Summary
Die Beurteilung der Atemphysiologie hat traditionell auf Techniken, die Zurückhaltung oder Sedierung des Tieres erfordern verlassen. Hemmungslose Ganzkörper-Plethysmographie, jedoch bietet eine präzise, nicht-invasive, quantitative Analyse der Atemphysiologie in Tiermodellen. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren wiederholt Atem Bewertung der Mäuse so dass für Langzeitstudien.
Abstract
Atemfunktionsstörung ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität in der Welt und die Sterberate weiter steigen. Quantitative Beurteilung der Lungenfunktion in Nagetiermodellen ist ein wichtiges Instrument in der Entwicklung künftiger Therapien. Häufig für die Beurteilung der Atemfunktion einschließlich invasiver Plethysmographie und erzwungenen Schwingung verwendeten Techniken. Während diese Techniken wertvolle Informationen, die Datenerfassung birgt Artefakte und experimentelle Variabilität aufgrund der Notwendigkeit für die Anästhesie und / oder invasiven Instrumenten des Tieres. Im Gegensatz dazu ungebremst Ganzkörper-Plethysmographie (UWBP) bietet eine präzise, nicht-invasive, quantitative Weg, auf dem die Atmungsparameter zu analysieren. Diese Technik vermeidet die Verwendung von Anästhesie und Beschränkungen, die den traditionellen Plethysmographie Techniken gemeinsam ist. Dieses Video wird die UWBP Verfahren einschließlich der Geräte einzurichten, die Kalibrierung und die Lungenfunktion Aufnahme zu demonstrieren. Eswird erklärt, wie die gesammelten Daten zu analysieren, zu identifizieren sowie experimentelle Ausreißer und Artefakte, die von Tierbewegungen zur Folge hat. Die mit dieser Technik erhalten Atmungsparameter umfassen Atemvolumen, Minutenvolumen, Inspirations Einschaltdauer, Einatemströmungsgeschwindigkeit und das Verhältnis von Inspiration Zeit, um Ablaufzeit. UWBP nicht auf spezielle Fähigkeiten verlassen und ist kostengünstig durchzuführen. Ein Schlüsselmerkmal der UWBP und attraktiv für potentielle Nutzer, ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen der Lungenfunktion am gleichen Tier durchzuführen.
Introduction
Lungenfunktionsstörung ist eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität auf der Welt. Die Bedingung ist durch eine unzureichende Sauerstoffaustausch, auch mit Husten, Brustschmerzen und Atemnot gekennzeichnet. Erkrankung der Atemwege entfallen ca. 10% der Mortalität weltweit 1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation werden Mortalitätsraten mit steigender Tendenz aufgrund anhaltender Rauchen, Umweltverschmutzung und Berufsreizstoffe. UWBP ist eine sinnvolle Ergänzung für das Studium der Physiologie der Lunge, die stark Komplimente traditionellen biochemischen und histologischen Analysen 2. Andere Verfahren zur Lungenbewertung verwendet werden, nicht die gleichen Vorteile bieten wie UWBP. Invasive Plethysmographie ist eine häufig verwendete Technik, die das Tier anästhesiert 3,4 und somit sind resultierende Atmungsmessungen nicht reflektierenden eines natürlichen Zustand erfordert. Ferner wird die Anforderung für die mechanische Beatmung und chemischen Herausforderungen entgegen zukünftige Messungen 3,4.Ein anderes Verfahren zum Sammeln von Atemdaten durch erzwungene Schwingung, die empfindlicher auf Änderungen der Atmungsparameter feineren Vergleich zu UWBP 5 ist. Erzwungene Schwingung ist jedoch eine invasive Technik und erfordert Tier Beendigung der Datenerfassung 5-7.
