Summary
호흡 생리학의 평가는 전통적으로 동물의 억제 또는 진정을 요구 기술에 의존하고있다. 무제한 전신 혈량 측정법은, 그러나, 동물 모델에서 호흡 생리의 정확하고 비 침습적 정량 분석을 제공합니다. 또한, 기술은 종 연구를 허용 마우스의 호흡 평가를 반복 할 수 있습니다.
Abstract
호흡기 장애는 최고의 세계에서 이환율과 사망률의 원인과 사망의 비율이 계속 증가 중 하나입니다. 설치류 모델에서 폐 기능의 정량 평가는 미래의 치료법의 개발에 중요한 수단이다. 일반적 침습적 혈량 측정법 및 강제 진동 포함 호흡 기능을 평가하는 기술을 사용했다. 이러한 기술은 가치있는 정보를 제공하지만, 데이터 수집 인해 마취 및 / 또는 동물의 침습 계측 필요성 인공물과 실험 가변성을 내포 할 수있다. 반면, 무제한 전신 혈량 측정법 (UWBP)은 호흡기 매개 변수를 분석하는 기준에 정확하고 비 침습적 정량 방법을 제공합니다. 이 기술은 기존의 기술 혈량 측정법에 공통 마취와 감금의 사용을 피한다. 이 동영상은 기기 설정, 교정 및 폐 기능의 기록을 포함하여 UWBP 절차를 시연 할 예정이다. 그것은수집 된 데이터를 분석하고,뿐만 아니라 동물의 이동으로 인한 실험적 인공물과 특이점을 식별하는 방법을 설명 할 것이다. 이 기술을 사용하여 수득 호흡 파라미터 호흡량, 체적 분, 흡기 듀티 사이클, 흡기 유량과 만료 시간에 흡기 시간의 비율을 포함한다. UWBP는 전문 기술에 의존 수행 저렴하지 않습니다. 잠재적 인 사용자에게 가장 매력적인 UWBP 키의 기능과 동일한 동물에 폐 기능의 반복 된 측정을 수행 할 수있는 능력이다.
Introduction
폐 기능 장애는 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 조건은 기침, 가슴 통증 및 호흡 곤란과 동의어 함 산소 교환이 특징입니다. 사망률 세계 1 ~ 10 %에 대한 호흡기 질환 차지한다. 세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 사망률은 지속적으로 흡연, 환경 오염 및 직업 자극에 의한 상승으로 설정됩니다. UWBP 강하게 전통적인 생화학 칭찬 조직 학적는이 분석 폐 생리학을 공부하는 데 유용한 추가이다. 폐 평가를 위해 사용 된 다른 절차 UWBP와 동일한 장점을 제공하지 않는다. 침략 혈량 측정법은 동물이 3,4 anesthetised 할 수있어, 그 결과 호흡 측정이 반드시 자연 상태를 반영하지 않습니다 필요로하는 일반적으로 사용되는 기술이다. 또한, 기계 환기 및 화학 문제에 대한 요구 사항은 향후 측정 3,4 배제.호흡 데이터를 수집하는 또 다른 방법은 UWBP 5에 비해 호흡 파라미터의 변화를보다 세밀한 더 민감 강제 진동에 의해서이다. 강제 진동 그러나 침습적 인 기술이며, 데이터 수집을위한 동물 5-7 종료를 요구한다.
