של גאות ושפל (P T). איור 1 מדגימה את המשתנים הניתנים למדידה מעקבות. הצעדים הבאים משתמשים בתוכנה (ראה חומרים ושולחן ציוד) כדי למדוד משתנה אלה. בעת הניתוח, להימנע מאזורים של העקבות המכילות מרחרח או תנועה. לקבלת תוצאות לשחזור, לפחות 5 שניות של עקבות נשימה טובות נדרש. לדוגמא עקבות נשימה שונות מתייחס לאיור 5 ו -6.
- פתח את המסך למסך מלא, תצוגה מוגדרת 1: 1 ובחר 5 שניות של נתונים שימושיים. תמונת מצב מייצגת של זו שמוצגת באיור 5.
- פתח את חלון פנקס נתונים המיני מצא בחלק העליון של פרוגרם בכרטיסיית DataPad. בחר ערוץ 1 ובחר 'מדידות מחזור' בעמודה השמאלית ו'גובה מחזורי ממוצע 'בעמודה הימנית.
- בחר "אופציה" ולהגדיר את קנה המידה לזיהוי שיא מינימום ל1 (אלפיות שני). זה יאפשר זיהוי של כל ערך שיא והופך להיות חשוב מאוד בעת שימוש בבעלי חיים קטנים המייצרים תנודות קטנות.
- לחץ על 'אישור'. זה יציג "סטיית לחץ בשל כל כרך של גאות ושפל 'מדידה (T P).
- בפנקס נתונים המיני, "מדידות מחזור 'בחרו ואחריו" ספירת אירוע' ולחצו על 'אישור'. זה יציג את 'התדר' (ו) מדידה.
- תדר צריך להיות מומר לנשימות / דקה. הדבר נעשה על ידי הכפלת הערך על ידי 60 שניות וחלוקת התשובה על ידי הזמן הכולל של הקלטה (דקות).
- בפנקס נתונים מיני סי, בחר 'מדידות CLE 'ואחריו' התקופה 'ולחץ על' אישור '. זה יציג את 'זמן מחזור הנשימה הכולל' מדידה (tot T, שניות).
- השלבים הבאים משמשים ליצירת macroinstruction ליצור ערכי זמן השראה ופקיעת שיא. להבטיח את הסמן הוא ישירות על המקסימום של השיא / השפל ולהוסיף הערה על 9 נקודתי שיא ושפלים רציפים. תתחיל עם השיא של התנודה כפי שמוצג באיור 5.
- בהמשך לכך, חלון בחר: כרית נתונים ועמודה .1 בחלון שמופיע לחץ על 'מידע בחירה' בעמודה השמאלית, 'המשך' בעמודה ימנית ולחץ על 'אישור'.
- בחר מאקרו שנמצא בחלק העליון של תכנית ולאחר מכן להתחיל בהקלטה. פקודות עכשיו בחרו: 'מצא', 'לך', 'התחלה של קובץ' ולחץ על 'מצא'.
- בחירת פקודות: 'מצא' ו 'מצא את ההערות ". הקלד את אותו הביטוי שהוקלד לתיבת ההערה בתיבה 'מכילה' סיפקה. בחר בכרטיסייה 'בחר לנקודה קודמת' ו 'מצא'.
- בחירת פקודות: 'הוסף לכרית נתונים'. הבא, בחר מאקרו: פקודות מאקרו ולהתחיל לחזור. חלון הספירה החוזרת שמופיע צריכה להיות מוגדר ב 9.
- בחר פקודה: "מצא הבא". הפקודה בחר: "הוסף לפנקס נתונים '. לבסוף בחר פקודות מאקרו וחזור על הסוף.
- כעת בחר את המאקרו ולהפסיק את ההקלטה. שמור ושם המאקרו לאחר מספר בעלי החיים. הערה: הגדרת מאקרו עבור כל חיה מאפשרת מאקרו כדי לשמש למחקרים ארוכי טווח וחוסך זמן.