UWBP geht darum, ein Tier in einer spezialisierten Kammer. Während der Inspiration wird die Luft erwärmt und Gezeiten in der Lunge zunehmenden Wasserdampfdruck befeuchtet und thermische Ausdehnung der Gas 8 verursacht. Dieser Effekt führt zu einer Nettoänderung der Luftvolumen Schaffung einer Druckerhöhung innerhalb des Plethysmographen Kammer 8. Das Gegenteil tritt während der Exspiration die Schaffung einer Atemwellenform von dem Tier. Wellenformanalyse wird dann verwendet, um aus den Atem Spur zu messen: Atemfrequenz (Atemzüge / min), Gesamtatemzykluszeit (sec), Inspiration / Ablaufzeit (Ti / Te, sec) und Veränderungen in der Druck aufgrund jedem Atemvolumen (P T). UWBP eine präzise, nicht-invasive, quantitative Analyse von Atemphysiologie in Tiermodellen und kann zur Messung des Fortschreitens der Erkrankung der Atemwege und die Lungenfunktion 6,9 verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Techniken Plethysmographie, vermeidet UWBP die Anwendung von Betäubungsmitteln, Beschränkungen und invasive Manipulationen, die Artefakte und experimentelle Variabilität 6,9 herzustellen. Anästhesie Atmung zu unterdrücken,verändern Herzfrequenz und kann eine Herausforderung bis 10 regulieren. Stützen induzieren eine Erhöhung der Atmung durch zusätzliche Stress durch Corticosteron und Adrenalin frei 11,13. Das Hauptmerkmal der UWBP wiederholt physiologischen Beurteilung was sie für eine Längsschnittstudien. UWBP wird dringend für die Längs Beurteilung der Lungenphysiologie empfohlen und bietet eine wertvolle Fähigkeit für zukünftige Atemarzneimittelbewertung. Bleomycin, Ovalbumin, und Hypoxie wurden verwendet, um Atem Herausforderungen in mehreren Studien induzieren und UWBP erfolgreich genaue physiologische Lungenbewertung 7,9,13-16 gemessen. Das beschriebene Protokoll ist für erwachsene Standardlabormäusen konzipiert. Allerdings hat UWBP auf andere Tiere wie Ratten, Meerschweinchen und Primaten 17-20 angepasst. UWBP ist nicht nur auf die Beurteilung Lungenfehlfunktion beschränkt, sondern auch für die Beurteilung der Lungenreifung 3 verwendet.Die Vielseitigkeit, Einfachheit und Reproduzierbarkeit der UWBP haben eine ausgezeichnete Technik zur Bewertung der Lungenfunktion bei Tieren festgestellt. Verschiedene Software (siehe Materialien und Geräte-Tabelle) wird benötigt um dieses Verfahren zu folgen. Ein erfahrener Wissenschaftler in der Lage wäre, dieses Protokoll mit einer Maus innerhalb 1 Stunde durchzuführen.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Versuchsverfahren wird von der Tierethikkommission an der Monash University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken (2006) durchgeführt. Erwachsene weibliche C57BL / 6 Mäuse verwendet, um die repräsentative Ergebnisse zu generieren wurden aus den Monash Tierdienstleistungen erhalten. Die Mäuse wurden in einen bestimmten Erreger frei, kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit Zimmer mit einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus gehalten. Diese Mäuse hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
1. Initial Setup
- Schließen Sie den Laptop / Desktop bis zum Datenerfassungsmaschine für die Aufnahme über ein USB-Kabel.
- Schließen Sie den Brückenverstärker von "Ausgang 1" bis "Eingang 1" des Datenerfassungsmaschine über eine BNC-Kabel.
- Legen Sie die Druckwandler in "Kanal 1" des Oktal-Brücke Amp. Schalten Sie die Datenerfassung Maschine auf und öffnen Sie die Analyse-Software. Die Software sollte automatischdie Geräte-Setup automatisch erkennen (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle).
- Offener Kanal Einstellungen im Setup-Tool-Bar der Software gefunden. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 aufgezeichnet.
- Richten Sie das Barometer auf Raumdruck und die Wassersäule Gerät, um den Brückenverstärker kalibrieren zu messen. Die Wassersäule Vorrichtung zwei 5 ml-Spritze serologische Pipetten durch einen Kunststoffschlauch verbunden ist.
- Füllen Sie die Spalten mit Wasser und sorgen für die Wasserstände mit einem Lineal ausgeglichen sind. Schließen Sie ein Stück Kunststoffschlauch an die Spitze der jeweiligen Pipette. Abbildung 2 zeigt die Wassersäule aufzubauen.
2. Brückenverstärker Kalibrierung
Hinweis: Um in die Wassersäule Kalibrieren Sie den Brückenverstärker eine Injektion von Luft erforderlich ist, um eine 1 cm H 2 O Ablenkung zu schaffen. Dies wird unter einem Satz von Bedingungen erfolgen und ist abhängig von Vorrichtung des Benutzers. Zur Klarstellung diese Schritte demonstrate wie dieses Labor würde die Kalibrierung durchzuführen.