UWBP는 전문 챔버 내부에 동물을 배치하는 것을 포함한다. 영감 동안 조력 공기는 가온되고 물의 증기압을 증가 폐 내에 가습 가스 (8)의 열팽창을 발생. 이 효과는 plethysmograph 실 (8) 내의 압력의 증가를 생성 풍량의 순 변화시킨다. 반대는 동물에서 호흡 파형을 생성 만료시 발생합니다. 파형 분석은 다음 호흡 추적에서 측정하는 데 사용됩니다 : 호흡 속도 (호흡 / 분), 총 호흡 사이클 시간 (초), 영감 / 만료 시간 (티 / 테, 초) 인해 각 호흡량에 대한 압력의 변화 (P T). UWBP은 동물 모델에서의 정확한 생리 호흡기, 비 침습적, 정량 분석을 제공하고, 호흡기 질환 및 폐 기능 6,9의 진행을 측정하기 위해 사용될 수있다. 혈량 측정법 다른 기술과는 달리, UWBP 마취, 구속 및 인공물 및 실험 가변성 6,9 생산 침습적 조작의 사용을 피한다. 마취는 호흡을 억제 할 수심장 박동을 변경하고 열을 조절하기 어려울 수 있습니다. 코르티 코스 테론과 에피네프린 11,13 해제를 통해 감금으로 인해 추가적인 스트레스 호흡의 증가를 유도한다. UWBP의 주요 기능은 종의 연구에이 의무가 만드는 생리 학적 평가를 반복한다. UWBP 강하게 폐 생리학의 길이 평가 추천 및 미래의 호흡기 약물 평가를위한 가치있는 기술을 제공합니다. 블레오 마이신, 오브 알부민, 및 저산소증은 몇몇 연구에서 호흡 문제를 유도하기 위해 이용되었고 UWBP 성공적 정확한 폐 생리 7,9,13-16 평가를 측정 하였다. 설명하는 프로토콜은 표준 성인 실험실 쥐를 위해 설계되었습니다. 그러나 UWBP는 래트, 기니아 피그 및 영장류 17-20로 다른 동물에 적용되었다. UWBP은 폐 기능 장애를 평가에 한정되지 않고, 또한 폐 성숙 (3)의 평가를 위해 사용되었다.UWBP의 다양성, 단순하고 재현성 동물의 폐 기능을 평가하기위한 훌륭한 기술을 설립했다. 다양한 소프트웨어 (재료 및 장비 표 참조)이 절차를 수행해야합니다. 숙련 과학자 1 시간 내에 마우스이 프로토콜을 수행 할 수있을 것이다.
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Protocol
참고 : 다음 실험 절차는 모나 쉬 대학의 동물 윤리위원회의 승인을 과학적 목적을위한 동물의 관리 및 사용 (2006)에 대한 연습의 호주 코드에 따라 수행된다. 대표적인 결과를 생성하는 데 사용 성인 여성의 C57BL / 6 마우스는 모나 동물 서비스로부터 수득 하였다. 마우스는 12 시간 명암주기에 특정 병원균 무료, 온도 및 습도 조절 실에 보관 하였다. 이 마우스는 음식과 물을 무료로 이용할 수 있었다.
1 초기 설정
- USB 케이블을 통해 기록하기위한 데이터 수집 시스템으로 노트북 / 데스크탑을 연결합니다.
- BNC 케이블을 통해 데이터 수집 시스템의 '입력 한'에서 '출력 1'에서 브리지 앰프를 연결합니다.
- 진수 브리지 앰프의 '채널 1'에 압력 변환기를 삽입합니다. 에 대한 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 분석 소프트웨어를 엽니 다. 소프트웨어 자동해야자동적 (재료 및 장비 표 참조) 장비 설치를 감지합니다.
- 소프트웨어의 설치 도구 모음에있는 오픈 채널 설정. 변경 채널의 수는 (1)에 기록된다.
- 실내 압력과 브리지 증폭기를 보정 물기둥 장치를 측정하는 기압계를 설정. 물 열 장치는 플라스틱 튜브로 연결이 5 ㎖의 혈청 학적 주사기 피펫을 포함한다.
- 물에 열을 채우고 수위가 통치자와 균형을 보장합니다. . 각 피펫의 상단에 플라스틱 튜브의 한 조각을 연결합니다이 그림은 물 열 설정을 보여줍니다.
2 다리 앰프 교정
주 : 수층으로 브리지 앰프보기 공기의 분사를 보정하는 1cm H 2 O 편향을 만들 필요가있다. 이 조건 중 하나의 세트에서 발생하고, 사용자의 장치에 의존 할 것이다. 명확한 설명을 위해 다음 단계 ㄹ이 연구소는 보정을 수행하는 방법을 emonstrate.
