Summary
Solunum fizyolojisinin değerlendirilmesi geleneksel hayvanın kısıtlama veya sedasyon gerektiren teknikleri, dayandığı etti. Yarı tüm vücut pletismografi Ancak, hayvan modellerinde solunum fizyolojisi hassas, non-invaziv, kantitatif analiz sağlar. Ayrıca, tekniği uzunlamasına çalışmalar için izin farelerde solunum değerlendirmesini tekrarlanan sağlar.
Abstract
Solunum fonksiyon bozukluğu dünyanın önde gelen morbidite ve mortalite nedenleri ve mortalite oranları yükselmeye devam biridir. Kemirgen modellerinde akciğer fonksiyonunun kantitatif değerlendirilmesi gelecekteki tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir araçtır. Yaygın invaziv pletismografisi ve zorla salınım dahil solunum fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan teknikler. Bu teknikler değerli bilgiler sağlarken, veri toplama nedeniyle anestezi ve / veya hayvanın invaziv enstrümantasyon için ihtiyacı eserler ve deneysel değişkenliği ile dolu olabilir. Buna karşılık, pervasız tüm vücut pletismografi (UWBP) solunum parametreleri analiz etmek ile kesin, non-invaziv, kantitatif bir yol sunar. Bu teknik, geleneksel teknikleri pletismografi yaygındır anestezi ve bağların kullanılmasını önler. Bu video donanımları kurmak, kalibrasyon ve akciğer fonksiyon kayıt dahil UWBP prosedürü gösterecektir. BuToplanan verileri analiz, aynı zamanda hayvan hareketten kaynaklanan deneysel aykırı ve eserleri tanımlamak için nasıl açıklayacağız. Bu tekniği kullanılarak elde solunumsal parametreler gelgit hacmi, dakika hacmi, inspiratuar görev döngüsü, inspiratuar akış hızı ve son kullanma zaman ilham zamanın oranı bulunmaktadır. UWBP özel becerileri güvenmek ve gerçekleştirmek için ucuz değildir. Potansiyel kullanıcılar için en çekici bir anahtar UWBP özelliği ise, aynı hayvan üzerinde akciğer fonksiyonunun tekrarlanan ölçümler gerçekleştirmek için yeteneğidir.
Introduction
Akciğer fonksiyon bozukluğu dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. Durum öksürme, göğüs ağrıları ve nefes darlığı ile eşanlamlı yetersiz oksijen alışverişi ile karakterizedir. Ölüm, dünya çapında 1 ~% 10 solunum yolu hastalığı hesaplar. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, ölüm oranları kalıcı sigara, çevre kirliliği ve mesleki irritanlara nedeniyle artmaya ayarlanır. UWBP güçlü geleneksel biyokimyasal övgü ve histolojik 2 analizleri akciğer fizyolojisi, çalışmaları için yararlı bir ektir. Akciğer değerlendirilmesi için kullanılan diğer prosedürler UWBP ile aynı avantajları sağlamamaktadır. İnvazif pletismografi hayvan 3,4 anesteziye edilmesi ve böylece elde edilen solunum ölçümleri mutlaka doğal bir duruma yansıtmayan gerektiren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ayrıca, mekanik ventilasyon ve kimyasal sorunlar için gereksinim gelecek ölçümleri 3,4 engellemektedir.Solunum veri toplama için bir başka yöntem UWBP 5 ile karşılaştırıldığında solunum parametrelerinde değişiklik daha ince daha duyarlı zorla salınım, gereğidir. Zorla salınım, ancak, invaziv bir tekniktir ve veri toplama 5-7 hayvan sonlandırılmasını gerektirir.