- Zurückzuziehen 1-ml-Spritze auf 300 ul; ist, die Spritze an den Absperrhahn am Ende der Rohrleitung auf der rechten Seite der Wassersäule. HINWEIS: Sicherstellen, dass der Hahn geöffnet ist an der Spritze und der Wassersäule, und geschlossen, um die Raumluft. Wenn die Wasserstände sind an dieser Stelle nicht ausgeglichen ist, drehen Sie den Hahn, so dass sie offen für Raumluft und der Wassersäule ist, wird dieser das Wasser wieder auszugleichen. Der Schlauch auf der linken Seite der Wassersäule sollte mit dem Druckwandler verbunden ist, um die Druckänderung durch Eintauchen der Spritze induziert wurden.
- Befestigen Sie den Schlauch von der Wassersäule auf der linken Seite, um den Anschluss auf der Druckwandler (obere Ring des Wandlers).
- Wählen Sie das Scroll-Down-Menü gefunden neben dem Hauptbildschirm auf Kanal 1 auf der rechten Seite der Software, und wählen Sie "Brücke Amp" (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle).
- Eingebendie Einstellungen zu 5 mV, 20 Hz Tiefpass, kreuzen Sie das "Invert" und klicken Sie auf "Null". Klicken Sie auf "Null" um die Kurve bei ~ 0 mV eingestellt. Reduzieren Sie die Fenstergröße auf 4: 1 für einfache Betrachtung.
- Mit allem, was einzurichten, drücken Sie die 1-ml-Spritze, so dass es für 3 Sekunden. Dies wird eine plötzliche Spitze auf der Software zeigen, weil der Druck geändert hat. Wenn die 300 ul gedrückt wird, wird der Druck des Wassers in der Wassersäule von 1 cm zu bewegen. Diese bekannte Wert wird dazu beitragen, kalibrieren Sie den Brückenverstärker.
HINWEIS: Der Druckanstieg in der Kammer auf Grund der Vertiefung 300 ul entspricht der für spätere Berechnungen verwendet P K-Wert. - Wählen Sie "Eingabeeinheiten" auf der linken unteren Ecke des BRIDGE AMP Fenster gefunden.
- Markieren Sie die "Hintergrund Spur" vor der Spitze anders als die "Null-Region" bekannt.
- Klicken Sie auf den Pfeil neben "Punkt 1" und dies wird die bac produzierenkground Signal im Bereich von -0,002 mV-0.002 mV (der Wert wird nie genau bei 0 mV).
- Typ "0" in dem Fenster benachbart zum Hintergrundsignal-Fenster.
- Markieren Sie das "erhöhte Druckbereich der Kurve" aus, wenn die Spritze gedrückt. Klicken Sie auf den Pfeil neben der Nummer 2 und der Wert sollte in Bereich von 0,9-1,2 mV sein.
- Typ "1" in das Fenster neben dem Fenster "erhöhten Druck". Für eine visuelle Klärung Schritte 2.7 und 2.8 beziehen sich auf 3. Werte außerhalb der angegebenen kann zu Schäden an der Brücke Oktal Amp zeigen Bereiche gefunden Figur.
- Gehen Sie zu 'definieren Einheiten "in der oberen rechten Ecke des Fensters und wählen Sie" cm H 2 O ". Wenn diese Option nicht zur Verfügung steht, kann es manuell eingegeben werden. Klicken Sie auf OK.
- Zurück zu den "Brücke Amp"-Menü (siehe 2.1). Wählen Sie 1 mV und setzen Verstärker auf "Null";. Dies wird Kalibrierung abzuschließen und die Wassersäule sicher entfernt werden kann.
3. Aufnahme Lungenfunktion
- Wiegen Sie die Maus (g). HINWEIS: Eine Woche vor der physiologischen Beurteilung vorstellen die Maus an die Plethysmographie Kammerumgebung. Dies wird in Akklimatisierung zu unterstützen und reduzieren Stress, wenn dieses Verfahren zu einem späteren Zeitpunkt. Für eine schematische Gesamt Nachweis der UWBP Setup, siehe Bild 4.
- Messung der Körpertemperatur mit einer rektalen Thermometers. Schmieren Sie das Thermometer mit Vaseline vor dem Einsetzen. Notieren Sie sich die Temperaturanzeige und reinigen das Schmiermittel mit 80% (v / v) Ethanol. Bei Verwendung sehr kleiner Tiere wie neonatale Maus Jungtieren kann die mittlere Körpertemperaturwert mit einem Infrarot-Thermometer anstelle bestimmt werden.