- 300 μL에 1 ML의 주사기를 철회; 수층의 오른쪽에 호스의 끝에 콕에 주사기를 장착. 참고 : 꼭지는 주사기와 물 열에게 열려 있는지 확인하고 실내 공기에 마감했다. 수위가이 시점에서 균형을하지 않는 경우는 실내 공기와 물 컬럼 열려 있는지,이 물을 재조정 할 수 있도록, 꼭지를 틀어 라. 수층의 좌측 튜브 주사기 급락에 의한 압력 변화를 측정하는 압력 변환기에 연결한다.
- 압력 변환기 (변환기의 톱링)의 커넥터 왼쪽에 물기둥에서 튜브를 부착.
- 소프트웨어의 오른쪽에있는 메인 화면에서 1 채널 및 "브리지 A를"(재료 및 장비 표 참조)을 선택 옆에있는 스크롤 다운 메뉴를 선택합니다.
- 입력5 MV, 20 Hz에서 로우 패스에 설정이 '반전'상자를 체크하고 '제로'를 클릭합니다. 0 ~ MV에 추적을 설정하는 '영'을 클릭합니다. 보기 쉽게 1 : 4로 창 크기를 줄입니다.
- 설정 모든으로, 3 초 정도를 떠나, 1 ML의 주사기를 우울. 압력이 변경 되었기 때문에 이것은 소프트웨어에 급격한 스파이크를 보여준다. 300 ㎕의 우울하면 압력은 1cm에 의해 물 열에서 물을 이동합니다. 이 알려진 값은 브리지 앰프를 교정하는 데 도움이됩니다.
NOTE : 300 μL 인해 우울증 챔버 내의 압력 증가가 나중에 계산에 사용 K P 값에 대응한다. - 브리지 앰프 창의 왼쪽 아래에있는 '입력 장치'를 선택합니다.
- 이전에, 그렇지 않으면 '제로 지역'으로 알려진 스파이크에 "배경 추적을"강조 표시합니다.
- 다음 '점 하나'에있는 화살표를 클릭하고이 혈중 알코올 농도를 생성합니다-0.002 MV-0.002 MV의 범위 내에서 kground 신호 (값이 정확히 0 MV에서 결코).
- 유형 "0"창에 백그라운드 신호 창에 인접.
- 주사기 밟으면에서 "증가 된 압력의 그래프 영역을"강조. 이 지점 옆에있는 화살표를 클릭하고 값은 0.9-1.2 MV의 범위에 있어야합니다.
- 유형 '하나'옆에있는 "압력이 증가"창으로 창. 단계 2.7 및 2.8에 대한 시각적 설명이 들어 진수 브리지 앰프에 손상을 나타낼 수 있습니다 지정된 범위 외부에서 검출 3. 값을 그림을 참조하십시오.
- 창의 오른쪽 상단 모서리에 발견 '단위 정의'를하고 "CMH이 O"로 이동합니다. 이 옵션을 사용할 수없는 경우, 수동으로 입력 할 수 있습니다. 확인을 클릭합니다.
- '브리지 앰프'메뉴로 돌아 가기 (2.1 참조). '제로'로 한 뮤직 비디오 및 설정 앰프를 선택;. 이 교정을 완료하고 물 열 안전하게 제거 할 수 있습니다.
3 녹화 폐 기능
- 마우스 (g)를 달아. 참고 : 이전에 생리 학적 평가에 대한 하나의 주는 혈량 측정법 실 환경에 마우스를 소개합니다. 이 적응에 도움이와 나중에이 절차를 수행 할 때 스트레스를 줄일 수 있습니다. UWBP 설정을 보여 전체 회로도를 들어, 그림 4를 참조하십시오.
- 직장 온도계 본체의 온도를 측정한다. 삽입하기 전에 석유 젤리 온도계를 윤활합니다. 온도 값을 기록하고 80 % (v / v) 에탄올로 윤활제를 닦아. 이러한 신생 마우스 새끼 매우 작은 동물을 사용하는 경우, 평균 체온 값 대신 적외선 온도계로 측정 할 수있다.