UWBP özel bir bölme içinde bir hayvana yerleştirilmesini kapsar. Inspirasyon sırasında, gelgit hava ısıtılır ve su buharı basıncı artırarak akciğerlerde nemlendirilmiş ve gaz 8 termal genleşmeye neden olur. Bu etki, pletismograf 8 odacığı içinde basıncında bir artışa neden hava hacmi net bir değişime yol açar. Tersi hayvandan bir solunum dalga oluşturarak ekspirasyon sırasında oluşur. Dalga formu analizi, daha sonra solunum iz ölçmek için kullanılır: solunum hızı (solunum / dk), toplam solunum döngü süresi (sn), inspirasyon / ekspirasyon zamanı (Ti / Te, sn) nedeniyle her tidal hacme basınç değişiklikleri (P T). UWBP hayvan modellerinde solunum fizyolojisi hassas, invazif olmayan, saptanması, ve solunum yolu hastalıkları ve akciğer fonksiyon 6,9 ilerlemesini ölçmek için kullanılabilir. Diğer teknikler, pletismografi aksine UWBP anestezi, sınırlama ve eserleri ve deneysel değişkenliği 6,9 üreten invaziv manipülasyon kullanımını önler. Anestezi, solunum baskılayabilirkalp hızını değiştirebilir ve 10 düzenlemek için zor olabilir. Corticosterone ve epinefrin 11,13 bırakın yoluyla kısıtlamaya nedeniyle ek stres solunum bir artış neden olur. UWBP en önemli özelliği uzunlamasına çalışmalar bu mükellef hale fizyolojik değerlendirme tekrarlanır. UWBP kuvvetle akciğer fizyolojisinin boyuna değerlendirilmesi için tavsiye ve gelecekteki solunum ilaç değerlendirilmesi için değerli bir beceri sunmaktadır. Bleomisin, ovalbümin, ve hipoksi çeşitli çalışmalarda solunum tehditlerine uyarılması için kullanılmıştır ve UWBP başarılı bir şekilde doğru bir değerlendirme akciğer fizyolojik 7,9,13-16 ölçmüştür. Açıklanan protokol standardı yetişkin fareler laboratuvar için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu tür UWBP sıçan, gine domuzu ve insan-olmayan primatlarda 17-20 gibi diğer hayvanlar için adapte edilmiştir. UWBP sadece pulmoner disfonksiyon değerlendirilmesi ile sınırlı değildir, ancak, aynı zamanda, akciğer olgunlaşma 3 değerlendirilmesi için kullanılmıştır.UWBP çok yönlülük, basitlik ve uyarlık hayvanlarda akciğer fonksiyonunu değerlendirmek için mükemmel bir tekniği kurduk. Çeşitli yazılım (malzeme ve ekipman tabloya bakınız), bu prosedürü takip için gerekli olacaktır. Tecrübeli bilim adamı, 1 saat içinde bir fare ile bu protokolü gerçekleştirmek mümkün olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki deneysel prosedür Monash Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Bilimsel Amaçlarla Hayvan Bakımı ve Kullanımı (2006) Uygulama Avustralyalı Kanunu uyarınca yapılmaktadır. Temsili sonuçlar üretmek için kullanılan Yetişkin dişi C57BL / 6 fareleri, Monash Hayvan Hizmetleri elde edilmiştir. Fareler, 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü ile belirli patojensiz, sıcaklık ve nem kontrollü bir odada barındırıldı. Bu fareler, yiyecek ve suya istedikleri kadar ulaşabilirler.
1. İlk Kurulum
- Bir USB kablosu ile kayıt için veri toplama makinesine dizüstü / masaüstü bağlayın.
- BNC kablo ile veri toplama makinesinin 'girişine 1' ile 'çıkışı 1' den Köprüsü Amplifikatör bağlayın.
- Sekizli Köprüsü Amp 'Kanal 1' içine basınç dönüştürücü takın. Üzerinde veri toplama makineyi açın ve analiz yazılımı açın. Yazılım otomatik olmalıotomatik (malzeme ve ekipman tabloya bakınız) ekipman kurulumu algılar.
- Yazılımın kurulum araç çubuğunda bulunan Açık Kanal ayarları. Değiştirme kanallarının sayısı 1 olarak kaydedilmiştir.
- Oda basıncı ve Köprü Amplifikatör kalibre su kolonu cihazı ölçmek için barometre ayarlayın. Su kolonu cihazı plastik boru ile bağlı iki adet 5 ml'lik şırınga serolojik pipetler içerir.
- Su ile sütunları doldurun ve su seviyeleri bir cetvel ile dengeli olmasını sağlamak. . Her bir pipet üstüne plastik hortumun bir parçasını, Şekil 2 geç su kolonu düzeneği;.
2. Köprü Amplifikatör Kalibrasyon
Not: su sütuna köprü yükseltecine hava enjeksiyonu kalibre etmek için 1 cm H 2 O saptırma oluşturmak için gereklidir. Bu koşullar altında meydana gelen tek bir set ve kullanıcının cihazın bağlıdır olacaktır. Açıklık getirmek için bu adımları dBu laboratuvar kalibrasyon gerçekleştirmek nasıl emonstrate.