- Legen Sie die Temperatur / Feuchtefühler auf der Ein-Loch-Ende der Plethysmographie Kammer. Notieren Sie die Temperatur, Luftfeuchtigkeit und barometric Druck in der Kammer Plethysmographie vor dem Platzieren der Maus innerhalb.
- Platzieren Sie die Maus in die Plethysmographie Kammer, decken das offene Ende leicht. Dies ermöglicht die Maus um sich zu akklimatisieren. Schließen Sie die Kammer.
- Mit der Temperatur / Feuchtefühler in der Seite der Plethysmographie Kammer mit einem Loch eingeführt, jetzt legen Sie die Wandler und die Spritze in der anderen Seite mit den beiden Löchern.
- Drücken Sie 'Start' auf dem Software-Programm und Rekord für ca. 15-45 Sekunden. Rekord 5-10 sec von Daten, wo das Tier bewegt sich nicht. Bewegung basalen Atemphysiologie der Tiere verändern und schlechte Ergebnisse. Atmungs sollte auf einem linearen Weg auf der Programm oszillieren. Dies sind verwendbare Daten. Hinweis: Wasserlassen oder Stuhlgang kann zu einer Erhöhung der Temperatur und Luftfeuchtigkeit innerhalb der Kammer Plethysmographie führen. Dies wird bei der Analyse Ergebnisse zu verschleiern. Im Falle eines Wasserlassen oder Stuhlgang, stoppen Sie die Aufnahme sofort und reinigen plethysmography Kammer mit 80% (v / v) Ethanol. Siehe für eine visuelle Darstellung der suboptimalen Ergebnissen, wo sollten die Daten abgelehnt Abbildung 6.
- Nach der Aufnahme der 45 Sekunden, drücken Sie "Stop" auf der Software (siehe Tabelle Materialien und Ausrüstung)-Programm. Entfernen Sie die Maus vom Plethysmographie Kammer und sofort die Kammertemperatur und Luftfeuchtigkeit aufzeichnen. Nicht kontinuierlich Rekord für mehr als 45 Sekunden, da dies die Tier betonen.
- Bringen Sie die Maus, um seinem Käfig, Spray und wischen die Kammer mit 80% (v / v) Ethanol.
- Ermöglichen die Kammer zu trocknen und wieder den Ausgangswert der Temperatur und Feuchtigkeit, bevor auf die nächste Maus. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,9 für nachfolgende Tiere. Hinweis: Wenn mehrere Tiere untersucht, dass die Kammertemperatur und die Feuchtigkeit in der Nähe Rückkehr zu Basislinienwerten vor jedem neuen Tier in die Kammer eingebracht.
4. Plethysmographie Analyse
Nichtte: die Atmungsparameter wie Atemvolumen (V T) und Minutenvolumen die folgenden Variablen gemessen werden müssen berechnen: Atemfrequenz (Atemzüge / min), Gesamtatemzykluszeit (sec), Inspiration / Ablaufzeit (Ti / Te, Sekunden) und Druckänderung aufgrund jeder Atemzugvolumen (P T). 1 veranschaulicht die Variablen, die von einer Spur gemessen werden kann. Die folgenden Schritte verwenden eine Software (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle), diese Variablen zu messen. Bei der Analyse, zu vermeiden Regionen der Spur enthalten, Sniffing oder Bewegung. Für reproduzierbare Ergebnisse wird mindestens 5 Sekunden guter Atmungs Spur erforderlich. Ein Beispiel für verschiedene Atem Spuren beziehen sich auf die 5 und 6.
- Öffnen Sie den Bildschirm auf Vollbild stellen im Hinblick auf die 1: 1, und wählen Sie 5 Sekunden von nutzbaren Daten. Eine repräsentative Schnappschuss davon ist in 5 gezeigt.
- Öffnen Sie den Mini-Daten Pad Fenster an der Spitze der Pro gefundenGramm in der Registerkarte Datapad. Wählen Sie Kanal 1 und wählen Sie "Zyklus-Messungen" in der linken Spalte und "durchschnittliche zyklische Höhe" in der rechten Spalte.
- Wählen Sie "Option" und setzen den Maßstab für Mindestspitzenerfassung bis 1 (ms). Dies wird Nachweis von jedem Spitzenwert zu ermöglichen und wird extrem wichtig, wenn kleine Tiere, die kleinen Schwingungen zu erzeugen.
- Klicken Sie auf 'OK'. Dies wird "wegen jedem Atemvolumen Druckbiegung" (P T)-Messung zu präsentieren.