- 혈량 측정법 실의 한 홀 끝의 온도 / 상대 습도 프로브를 놓습니다. 온도, 습도, barometr를 기록내 마우스를 배치하기 전에 혈량 측정법 챔버 내부의 IC 압력.
- , 혈량 측정법 챔버에 마우스를 놓고 약간 오픈 엔드 커버. 이 마우스가 순응 할 수 있습니다. 챔버를 닫습니다.
- 한 구멍이 혈량 측정법 챔버의 측면에 삽입 온도 / 습도 프로브, 지금이 구멍과 타측에서 변환기와 주사기를 삽입한다.
- 약 15 ~ 45 초 동안 소프트웨어 프로그램 및 기록에 눌러 '시작'. 동물이 이동되지 않는 데이터의 기록 5 ~ 10 초. 운동은 동물의 기초 호흡 생리를 변경하고 가난한 결과를 얻을 수있을 것입니다. 호흡은 프로그램에 대한 선형 경로에 진동한다. 다음은 사용 가능한 데이터입니다. 참고 : 배뇨 또는 배변은 혈량 측정법 챔버 내부의 온도 증가와 습도로 이어질 수 있습니다. 이 분석에서 결과를 모호하게됩니다. 배뇨 또는 배변의 경우, PL 즉시 녹화를 중지 및 청소80 % (v / v)로 에탄올 ethysmography 실. 데이터가 거부되어야 차선의 결과를 시각적으로 표현한 그림 6을 참조하십시오.
- 소프트웨어에 45 초를 눌러 '중지'에 대한 기록 후 프로그램 (자재 및 장비 표 참조). 혈량 측정법 실에서 마우스를 제거하고 즉시 챔버의 온도와 습도를 기록한다. 이 동물을 강조 수 있으므로 지속적으로 이상 45 초 동안 기록하지 마십시오.
- 케이지, 스프레이에 마우스를 반환 80 % (v / v) 에탄올로 챔버를 닦습니다.
- 챔버 건조하고 다음 마우스로 진행하기 전에 기준 온도와 습도로 돌아 허용합니다. 반복 3.1 이후 동물 용 3.9 단계를. 참고 : 여러 동물 연구되고있는 경우, 각각의 새로운 동물 전에 근처의베이스 라인 값으로 챔버 온도 및 습도 반환 챔버에 배치되어 있는지 확인합니다.
4 혈량 측정법 분석
없음테 : 같은 호흡량 (V의 T) 다음과 같은 변수를 측정 할 필요가 분 볼륨과 호흡 매개 변수를 계산하기 : 호흡 속도 (호흡 / 분), 총 호흡 사이클 시간 (초), 영감 / 만료 시간 (티 / 테를, 인해 각 회 호흡량 (P T). 초)와 압력의 변화가 1 트레이스에서 측정 될 수있는 변수를 도시 한 도표. 다음 단계는 이러한 변수를 측정하기 위해 소프트웨어 (참조 : 재료 및 기기 테이블)을 사용한다. 분석 할 때, 냄새 또는 이동 포함하는 추적의 지역을 피하십시오. 재현 가능한 결과를 들어, 좋은 호흡 추적의 5 초 이상이 필요합니다. 다른 호흡 흔적의 예를 들어 5와 그림 6을 참조하십시오.
- 일을하고 사용할 수있는 데이터의 5 초를 선택 하나에 전체 화면으로 설정보기를 엽니 다. 이것의 대표적인 스냅 샷은 그림 5에 표시됩니다.
- 프로의 상단에있는 미니 데이터 패드 창을 엽니 다DataPad 탭에서 g. 채널 1을 선택하고 오른쪽 열에서 왼쪽 열에서 '사이클 측정'및 '평균주기 높이'를 선택합니다.
- '옵션'을 선택하고 한 (밀리 초)에 최소 피크 검출을위한 스케일을 설정합니다. 이것은 모든 피크 값의 검출을 허용하고 작은 진동을 만들어 작은 동물을 사용하는 경우 매우 중요하게됩니다.
- '확인'을 클릭합니다. 이것은 (P의 T) 측정 '으로 인해 각 호흡량에 압력 편향'을 발표 할 예정이다.