- מאקרו כעת ניתן להפעיל כדי להשיג את ההשראה (ט ט) והפקיעה (ה T) זמן בין כל תגובה. הנתונים יופיעו תחת ערוץ 1 של datapad. פקיעה והשראה מתרחשת ברציפות והנתונים יופיעו בצו זה.
- הנתונים צריכים להיות מפוצלים באופן ידני לערכי השראה ופקיעה. ממוצע ארבעה ערכי נתונים של כל אחד מפרמטרים כדי לקבל את T אומר שאני וT הדואר.
- ברגע שהערכים העיקריים כבר נגזרו נפח הגאות (V T, מ"ל) ניתן לחשב. כדי להשיג את נפח גאות המשוואה של Drorbaugh ופן 8 משמשת:
V T (מ"ל) = (P T / P K) x x (V K) ((T CORE (P B - C P)) / (T CORE (P B - P C) - T C (P B - P CORE)))
איפה
T V: כרך Tidal
k P: סטיית לחץ בשל כל זריקה של 1 מ"ל (עיין בשלב 2.5)
ליבת T: טמפרטורת ליבה של כל חיה
P C: לחץ אדי מים בלחות יחסית X טמפרטורת החדר בצ'הmber
T C: טמפרטורה בתא בעלי החיים
ליבת P: לחץ בטמפרטורת גוף (לחץ אדי מים בטמפרטורת גוף x 1.0)
t P: סטיית לחץ בשל כל כרך של גאות ושפל
k V: הזרקת נפח לכיול
P B: לחץ ברומטרי - ברגע שהנפח של גאות ושפל כבר מחושב גם ניתן לקבוע את הפרמטרים הבאים:
- נפח דקה (מ"ל / דקה) = xf V T
- נפח דקה (מ"ל / דקה / קילוגרם) = (V T XF) / משקל גוף (קילוגרם)
- T V (מ"ל / קילוגרם) = V T / משקל גוף (מ"ל) (קילוגרם)
- מחזור עבודת שאיפה (%) = T i / T tot
- שאיפת קצב זרימה (שניות מ"ל /) = V T / T i
- יחס של זמן השראה לעת פקיעה = T i / e T
- זמן מחזור כולל (שלEC) = זמן השראה (שניות) + זמן תפוגה (שניות)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר הליך זה כבר אחרי בצורה נכונה, עקבות נדנוד עקביות נוצרה על תוכנת ניתוח נתונים. ההליך מספק עקבות נשימה תוך מספר דקות לאחר התקנה עם חישובי מחשוב פשוטים כדי לקבוע פרמטרים נשימה מפורטים. איור 5 מייצגים עקבות נשימה מתאימות משליטה בעכבר (בריא). נתונים נדנוד מתאימים נוצר כאשר בעל החיים הוא לא באופן פעיל בתנועה.
UWBP היא הערכה מאוד שימושית ואמינה של תפקוד ריאות בין שליטה ועוקבת פיברוזיס ריאתי. איור 7 ממחיש את תפקוד הריאות של עכבר עם פיברוזיס ריאתי מושרה בלאומיצין ביום 14. בהשוואה לגרף השליטה, איור 7 ממחיש את הבדל חזותי עולה בקנה אחד עם ממשל בלאומיצין 7. כפי שצוין לעיל, ההליך ניתן לחזור ומאפשר לנו לצפות בשינויים בparamete הנשימהrs לאורך זמן בין שתי קבוצות אלה.
תוצאות שהתקבלו הן לבוא לידי ביטוי כאמצעי ± SEM. מומלץ להעתיק ולהדביק את הנתונים שנאספו לתוך גיליון אלקטרוני של Excel פשוט. זה יהפוך שימושי לביצוע חישובים שנדונו בצעדים 4.13 & 4.14. תפקודי נשימה ניתן להשוות באופן חזותי בין שתי קבוצות כפי שמודגם באיור 8.