- 300 ul bir 1 ml şırınga çekme; su sütununun sağ tarafındaki boru sonunda vana için şırınga ekleyin. NOT: musluk şırınga ve su sütununa açık olduğundan emin olun, ve oda havasına kapalı. Su seviyeleri bu noktada dengeli değilseniz oda havasına ve su sütunu açık olduğunu, bu suyu dengelemek böylece, stopcock çevirin. Su sütununun sol taraftaki boru şırınga daldırma ile oluşturulan basınç değişikliğini ölçmek için basınç transdüktörüne bağlı olmalıdır.
- Basınç dönüştürücü (transduser üst halkası) üzerine konnektörüne sol taraftaki su sütunundan boru takın.
- Yazılımın sağ taraftaki ana ekranında kanal 1 ve "Köprü amp" (malzeme ve ekipman tabloya bakın) seçmek için yanında bulunan kaydırma aşağı menüsünü seçin.
- Enter5 mV, 20 Hz düşük geçiş, için ayarlar 'invert' kutusunu işaretleyin ve 'sıfır' düğmesine tıklayın. ~ 0 mV'de izini ayarlamak için 'sıfır' tıklayın. Kolay görüntüleme için 1: 4 pencere boyutunu azaltın.
- Kurmak, her şeyi ile 3 sn bırakarak, 1 ml şırınga bastırın. Basınç değişti çünkü bu yazılım üzerinde ani bir başak gösterecektir. 300 ul basıldığında basınç 1 cm su kolonu suyu hareket edecek. Bu bilinen değer Köprüsü Amplifikatör kalibre yardımcı olacaktır.
Not: nedeniyle 300 ul depresyona odasındaki basınç artışı sonraki hesaplamalar için kullanılan P K değerine karşılık gelir. - Köprü Amp penceresinin sol alt köşesinde bulunan 'giriş birimleri' seçin.
- Önce aksi 'Sıfır Bölgesi' olarak bilinen başak "arka plan iz" vurgulayın.
- Bir sonraki 'noktası 1' için oku tıklatın ve bu bac üretecek-0,002 mV-0.002 mV aralığında kground sinyali (tam değer 0 mV olması asla).
- Tipi '0' penceresinde arka plan sinyal pencereye bitişik.
- Şırınga basıldığında gelen "grafiğinin artan basınç bölgesi" vurgulayın. 2 işaret yanındaki oka tıklayın ve değeri 0.9-1.2 mV aralığında olmalıdır.
- Tür '1' sonraki "artan basınç" penceresine penceresinde. Adımları 2.7 ve 2.8 üzerine bir görsel açıklama için Sekizli Köprüsü Amp zarar gösterebilir belirtilen aralıkların dışında bulunan 3. Değerleri Şekil bakın.
- Pencerenin sağ üst köşesinde bulunan 'birimleri tanımlamak' seçeneğini ve "cmH2O" gidin. Bu seçenek mevcut değilse, elle girilmiş olabilir. Ok tıklayın.
- 'Köprü Amp' menüsüne dönmek (2.1 bakınız). 'Sıfır' ile 1 mV ve set amplifikatör seçin;. Bu kalibrasyonu tamamlamak ve su kolonu güvenle kaldırılabilir.
3. Kayıt Akciğer Fonksiyon
- Fareyi (g) tartılır. NOT: önce fizyolojik değerlendirmesine Bir hafta pletismografi odası çevreye fareyi tanıtmak. Bu alışma yardım ve daha sonraki bir tarihte bu işlemi yaparken stresi azaltacaktır. UWBP kurulumu gösteren genel bir şemadan için Şekil 4'e bakınız.
- Bir rektal termometre ile vücut ısısını ölçün. Yerleştirilmeden önce vazelin ile kayganlaştır. Sıcaklık okuma kaydetme ve% 80 (h / h) etanol ile yağlayıcı temizleyin. Bu tür bebek sıçan yavrularından gibi çok küçük hayvanlar kullanıldığında, ortalama vücut ısısı değer yerine, bir kızıl ötesi termometre ile belirlenebilir.
- Pletismografi odasının bir delikli ucunda sıcaklık / bağıl nem probu yerleştirin. Sıcaklık, nem ve barometr kaydediniçinde fare koyarak önce pletismografi odasının içine ic basıncı.
- , Pletismografi odasında fare yerleştirin hafifçe açık ucunu kapsar. Bu, fare alışmasına izin verir. Bölmesini kapatın.
- Tek delikli pletismografi odasının tarafında takılı sıcaklık / nem probu ile, artık iki delik diğer tarafında dönüştürücü ve şırınga takın.