- 미니 데이터 패드에서 '이벤트 카운트'와 다음 선택 '사이클 측정' '확인'을 클릭합니다. 이것은 '주파수'(F)의 측정을 제공한다.
- 주파수는 호흡 / 분으로 변환 할 필요가있다. 이 60 초만큼 값을 곱한 (분) 기록의 전체 시간에 답을 분할하여 수행됩니다.
- 미니 데이터 패드에서 [ 'CY사이클 측정 기간 '다음' '후 "확인"을 클릭합니다. 이것은 "전체 호흡주기 시간 (T의 TOT, 초) 측정을 제시한다.
- 다음 단계는 피크 영감과 만료 시간 값을 생성하기 위해 macroinstruction을 만드는 데 사용됩니다. 커서가 피크 / 저점의 최대 바로 위에 확인하고 9 연속 최고점과 최저점에 댓글을 추가 할 수 있습니다. 도 5에 도시 된 바와 같이 진동의 피크 시작한다.
- 그 후, 선택 창 : 데이터 패드와 오른쪽 열에서 왼쪽 열, '기간'에서 '선택 정보'를 클릭하고 '확인'을 클릭하여 나타나는 창에서 열 1.
- 프로그램의 맨 위에 매크로 선택한 후 녹음을 시작합니다. 이제 선택 명령 : '파일의 시작', '이동', '찾기'와 '찾기'를 클릭합니다.
- 선택 명령 '의견을 찾기' '찾기'와. 제공되는 '포함'상자에 설명 상자에 입력 한 동일한 구문을 입력합니다. '선택 이전 포인트'탭을 선택하고 '찾기'.
- 선택 명령 : '데이터 패드에 추가'. 다음, 매크로 선택 매크로 명령을 반복을 시작합니다. 표시되는 반복 횟수 창이 구에서 설정해야합니다.
- 명령을 선택합니다 : '다음 찾기'. 선택 명령의 데이터 패드에 추가 '. 마지막으로 매크로 명령과 종료를 반복을 선택합니다.
- 이제 매크로를 선택하고 녹음을 중지합니다. 저장하고 동물 번호 뒤에 매크로 이름을 지정합니다. 참고 : 각 동물에 대한 매크로를 설정 매크로는 길이 방향 연구에 사용 시간을 절약 할 수 있습니다.
- 매크로는 현재 각 주석의 영감 (T의 I) 및 만기 (T 전자) 시간을 얻기 위해 실행할 수 있습니다. 데이터는 datapad의 채널 1 아래에 나타납니다. 만료 및 영감 연속적으로 발생하고 데이터의 순서로 나타납니다.
- 데이터는 수동으로 영감과 만기 값으로 분할해야합니다. 평균 I T 및 T E를 얻기 위해 각 파라미터의 4 개의 데이터 값을 평균화.
- 기본 값은 호흡량 (V T, ㎖)를 도출 한 후 계산 될 수있다. Drorbaugh와 펜을 8의 식 사용되는 호흡량을 구하는 방법
V T (ML) = (P T / P K) × (V K) × ((T CORE (P의 B - P의 C)) / (T CORE (P의 B - P C) - T C (P의 B - P CORE)))
어디
V의 T : 호흡량
P K는 1 ㎖를 각각 주입에 의한 압력 편향 (2.5 단계를 참조하십시오)
T 코어 : 각 동물의 코어 온도
P C : 차의 챔버 온도, 상대 습도 X 수증기압mber
T C : 동물 실의 온도
P 코어 : 체온 기압 (체온에서 수증기압 × 1.0)
P의 t : 각 호흡량에 의한 압력 편향
V K는 보정을위한 대량 주입
P의 B : 기압 - 호흡량이 계산되면 다음과 같은 매개 변수도 확인할 수 있습니다 :
- 분 양 (㎖ / 분) = V T의 XF
- 분 양 (ml / 분 / kg) = (V T의 XF) / 체중 (kg)
- V의 T (㎖ / kg) = V T (ML) / 체중 (kg)
- 흡기 듀티 사이클 (%)을 T I / T 무비 =
- 흡기 유량 (㎖ / 초) = V T / T의 전
- 만료 시간에 영감 시간의 비율 = T I / T 전자
- 총 사이클 시간 (sEC) = 영감 시간 (초) + 만료 시간 (초)
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Representative Results
이 과정이 정확 하였다 되었으면 일관된 발진 트레이스 데이터 분석 소프트웨어에 생성된다. 절차는 간단 컴퓨팅 계산과 설치가. 나와 호흡 매개 변수를 결정 (5) 제어 (건강) 마우스에서 적절한 호흡 추적을 나타내는 그림 후 몇 분 이내에 호흡 추적을 제공합니다. 동물이 적극적으로 움직이지 않을 때 적절한 진동 데이터가 생성된다.