- In der Mini-Datenlage, wählen Sie 'Zyklus Messungen', gefolgt von 'Ereigniszählung "und klicken Sie auf' OK '. Dies wird die "Frequenz" (f) Messung zu präsentieren.
- Frequenz muss an Atemzügen / min umgerechnet werden. Dies wird durch Multiplizieren des Wertes von 60 Sekunden und Teilen der Antwort der Gesamtzeit der Aufnahme (min) durchgeführt.
- In der Mini-Datenlage, wählen Sie 'cycle-Messungen ", gefolgt von" Zeit "und klicken Sie auf 'OK'. Dies wird die "Gesamtatemzykluszeit" (T tot, sec) Messung zu präsentieren.
- Die nächsten Schritte werden verwendet, um einen Makrobefehl zu erstellen, um Spitzen und Ausatmung Zeitwerte zu generieren. Sicherstellen, dass der Cursor direkt über dem Maximum des Peaks / Trog und fügen Sie einen Kommentar am 9. sequentielle Höhen und Tiefen. Beginnen Sie mit der Spitze des Schwingungs wie in Figur 5 gezeigt.
- Anschließend wählen Sie Fenster: Daten-Pad und Spalte 1. In dem Fenster, das auf "Auswahl-Informationen" in der linken Spalte, "Dauer" in der rechten Spalte und klicken Sie auf 'OK' erscheint.
- Wählen Sie Makro an der Spitze des Programms gefunden und starten Sie dann die Aufnahme. Wählen Sie nun Befehle: 'Suchen', 'Go', 'Start der Datei' und klicken Sie auf 'Suchen'.
- Wählen Sie Befehle: 'Suchen' und 'Suchen Kommentare'. Geben Sie den gleichen Satz für den Kommentar-Box in der 'enthält' vorgesehene Feld eingegeben haben. Wählen Sie die "Zurück zum Punkt wählen" Tab und 'Suchen'.
- Wählen Sie Befehle: "Daten-Pad hinzufügen '. Als nächstes wählen Sie Makro: Makro-Befehle und beginnen zu wiederholen. Die Wiederholungszahl angezeigten Fenster sollten auf 9 eingestellt werden.
- Wählen Sie den Befehl: "Weitersuchen". Wählen Sie den Befehl: "Daten-Pad hinzufügen '. Wählen Sie Makro-Befehle und Ende wiederholen schließlich.
- Wählen Sie nun das Makro und beenden Sie die Aufnahme. Speichern und benennen Sie das Makro nach dem Tiernummer. HINWEIS: Einrichten des Makros für jedes Tier kann das Makro für Längsschnittstudien verwendet werden und spart Zeit.
- Das Makro kann jetzt ausgeführt werden, um die Inspiration (T i) und Verfall (T e) Zeit zwischen den einzelnen Kommentar zu erhalten. Die Daten werden unter Kanal 1 der Datapad erscheinen. Ablauf und Inspiration erfolgt fortlaufend und die Daten werden in dieser Reihenfolge angezeigt.
- Die Daten müssen manuell in Einatmung und Ausatmung Werte aufgeteilt werden. Der Mittelwert der vier Datenwerte für jeden Parameter, den Mittelwert T i und T e zu erhalten.
- Wenn die Primärwerte wurden mit dem Atemvolumen (V T, ML) abgeleitet wird, berechnet werden. Um das Atemvolumen die Gleichung der Drorbaugh und Fenn 8 verwendet zu erhalten:
V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - C P) - T C (P B - P CORE)))
Wo
V T: Tidalvolumen
P k: Druckablenkung durch jede Injektion von 1 ml (siehe Schritt 2.5)
T Kern: Kerntemperatur von jedem Tier
P C: Wasserdampfdruck bei Raumtemperatur X Relative Luftfeuchtigkeit in chamber
T C: Temperatur in der Tierkammer
P Kern: Druck bei Körpertemperatur (Wasserdampfdruck bei Körpertemperatur x 1,0)
P t: Druck Ablenkung durch jedes Atemvolumen
V k: Volume Injektion für die Kalibrierung
P B: Luftdruck - Sobald die Atemvolumen wurde so berechnet, die folgenden Parameter bestimmt werden:
- Minutenvolumen (ml / min) = V T XF
- Minutenvolumen (ml / min / kg) = (V T XF) / Körpergewicht (kg)
- V T (ml / kg) = V T (ml) / Körpergewicht (kg)
- Inspirations Kapazität (%) = T i / T tot
- Inspirationsflussrate (ml / s) = V T / T i
- Verhältnis von Inspirationszeit zu Ablaufzeit = T i / T e
- Gesamtzykluszeit (sec) = Inspirationszeit (sec) + Ablaufzeit (sec)
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Representative Results
Wenn dieses Verfahren korrekt ausgeführt wurde, wird eine einheitliche Schwing Spur auf der Datenanalyse-Software erstellt. Das Verfahren bietet eine Atem Spur innerhalb von wenigen Minuten nach dem Setup mit einfachen Rechen Berechnungen aufgeführt Atemparameter zu bestimmen. Abbildung 5 ein geeigneter Atem Spur von einem Steuer (gesunden) Maus. Entsprechende oszillierende Daten erzeugt wird, wenn das Tier nicht aktiv bewegen.