- Yaklaşık 15-45 saniye boyunca yazılım programına ve kayda Basın 'Start'. Hayvan hareket olmayan veriler rekor 5-10 sn. Hareket hayvanın bazal solunum fizyolojisi değiştirebilir ve kötü sonuçlar verecektir. Solunum programı doğrusal bir yolda salınım gerekir. Bunlar kullanılabilir veri bulunmaktadır. Not: idrar veya dışkıya pletismografi bölmesi içindeki bir sıcaklık artışı ve nem yol açabilir. Bu analiz sırasında sonuçları bozar. Idrara çıkma ya da dışkılama durumunda, pl kaydını hemen durdurmak ve temiz% 80 (h / h) etanol ile oda ethysmography. Veri reddedilmesi gerektiğini Suboptimal sonuçları, görsel temsili için Şekil 6'ya bakınız.
- Yazılım üzerinde 45 sn basın 'Dur' için kaydettikten sonra programı (malzeme ve ekipman tabloya bakın). Pletismografi odasından fareyi çıkarın ve hemen odasının sıcaklık ve nem kaydedin. Bu hayvanı stres olabilir sürekli fazla 45 saniye boyunca kayıt yapmayın.
- Kafesi, sprey ile fare dönün ve% 80 (h / h) etanol ile bölmesini silin.
- Odası kurulayın ve bir sonraki fare üzerinde geçmeden önce temel sıcaklık ve nem dönmek için izin verin. Tekrar 3.1 müteakip hayvanlar için 3.9 için yineleyin. Not: Birden fazla hayvan üzerinde çalışılmış yapılıyorsa, her yeni önce hayvana yakın bazal değerlere odası sıcaklığı ve nem dönüş odasında koymak emin olun.
4. Pletismografi Analizi
Hayırte: Böyle tidal hacim (V T) ve aşağıdaki değişkenleri ölçülmesi gerekir dakika hacmi gibi solunum parametreleri hesaplamak için: solunum hızı (solunum / dk), toplam solunum döngü süresi (sn), ilham / sona erme zamanı (Ti / Te, nedeniyle her Tidal hacim (P T). saniye) ve basınç değişimi 1 izlemesi ölçülebilir değişkenleri göstermektedir Şekil. Aşağıdaki adımlar, bu değişkenleri ölçmek için bir yazılım (bkz malzeme ve donanım tablosunu) kullanın. Analiz ederken, koklama veya hareket içeren iz bölgeleri kaçının. Tekrarlanabilir sonuçlar için, iyi nefes iz en az 5 saniye gereklidir. Farklı solunum izleri bir Örneğin 5 ve Şekil 6'ya bakınız.
- 1 ve kullanılabilir verilerin 5 sn seçmek: 1 tam ekran ekran, set görünümünü açın. Bu temsili bir anlık Şekil 5'te gösterilmektedir.
- Yanlısı üst kısmında bulunan mini veri ped penceresini açındatapad'i sekmesinde gram. Kanal 1 seçin ve sağ sütunda sol sütunda 'döngüsü ölçümleri' ve 'ortalama döngüsel yüksekliği' seçeneğini seçin.
- 'Birini seçin ve 1 (msn) için minimum pik tespiti için ölçeğini ayarlayın. Bu, her zirve değerinin tespitine olanak ve küçük salınımlar üreten küçük hayvanları kullanırken son derece önemli hale olacaktır.
- 'Tamam' ı tıklatın. Bu (P T) ölçümü 'nedeniyle her tidal hacme Basınç sapmasını' sunacak.
- Mini veri pad, 'olay sayımı' ve ardından seçin 'döngüsü ölçümleri' Tamam 'ı tıklatın. Bu 'frekansı' (f) ölçüm sunacak.
- Frekans nefes / dak dönüştürülmesi gerekmektedir. Bu 60 sn değerini çarparak ve (min) kayıt genel zaman cevabını bölünmesiyle yapılır.
- Mini veri pad, seçin 'cycle ölçümleri dönemde 'takip' ve '' Tamam. Bu toplam nefes alma döngüsü zamanı '(T tot, sn) ölçüm sunacak.
- Sonraki adımlar tepe inspirasyon ve ekspirasyon zaman değerlerini oluşturmak için bir macroinstruction oluşturmak için kullanılır. Imleç tepe / çukur maksimum üzerinden doğrudan olun ve 9 sıralı zirveler ve dipler bir yorum ekleyin. Şekil 5'te gösterildiği gibi salınım zirve ile başlayın.