UWBP 제어 및 폐 섬유증 코호트 간의 폐 기능의 매우 유용하고 신뢰성 평가이다. 7 제어 그래프와 비교하여 14 일째에 블레오 마이신 유발 폐 섬유증과 마우스의 폐 기능을 보여주는 도표,도 7은 시각적 인 차이를 나타낸다 블레오 마이신 관리 (7)과 일치. 전술 한 바와 같이, 절차는 호흡기 paramete의 변화를 관찰 할 수 있도록 미국 반복 될 수있다이 두 그룹 사이의 시간에 따른 RS.
얻어진 결과는 ± SEM 수단으로 표현되어야한다. 그것은 복사 및 간단한 Excel 스프레드 시트에 수집 된 데이터를 붙여 넣기하는 것이 좋습니다. 이 단계 4.13 및 4.14에서 논의 된 계산을 수행하기위한 도움이 될 것입니다. 도 8에서 설명한 바와 같이 호흡 기능을 육안으로 두 군 사이를 비교할 수있다.
호흡주기의도 1 다른 구성 요소는 대기압 혈량 측정법.이 그래프는, b)에 의한 각각의 호흡량 (PT)에 압력 변화, c))를 인해 영감 (ΔPi에 압력)의 변화를 예시를 이용하여 도시 (인해 만료 (ΔPe), D) 전체 호흡주기 (Ttot), 예) 흡기 시간 (티타늄) 및 f)의 만료 시간에 압력을 변경 테). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2는 기압계와 물 열 설정을 시각적으로 표현. 그림은 교정 프로세스에 대한 기압계 물과 열을 설정하는 독자를 돕기 위해 설계되었습니다. 물이 통치자의 도움이 열을 내 수준 알 수 있습니다. 이 열은 플라스틱 튜브의 15cm를 통해 연결되어있다. 오른쪽 (65cm)의 튜브는 1 ㎖의 주사기 및 좌측 (75cm)의 데이터 수집 시스템에 연결된 압력 변환기에 연결된다. 참고 :. 튜브의 길이가 물 1cm를 이동하는 데 필요한 볼륨 (300 μL)을 결정 보려면 여기를 클릭하십시오큰 이미지.
그림 3 공연은 2.4 및 브리지 앰프 교정의 2.5 단계를 반복합니다. 이 그림은 장비의 교정 단계 2.7 및 2.8을 보여줍니다. 그것은 정확한 결과를 얻기 위해 브리지 앰프를 해결하는 것이 중요합니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 UWBP 설정의 전체 회로도. 왼쪽에 동물을 포함 혈량 측정법 챔버의 일측에 접속 습도 / 온도 프로브이다. 오른쪽에 교정 주사기와 압력 변환기 선두입니다컴퓨터의 호흡 추적을 생산하는 데이터 수집 시스템에 혈량 측정법 실에서. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 UWBP를 사용할 때 얻어지는 C57BL / 6 마우스로부터 제어 호흡기 호흡 파형의 예.이 호흡 추적 제어 동물로부터 적절한 데이터 일관성을 나타낸다. 아홉 연속 코멘트 단계 4.1-4.13를 따라 봉우리와 나와 호흡 매개 변수를 얻기 위해 진동 호흡의 골짜기에 추가됩니다. 시간 (cm.H 2 O) x 축은 시간 (초)과, Y 축을 따라 압력 변화를 따라 표시된다. VI에 여기더 큰 이미지를 으으.