איור 1 רכיבים שונים של מחזור הנשימה מאויר באמצעות plethysmography ברומטרי. גרף זה ממחיש) השינוי בלחץ עקב ההשראה (ΔPi), ב) השינוי בלחץ בשל כל כרך של גאות ושפל (PT), ג) שינוי בלחץ עקב פקיעה, ד) זמן כולל מחזור הנשימה (Ttot), ה) זמן השראה (TI) וו) זמן תפוגה (ΔPe) (Te). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2 ייצוג חזותי של התקנת העמודה הברומטר ומים. הדמות נועדה לסייע לקורא בהקמת העמודה הברומטר ומים לתהליך הכיול. שים לב למים הוא רמה בתוך שתי העמודות נעזרו בשליט. שתי העמודות מחוברות באמצעות 15 סנטימטר של צינורות פלסטיק. צינורות מהימין (65 סנטימטר) מחוברים למזרק 1 מ"ל ולשמאל (75 סנטימטר) מתמר הלחץ צמוד למכונה רכישת נתונים. הערה:. האורך של צינורות קובע את עוצמת הקול (300 μl) נדרש לעבור 1 סנטימטר של מים לחץ כאן לצפייהתמונה גדולה יותר.
הבמה 3 איור צעדים 2.4 ו2.5 של גשר Amp כיול. נתון זה ממחיש את השלבים 2.7 ו2.8 לכיול של הציוד. זה חיוני כדי לתקן את Amp הגשר כדי להשיג תוצאות מדויקות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4 סכמטי כוללת של התקנת UWBP. משמאל הבדיקה לחות / טמפרטורה מחוברת לצד אחד של חדר plethysmography המכיל את בעלי החיים. מימין מוביל מזרק כיול ומתמר לחץמתא plethysmography למערכת רכישת נתונים הפקת עקבות נשימה במחשב. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5 דוגמא לעקבות נשימת נשימה מעכבר שליטת C57Bl / 6 מתקבל בעת שימוש UWBP. עקבות נשימה זו ממחישות הנתונים מתאימים, עולים בקנה אחד מבעלי חי שליטה. תשע הערות רצופות מתווספות בנקודתי השיא והשפלים של נשימת תנודות לקבל הפרמטרים בדרכי הנשימה הרשומים על ידי ביצוע שלבי 4.1-4.13. זמן מיוצג לאורך ציר x (שניות) ולחץ שינויים לאורך ציר y (cm.H 2 O). לחץ כאן לVIew תמונה גדולה יותר.
איור 6 דוגמאות של העקבות הכי מוצלחות שונות שהתקבלו מעכבר C57Bl / 6 בעת שימוש UWBP. תוצאות לא אופטימליות יכול להיות מבולבל כנתונים מתאימים והוא המקור הנפוץ ביותר לניתוח ירוד. נתון זה ממחיש את העקבות הכי מוצלחות הנפוצות ביותר שלא צריך להיות בשימוש לניתוח. עקבות נשימה אלו מראות) עקבות נשימה נרשמו בעוד החיה מרחרחת ומרגשת שינוי הפיסיולוגיה הנשימה הבסיסית של בעלי החיים. ב) עקבות נרשמו כתוצאה מתנודות בהדרגה להגדיל לאורך הזמן היא בדרך כלל נגרמות על ידי עיבוי ולחות להצטבר. עם זאת, העקבות עשויות להיות מתוקנות על ידי ניגוב קאמרי plethysmography עם אתנול או על ידי חזרה על שלבי הכיול. ג) עקבותשנרשם במהלך התנועה הקאמרית plethysmography בעוד החיה או החוקר היא לעסוק עם הציוד. הזמן מיוצג לאורך ציר x (שניות) ולחץ שינויים לאורך ציר y (cm.H O 2). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7 דוגמא לעקבות נשימה מתקבלות מC57Bl עכבר / 6 עם פיברוזיס ריאתי נגרם בעת שימוש UWBP. עקבות נשימה זו ממחישות הנתונים מתאימים, עולים בקנה אחד מבעלי חיים עם ריאות מושרה מתקבלות בעת שימוש בהליך UWBP המתואר במאמר זה. תשע הערות רצופות מתווספות בנקודתי השיא והשפלים של נשימת תנודות לקבל הפרמטרים בדרכי הנשימה הרשומים על ידי ביצוע שלבי 4.1-4.13. זמן הוא represented לאורך ציר x (שניות) ולחץ שינויים לאורך ציר y (cm.H 2 O). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
.8 תפקודי נשימת איור השוואה בין השליטה ובלאומיצין תיגר C57Bl / 6 עכברים. ביצוע ניתוח plethysmography לאחר שימוש UWBP יאפשר למשתמש לתוצאות דומות למה שמיוצג כאן. נתון זה ממחיש את ההבדלים הפיסיולוגיים בין בעלי החיים בלאומיצין תיגר (קו אפור מנוקד) ובעלי החיים שליטה (קו שחור מוצק). גרפים אלו מראים השוואות ב) זמן תפוגה (שניות), ב) זמן השראה (, ג) מחזור השראה (%) שניות), ד) זרימת שאיפת שיעור (מ"ל / sec)ה) קצב נשימה (נשימות / דקה), ו) דקה נפח (מ"ל / דקה / קילוגרם), ז) נפח Tidal (מ"ל / קילוגרם) וh) זמן מחזור סה"כ (שניות). נתוני תפקוד ריאות נאספו אורכים באותה הקבוצה של בעלי חיים בימים 0, 7, ו14 הבאים אתגר bleomycin. נציגי נתונים הותאם ממרפי et al. (2012) 16. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה המתוארת כאן היא שיטה לא פולשנית להערכה של פרמטרים בדרכי הנשימה של עכברים חסרי מעצורים וunanesthetized. נקודות החוזק של פרוטוקול זה כולל פשטות שלו ודיוק כדי למדוד את תפקוד ריאות אורכים עם חפצים מינימאליים. יש, עם זאת, יש מספר מגבלות וצעדים קריטיים ללציין על ההליך. ראשית והכי חשוב, העכבר חייב להישאר רגוע בתוך החדר למשך תקופה מינימאלית של חמש שניות. לחץ נוסף ישבש את דפוס הנשימה של העכבר, ולכן לספק תוצאות משתנים (איור 6 א). חסרון זה צפוי להישאר והוא צפוי בזמנים. עם זאת, החלפת העכבר בכלוב בבית שלה ומאפשר לו זמן לחזור ולהתיישב בקלות לתקן את זה. זה חיוני כי בעלי החיים מרגישים נוחים בסביבה הקאמרית להשיג חמש שניות של הנתונים מתאימים / שמישים. שיקול נוסף נדרש לגבי סביבת החדר. הסביבה, unrelated למכניקת נשימה, יכול להשפיע באופן משמעותי את תוצאות. כמשך עליות הערכה, לחות והטמפרטורה של העליות קאמריות, כמו גם ירידה בחמצן זמין, המשפיע באופן משמעותי על אוורור. העיתוי של אוורור מגביר את לחות וטמפרטורה של החדר, כמו גם ירידה בחמצן זמין 21. דליפה קטנה בתא יכולה לסייע בהפחתת מרחף תרמית שנוצר מייצור חום 22,23. הפרוטוקול נדון הוא ספציפי לציוד והמכשור הרשום. כיול של מגבר הגשר בסעיף שני יהיה תלוי בציוד של הקורא. אם גורמים כגון אורך צינורות שונים הזרקת 300 μl של אוויר לא תגרום לסטיית 2 O cm.H 1.