UWBP ist eine äußerst nützliche und zuverlässige Beurteilung der Lungenfunktion zwischen Kontrolle und Lungenfibrose Kohorte. Abbildung 7 zeigt die Lungenfunktion von einer Maus, die mit Bleomycin-induzierten Lungenfibrose an Tag 14 im Vergleich zu dem Kontrollgraphen, Figur 7 zeigt eine optische Unterschied Einklang mit Bleomycin Verwaltung 7. Wie zuvor diskutiert, kann die Prozedur wiederholt werden, so dass wir Veränderungen in der Atem paramete beachtenrs über die Zeit zwischen den beiden Gruppen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwerte ± SEM. Es wird empfohlen, zu kopieren und die in einer einfachen Excel-Tabelle gesammelten Daten einfügen. Dies wird, die zur Durchführung von Berechnungen in den Schritten 4.13 und 4.14 behandelt. Atmungsfunktion visuell zwischen beiden Gruppen verglichen werden, wie in 8 gezeigt.
Abbildung 1. Verschiedene Komponenten des Atemzyklus mit der barometrischen Plethysmographie. Dieser Graph zeigt a) die Druckänderung durch Inspiration (Delta; Pi), b) die Druckänderung aufgrund jeder Atemvolumen (PT), c) die dargestellte Druckänderung aufgrund des Ablaufs (Delta; PE), d) Gesamtatemzykluszeit (T tot), e) Inspirationszeit (Ti) und f) Ablaufzeit (Te). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 2. Visuelle Darstellung des Barometers und der Wassersäule Setup. Die Figur ist so konzipiert, um den Leser bei der Einrichtung des Barometers und der Wassersäule für den Kalibrierungsprozess zu unterstützen. Beachten Sie, das Wasser ist Ebene innerhalb der beiden Spalten vom Herrscher unterstützt. Die beiden Säulen sind über 15 cm Kunststoffschlauch verbunden ist. Die Rohrleitung auf der rechten Seite (65 cm) mit einer 1 ml Spritze und nach links (75 cm) des Druckwandlers an die Datenerfassungsmaschine verbunden verbunden. . Hinweis: Die Rohrlänge bestimmt die erforderlich ist, um 1 cm Wasser bewegen Volumen (300 ul) Klicken Sie hier zur Ansichtgrößeres Bild.
Abbildung 3. Durchführen der Schritte 2.4 und 2.5 der Brücke Amp Kalibrierung. Diese Zahl zeigt die Schritte 2.7 und 2.8 für die Kalibrierung der Geräte. Es ist entscheidend, um die Brücke Amp korrigieren, um präzise Ergebnisse zu erhalten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Eine schematische Gesamt der UWBP-Setup. Auf der linken Seite ist die Feuchte / Temperaturfühler an der einen Seite der Kammer, die Plethysmographie das Tier verbunden sind. Auf der rechten Seite ist die Kalibrierung Spritze und Druckwandler führendevon der Plethysmographie Kammer an das Datenerfassungssystem Herstellung einer Atemspur auf dem Computer. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Figur 5 ein Beispiel eines Atematem Spur von einer C57BL / 6 Maus Steuerung bei Verwendung UWBP erhalten. Diese Atem Spur zeigt, konsistente Daten aus einem Kontrolltier. Neun aufeinander folgenden Kommentare werden an den Spitzen und Tälern der Atemschwingungen um die aufgeführt respiratorischen Parameter zu erhalten, indem folgende Schritte 4,1-4,13 zugegeben. Die Zeit entlang der x-Achse (s) und Druckänderungen entlang der y-Achse (cm.H 2 O). Hier klicken, um view größeres Bild.