- Ardından, pencere seç: veri ped ve sağ sütunda sol sütunda, 'süre' içinde 'seçim bilgilerini' tıklayın ve 'Tamam' düğmesine tıklayın Açılan pencerede sütun 1..
- Programın üst kısmında bulunan makro seçin ve ardından kaydetmeye başlayın. Şimdi seçin komutları: 'Dosya Başlat', 'Git', 'Bul' ve 'Bul' tıklayın.
- Seçin komutları: 'yorumları bul' Bul 've. Sağlanan 'içeren' kutusuna açıklama kutusuna yazdığınız aynı cümleyi yazın. 'Seç Önceki Point' sekmesini seçin ve 'Bul'.
- Seçin komutları: 'veri pad Ekle'. Ardından, makro seçin: makro komutları ve tekrarı başlar. Görünen yineleme sayısı penceresi 9 ayarlanmış olmalıdır.
- Komutunu seçin: 'Gelecek bul. Seç komutu: 'veri pad Ekle'. Nihayet makro komutları ve bitiş tekrarlayın seçin.
- Şimdi makro seçin ve kaydı durdurmak. Kaydet ve hayvan sayısından sonra makro adı. NOT: Her hayvan için makro ayarlama makro uzunlamasına çalışmalar için kullanılan ve zaman tasarrufu sağlar.
- Şimdi makro her yorumun arasındaki İlham (T i) ve Sona Erme (T e) zamanı elde etmek çalıştırılabilir. Veri datapad'i kanalında 1 altında görünecektir. Son Kullanma ve ilham ardışık oluşur ve veriler bu sırayla görünecektir.
- Veri elle inspirasyon ve ekspirasyon değerlere bölünmüş gerekir. Ortalama T i ve T e elde etmek için her parametrenin dört veri değerleri ortalama.
- Birincil değerleri tidal hacmi (VT, mi) elde edilmiştir sonra hesaplanabilir. Drorbaugh ve Fenn 8 denklemi kullanılan gelgit hacmi elde etmek için:
V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((T CORE (P B - P C)) / (T CORE (P B - P C) - T C (P B - P CORE)))
Nerede
V T: Tidal Hacim
P k: 1 ml her enjeksiyonundan dolayı Basınç saptırma (2.5 adıma bakınız)
T çekirdek: Her hayvanın Çekirdek sıcaklığı
P C: cha kamara sıcaklığı X Bağıl nem Su buharı basıncımber
T C: Hayvan odasındaki sıcaklık
P çekirdek: vücut sıcaklığında Basınç (vücut sıcaklığında su buharı basıncı x 1.0)
P t: her tidal hacmi nedeniyle Basınç saptırma
V k: Kalibrasyon için Hacim enjeksiyon
P B: barometrik basınç - Tidal hacmi hesaplanmıştır sonra aşağıdaki parametreler de belirlenebilir:
- Dakika Hacmi (ml / dak) = V T xf
- Dakika Hacmi (ml / dak / kg) = (V T xf) / Vücut ağırlığı (kg)
- V T (ml / kg) = V T (ml) / Vücut ağırlığı (kg)
- İnspiratuar Duty Cycle (%) T i / T tot =
- İnspiratuar Akış Hızı (ml / sn) = V T / T i
- Erme zaman ilham zaman Oranı = T i / T E
- Toplam döngü süresi (lerec) = İlham süresi (sn) + erme süresi (sn)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedür doğru takip edildiğinde, tutarlı bir salınan iz veri analizi yazılımı oluşturulur. Prosedür basit bilgi işlem hesaplamalar ile kurulum. Listelenen solunum parametrelerini belirlemek 5 bir kontrol (sağlıklı) fare, uygun bir solunum iz temsil Şekil sonra birkaç dakika içinde bir solunum izini sağlar. Hayvan aktif hareket halinde değilken, uygun salınan veri üretilmektedir.
UWBP kontrolü ve pulmoner fibrozis kohorttaki arasında akciğer fonksiyonunun son derece yararlı ve güvenilir bir değerlendirmedir. 7 kontrol grafiği karşılaştırıldığında 14. gün de bleomisin-kaynaklı pulmoner fibrozis ile bir fare akciğer fonksiyonunu gösterir Şekil, Şekil 7 bir görsel fark gösterilmektedir Bleomisin 7 tutarlı. Daha önce ele alındığı gibi, bu prosedür solunum Paramete değişimleri ölçmek için etmemizi sağlayan tekrarlanabilirBu iki grup arasında zamanla rs.