도 UWBP 사용시 C57BL / 6 마우스에서 얻은 다른 차선의 트레이스의 예 6. 최적 인 결과는 적절한 데이터로 혼동 불량 해석을위한 가장 일반적인 원인이다 수있다. 이 그림은 분석을 위해 사용해서는 안됩니다 가장 일반적인 차선의 흔적을 보여줍니다. 이러한 호흡 흔적은 동물이 냄새와 동물의 기초 호흡 생리를 변경 이동하는 동안) 호흡 추적 기록을 보여줍니다. b)는 시간이 지남에 따라 증가 점차적으로 진동을 발생 기록 추적은 일반적으로 응축 구축 습도로 인해 발생합니다. 그러나, 추적 에탄올로 혈량 측정법 실을 닦아 또는 교정 단계를 반복하여 교정 할 수 있습니다. C) 추적을동물이나 연구자가 장비와 함께 참여하는 동안 혈량 측정법 실 이동하는 동안 기록했다. 시간은 x 축 (초)과 Y 축을 따라 압력 변화 (cm.H 2 O)을 따라 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 UWBP를 사용할 때 유발 된 폐 섬유증와 C57BL / 6 마우스에서 얻은 호흡 추적의 예.이 호흡 추적이 문서에서 설명하는 UWBP 절차를 사용할 때 얻어지는 유도 폐와 동물의 적절한, 일관된 데이터를 보여줍니다. 아홉 연속 코멘트 단계 4.1-4.13를 따라 봉우리와 나와 호흡 매개 변수를 얻기 위해 진동 호흡의 골짜기에 추가됩니다. 시간 파트 :입니다x 축 (초)과 Y 축을 따라 압력 변화에 따라이 제시 한 (cm.H 2 O). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
제어 및 블레오 마이신을 비교 그림 8 호흡 기능이 여기에 표시되는 것과 유사한 결과로 사용자를 수 UWBP 사용 후 혈량 측정법 분석을 수행. C57BL / 6 마우스에 도전했다. 이 그림은 블레오 마이신 도전 동물 (점선 회색 라인)과 대조군 (검은 색 선) 사이의 생리적 차이를 보여줍니다. 이러한 그래프는 a) 유효 시간 (초에서 비교), b) 흡기 시간 (초), c) 흡기 듀티 사이클 (%), D) 흡기 유속 (㎖ / 초)를 보여준다전자) 호흡 속도 (호흡 / 분), F) 분 량 (ml / 분 / kg), g) 호흡량 (㎖ / kg) 및 시간) 다운로드 전체 사이클 시간 (초). 폐 기능 데이터 블레오 도전 다음 0 일, 7 일에 동물의 종 방향으로 동일한 코호트에서 수집하고, 14 하였다. 대표 데이터는 머피 등에서 적응하고있다. (2012) 16. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 기술은 억제되지 않은 생쥐와 unanesthetized 호흡 파라미터의 평가를위한 비 침습적 방법이다. 이 프로토콜의 장점은 최소한의 인공물 길이 방향으로 폐 기능을 측정하는 단순하고 정밀도를 포함한다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 중요한 단계는 절차에 대해 주목해야한다이 있습니다. 먼저, 가장 중요하게, 마우스 다섯 초 동안 챔버 내에 침착한다. 마우스의 호흡 패턴을 방해하고, 따라서 변수 결과 (도 6a)을 제공 할 것입니다 추가 스트레스. 이러한 단점은 가능성 남아 항상 기대 될 것이다. 그러나 그 집 새장에 마우스를 교체하고 그것을 쉽게 해결됩니다 정착 할 시간을 허용한다. 그것은 적절한 동물 / 유용한 데이터의 5 초 수득 챔버 환경 내 편안한 느낌 것이 중요하다. 또한 대가는 실 환경에 대한 필요합니다. 환경, U호흡 기계에 nrelated 크게 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 평가 증가 챔버 증가 습도 및 온도뿐만 아니라 가능한 산소가 감소하는 기간으로 크게 환기에 영향을주지. 환기 타이밍은 온도 및 습도의 챔버뿐만 아니라 가능한 산소 21 감소를 증가시킨다. 챔버 내의 작은 누출 열 생산 22,23로부터 생성 열적 감도를 감소 시키는데 도움을 줄 수있다. 설명하는 프로토콜은 나열된 장비와 계측에 고유합니다. 섹션이에서 다리 앰프의 교정은 독자의 장비에 따라 달라집니다. 이러한 튜브의 길이 등의 요소가 다른 경우 공기의 300 ㎕를 주입 한 cm.H 2 O 변형의 원인이되지 않을 수 있습니다.