Abbildung 6. Beispiele für verschiedene suboptimale Spuren von einer C57BL / 6 Maus bei der Verwendung UWBP erhalten. Suboptimale Ergebnisse können gegebenenfalls Daten verwechselt werden und ist die häufigste Ursache für schlechte Analyse. Diese Abbildung zeigt die häufigsten suboptimal Spuren, die nie für die Analyse verwendet werden soll. Diese Atem Spuren zeigen, a) Ein Atem Spur aufgezeichnet, während das Tier schnüffelt und Bewegen zu verändern basalen Atemphysiologie des Tieres. B) Eine Spur aufgezeichnet resultierenden Schwingungen schrittweise Erhöhung im Laufe der Zeit ist in der Regel durch Kondensation und Feuchtigkeit aufzubauen verursacht. Jedoch kann die Spur durch Abwischen der Plethysmographie Kammer mit Ethanol oder durch Wiederholen der Schritte der Kalibrierung korrigiert werden. C) Eine Spurenwährend Plethysmographie Kammer Bewegung aufgezeichnet, während das Tier oder die Forscher mit dem Gerät eingreift. Zeit ist entlang der x-Achse (s) und Druckänderungen entlang der y-Achse (cm.H 2 O) vertreten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Figur 7 ein Beispiel eines Atem Spur von einer C57BL / 6 Maus mit induzierter Lungenfibrose bei Verwendung UWBP erhalten. Diese Atem Spur zeigt, konsistente Daten von einem Tier mit induzierter Lungen bei Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen UWBP Verfahren erhalten. Neun aufeinander folgenden Kommentare werden an den Spitzen und Tälern der Atemschwingungen um die aufgeführt respiratorischen Parameter zu erhalten, indem folgende Schritte 4,1-4,13 zugegeben. Es ist Reprevorgestellt entlang der x-Achse (s) und Druckänderungen entlang der y-Achse (cm.H 2 O). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 8. Atemfunktion verglichen zwischen Kontrolle und Bleomycin gefordert C57BL / 6 Mäusen. Führen Plethysmographie Analyse nach der Verwendung UWBP den Benutzer, um Ergebnisse ähnlich dem, was hier dargestellt ermöglichen. Diese Zahl zeigt die physiologischen Unterschiede zwischen Tier Bleomycin in Frage gestellt (gestrichelte graue Linie) und Kontrolltieren (schwarze Linie). Diese Grafiken zeigen die Vergleiche in a) Verfallszeit (s), b) Inspirationszeit (sec), c) Inspiration Arbeitszyklus (%), d) Inspirationsflussrate (ml / sec)e) Atemfrequenz (Atemzüge / min), f) Minute (ml / min / kg), g) Atemvolumen (ml / kg) und h) Gesamtzykluszeit (sec). Lungenfunktionsdaten wurden in Längsrichtung in der gleichen Gruppe von Tieren an den Tagen 0, 7 folgende Bleomycin Herausforderung gesammelt und 14. Repräsentative Daten aus Murphy et al angepasst. (2012) 16. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Die hier beschriebene Technik ist eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung der respiratorischen Parameter der ungehemmten und nicht narkotisierten Mäusen. Die Stärken dieses Protokoll sind seine Einfachheit und Präzision, um die Lungenfunktion in Längsrichtung mit minimalen Artefakten zu messen. Es gibt jedoch einige Einschränkungen und kritische Schritte zu dem Verfahren angemerkt werden. Erstens und am wichtigsten, muss die Maus ruhig in der Kammer für mindestens fünf Sekunden lang. Mehrspannungs das Atemmuster des Maus stören und liefern daher unterschiedliche Ergebnisse (Figur 6a). Dieser Nachteil wird wahrscheinlich bleiben und zu Zeiten erwartet werden. Allerdings ersetzt die Maus in ihrem Heimat-Käfig und ermöglicht es Zeit, umzusiedeln wird dies leicht korrigieren. Entscheidend ist, dass das Tier wohl fühlt in der Kammerumgebung zu fünf Sekunden geeigneten / verwendbare Daten zu erhalten. Weitere Betrachtung wird über die Kammerumgebung erforderlich. Die Umwelt, uAtemmechanik nrelated, kann erhebliche Auswirkungen auf Ergebnisse. Da die Dauer der Prüfung zu, die Feuchtigkeit und die Temperatur der Kammer ansteigt, sowie eine Abnahme verfügbarer Sauerstoff, deutlich zu beeinträchtigen auf Belüftung. Die Zeitsteuerung der Lüftungs erhöht die Feuchtigkeit und Temperatur der Kammer sowie eine Abnahme verfügbarer Sauerstoff 21. Ein kleines Leck in der Kammer bei der Verringerung der Temperaturdrift von Wärmeerzeugung 22,23 erstellt unterstützen. Die diskutierten Protokoll ist spezifisch für die Geräte und Instrumente aufgeführt. Kalibrierung des Brückenverstärkers in Abschnitt zwei wird von der Ausrüstung des Lesers abhängen. Wenn Faktoren wie der Schlauchlänge unterschiedlich sind ein 300 ul Injektion von Luft kann nicht zu einem 1 cm.H 2 O Ablenkung.