ישנם גם הבדלים פיסיולוגיים תלוי בזמן של ניתוח. מכרסמים הם יצורים טבעיים ליליים ומחזורי היממה, שסופו של דבר ליצור שינויים בנשימה, יש לקחת בחשבון בעת תזמון הניסויים 24. זהו אפוא צורך הזמן ולתכנן הניסויים כאלה שנתוני ניסוי ניתן להשוות באופן מדויק בין קבוצות. כמו כן, חשוב לשים לב לתנועת העקבות. אם התנודות לא פועלות בדפוס ליניארי, זה בדרך כלל עקב הצטברות של אדים או לחות בתוך התא (6 ב איור), או חותם בלתי יעיל בתא. סופו של דבר, אפשר להסביר מגבלות אלה ולתהליך UWBP מבוצעים כראוי כדי לספק מדידת נשימה מדויקת. כמו כן, חשוב לציין כי שיטה זו תדרוש שינוי (גודל תא קטן יותר) למדידת שינויים בדרכי הנשימה בעכברי מעבדה סטנדרטית בילוד (למשל, <2 שבועות C57Bl / 6) כדי לזהות שינויי לחץ בנשימה של בעלי חיים בגודל כזה .
למרות UWBP מדגים יתרונות משמעותיים זה גם נושא מחלוקת.חוקרים צריכים להכיר את הדיון ולקבל החלטה מושכלת אם טכניקה זו היא מתאימה לשאלת המחקר. בתחילה, Drorbaugh ופן (1955) 8 האמינו שעלייה בלחץ התא נגרמת על ידי אוויר השראה שחממה וhumidified לערכים ריאתי; ההפך קרה בפקיעה. זה אפשר חישוב הנפח של גאות ושפל. מחקר שלאחר מכן נחשב כי שינויי הלחץ נגרמו על ידי שינוי לחץ alveolar בדור של זרימת אוויר 25. עבודה זו האמורה השימוש בplethysmography לחישוב התנגדות בדרכי נשימה. Enhorning et al. (1998) 26 סיפקו ראיות לכך שנפח של גאות ושפל, קצב נשימה והתנגדות בדרכי אוויר כל תנודות לחץ ההשפעה בתוך תא plethysmography. כאשר האוויר בחדר מחומם וhumidified לתנאי גוף תנודות לחץ מופחתות על ידי שני שליש והם מוגברים באמצעות התנגדויות מוגברות <sup> 21. כפי שכל המרכיבים הללו משקפים תנודות בלחץ יש מחלוקת אם מדידות של פרמטרים בדרכי הנשימה מסוימים הן מדויקות. כתוצאה מכך זה כבר הגיע למסקנה שנפח של גאות ושפל המתקבל מplethysmography הוא איכותי ולא הערכה כמותית 26. שתי התנגדויות בדרכי הנשימה העליונות ותחתונות הן רכיבים של מערכת plethysmography יצירת אי ודאות במדידת ברונכוקונסטריקציה 27. זה של דעתו של המחבר שיש להשתמש UWBP הדדי עם ניתוחים פולשניים. הוא, למעשה, המדיניות של כתבי עת מסוימות שכתבי יד המבוססת אך ורק על נתונים UWBP לא תתקבל. זה יהיה שיקול נוסף לקורא.
לסיכום, UWBP היא שיטה שימושית למדידת שינויים בפרמטרים בדרכי הנשימה במכרסמים מעבדה סטנדרטית, נוחים במיוחד למחקרים ארוכים טווח. יתרונות עיקריים של שיטה זו הם ההימנעות מהליכים פולשניים, כימיאתגרים ודרישה של הרדמה. הדבר זה מאפשר לחוקרים לאסוף נתונים פיסיולוגיים המייצגים באופן הדוק ביותר אירועים מתרחשים באופן טבעי ולהפחית את השונות ניסוייות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M.
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