분석 시간에 따라 생리 학적 차이가있다. 설치류는 궁극적으로의 변화를 생성하는 자연 야행성 동물 및 생체주기 아르실험 24 타이밍 때 호흡이 고려되어야한다. 그것은 시간에 따라서 필요한 실험 데이터가 정확하게 코호트를 비교 될 수 있도록 실험을 계획한다. 그것은 추적 움직임에주의를 기울여야하는 것도 중요합니다. 진동 선형 패턴으로 실행하지 않는 경우, 그것은 때문에 챔버에 빌드 챔버 (도 6b) 내에서 응결이나 습도의 최대, 또는 효과 인감 보통이다. 궁극적으로, 이러한 한계는 설명 될 수 있고, 프로세스는 UWBP 호흡기 정확한 측정을 제공하도록 적절하게 수행 하였다. 이것은 본 방법은 신생아 표준 실험실 쥐 호흡 변화를 측정하기위한 수정 (작은 챔버의 크기)를 요구한다는 것을 명심 또한 중요하다 (예를 들면, <이주 C57BL / 6) 그 크기의 동물의 호흡에 압력 변화를 감지하기 위해서는 .
UWBP 상당한 장점을 보여줍니다하지만 그것은 또한 논쟁을 수행합니다.연구자들은 논쟁을 숙지하고이 기술은 연구 문제에 적합한 지 정보통 결정을해야합니다. 처음에는 펜을 Drorbaugh과 (1955) 8 챔버 압력의 증가가 가온하고 폐 값으로 가습되는 공기 영감 의한 것으로 생각; 그 반대가 만료 발생했습니다. 이 호흡량의 계산을 허용했다. 후속 연구는 압력 변화가 공기 흐름 (25)의 생성시 폐포 압력을 변화시킴으로써 발생하는 것으로 생각되었다. 이 작업은기도 저항 계산을위한 혈량 측정법의 사용을 밝혔다. Enhorning 외. (1998) (26)는 증거를 제공하는 것과 호흡량, 호흡 및기도 저항 혈량 측정법 챔버 내의 모든 영향을 미치는 압력 변동. 챔버 내의 공기를 가열하고, 몸 상태로 가습하는 경우 압력 변동은 3 분의 2로 감소 및 증가 된 저항을 통해 증폭된다 <SUP> 21. 모든 구성 요소가 압력 변동을 반영으로 특정 호흡기 매개 변수의 측정이 정확한지 여부를 논쟁이있다. 그 결과는 혈량 측정법에 의한 호흡량이 정량적 평가 26보다는 질적 인 결론을 내렸다되었습니다. 모두 상부 및 하부기도 저항은 기관지 수축 (27)을 측정 불확실성을 만드는 혈량 측정법 시스템의 구성 요소입니다. 그것은 UWBP 침략 분석과 상호 사용해야 저자의 의견이다. 이 사실 만 UWBP 데이터를 기반으로 원고 특정 저널의 정책은 허용되지 않습니다됩니다. 이것은 독자들에게 또 다른 고려 사항이 될 것입니다.
요약하면, UWBP는 종 방향 연구에 특히 의무 표준 실험실 설치류, 호흡기 매개 변수에 대한 변경을 측정하는 유용한 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 침략적인 절차의 회피 아르, 화학도전과 마취의 요구 사항. 이 연구진은 가장 밀접하게 자연적으로 발생하는 이벤트를 표현하고 실험 변동성을 줄이기 생리 학적 데이터를 수집 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