Es gibt auch physiologische Unterschiede in Abhängigkeit von der Zeit der Analyse. Nagetiere sind nachtaktive Tiere und natürlich Tagesrhythmus, welche Änderungen in letztlich erzeugenAtmung, sollte bei der Zeit die Experimente 24 genommen werden. Es ist daher notwendig, um Zeit und Planung der Versuche, dass experimentelle Daten genau zwischen den Gruppen verglichen. Es ist auch wichtig, zur Kenntnis zu nehmen Spuren Bewegung. Wenn die Schwingungen in einem linearen Muster ausgeführt wird, ist es in der Regel aufgrund einer Ansammlung von Kondensation oder Feuchtigkeit in die Kammer (6b), oder unwirksamen Abdichtung auf der Kammer. Letztlich kann diese Einschränkungen berücksichtigt werden und die UWBP Verfahren entsprechend durchgeführt, um eine präzise Messung der Atemwege bieten. Es ist auch wichtig zu beachten, dass diese Methode Modifikation (kleinere Presskammer) zum Messen der Atem Änderungen in neonatalen Mäusen Standard erfordern (beispielsweise <2 Wochen C57BL / 6), um Druckänderungen in der Atmung der Tiere dieser Größe zu erfassen .
Obwohl UWBP zeigt erhebliche Vorteile es führt auch Kontroversen.Die Ermittler sollten sich mit der Debatte vertraut zu machen und eine fundierte Entscheidung, ob diese Technik für die Fragestellung geeignet ist. Zunächst Drorbaugh und Fenn (1955) 8 angenommen, dass eine Erhöhung der Kammerdruck wird durch atmeten Luft verursacht wird, erwärmt und befeuchtet, um pulmonale Werte; das Gegenteil eingetreten in Verfall. Dies erlaubt die Berechnung des Atemvolumens. Spätere Forschung gangen, dass die Druckänderungen durch Ändern Alveolardruck während der Erzeugung der Luftströmung 25 bewirkt. Diese Arbeit erklärt die Verwendung von Plethysmographie für Atemwegswiderstand Berechnung. Enhorning et al. (1998) 26 Anzeichen dafür, dass Atemvolumen, Atemfrequenz und Atemwiderstand alle Einflussdruckschwankungen innerhalb der Plethysmographie Kammer. Wenn die Luft in der Kammer erwärmt wird, und das Körper Bedingungen befeuchtet Druckschwankungen werden durch zwei Drittel reduziert und durch erhöhte Widerstände verstärkt <sup> 21. Da alle diese Komponenten spiegeln Druckschwankungen gibt es Streit, ob Messungen eines bestimmten respiratorischen Parameter korrekt sind. Als Ergebnis ist es wurde festgestellt, dass Tidalvolumen von Plethysmographie erhalten wird, eine eher qualitative als quantitative Bewertung 26. Die beiden oberen und unteren Atemwegswiderstände sind Bestandteile der Plethysmographie System schafft Unsicherheit bei der Messung Bronchokonstriktion 27. Es ist die Meinung des Autors, die UWBP sollten wechselseitig mit invasiven Analysen verwendet werden. Es ist in der Tat die Politik bestimmte Zeitschriften, die ausschließlich auf UWBP Daten basieren Manuskripte werden nicht akzeptiert. Dadurch wird eine weitere Überlegung für den Leser.
Zusammenfassend ist UWBP eine nützliche Methode, um Änderungen an respiratorischen Parameter in Standardlabortieren, besonders geeignet zur Langzeitstudien zu messen. Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Vermeidung von invasiven Verfahren, chemischeHerausforderungen und Anforderungen der Anästhesie. Dies ermöglicht es den Forschern, physiologische Daten, die natürlich vorkommende Ereignisse am ehesten zu vertreten und zu reduzieren experimentellen Variabilität zu sammeln.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
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