Elde edilen sonuçlar, ortalama ± SEM olarak ifade edilecektir. Bu kopyalama ve basit bir Excel içine toplanan verileri yapıştırmak için tavsiye edilir. Bu adımlar 4.13 & 4.14 tartışılan hesaplamalar yapmak için yararlı olacaktır. Şekil 8'de gösterildiği gibi solunum fonksiyon görsel arasında iki grup karşılaştırıldığında olabilir.
Solunum döngüsü Şekil 1. Farklı bileşenler barometrik pletismografisi. Bu grafik, b) nedeniyle her tidal hacmi (PT) için basınç değişikliği, c)) nedeniyle ilham (ΔPi için bir basınç) değişiklik göstermektedir kullanarak resimli (nedeniyle sona erme (ΔPe), d) toplam solunum devir süresi (ue), e) İnspirasyon zamanı (Ti) ve f) sona erme süresi basınç Te değiştirmek). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. barometre ve su sütunu kurulum görsel gösterimi. Rakam kalibrasyon işlemi için barometre ve su kolonu kurma okuyucuya yardımcı olmak amacıyla tasarlanmıştır. Su hükümdarı tarafından destekli iki sütun içinde seviyesi olduğuna dikkat edin. İki sütun plastik boru 15 cm ile bağlanır. Sağ (65 sm) üzerinde boru, 1 ml şırınga ve sola (75 cm) aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır cihazı ile bağlantılı basınç transdüktörüne bağlanır. Not:. Boru uzunluğu su 1 cm hareket ettirmek için gerekli hacmi (300 ul) belirler görüntülemek için buraya tıklayınbüyük resim.
Şekil 3. Gösteri 2.4 ve Köprü Amp Kalibrasyon 2.5 adımları. Bu rakam ekipmanın kalibrasyonu için adımları 2.7 ve 2.8 göstermektedir. Kesin sonuçlar elde etmek Köprüsü Amp düzeltmek için çok önemlidir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. UWBP kurulum genel bir şematik. Sol tarafta bir hayvanını ihtiva eden pletismografi odasının bir tarafına bağlı nem / sıcaklık probudur. Sağa kalibrasyon şırınga ve basınç dönüştürücü lider olduğunuBilgisayarda bir solunum iz üreten veri toplama sistemine pletismografi odasından. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 5. UWBP kullanıldığında elde edilen bir C57BL / 6 fare kontrol, solunum solunum izinin örneği. Bu nefes alma izleme, bir kontrol hayvanından alınan, uygun ve tutarlı verileri gösterir. Arka arkaya dokuz yorum adımları 4,1-4,13 izleyerek tepe ve listelenen solunum parametreleri elde etmek salınımları solunum olukları ile ilave edilmektedir. Zaman (cm.H 2 O) x-ekseni (sn) ve y ekseni boyunca basınç değişiklikleri birlikte temsil edilir. vi için buraya tıklayınbüyük resim ew.
Şekil UWBP kullanırken C57Bl / 6 fare elde edilen farklı Suboptimal izlerinin 6. örnekleri. Suboptimal sonuçları uygun veri olarak şaşkın ve zavallı analiz için en yaygın kaynağıdır olabilir. Bu rakam analizi için asla kullanılmamalıdır en yaygın suboptimaldir izlerini göstermektedir. Bu nefes izleri hayvan koklama ve hayvanın bazal solunum fizyolojisini değiştiren hareket ederken) bir nefes iz kaydedildi göstermektedir. B) zamanla yavaş yavaş artan salınımlar çıkan kaydedilen bir iz genellikle yoğunlaşma ve kurmak nem neden olur. Ancak, iz etanol ile pletismografi odasını silerek veya kalibrasyon adımları yineleyerek düzeltilebilir. C) izhayvan veya araştırmacı ekipman ile çekici ise pletismografi odası hareketi sırasında kaydedilen. Zaman x-ekseni (sn) ve y ekseni boyunca basınç değişiklikleri (cm.H 2 O) birlikte temsil edilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 7. UWBP kullanıldığında oluşturulan akciğer fibrozlu bir C57BL / 6 fareden elde edilen bir nefes alma izleme örneği. Bu nefes alma izleme bu makalede açıklanan UWBP prosedür kullanıldığında elde uyarılan pulmoner bir hayvandan elde edilen uygun ve tutarlı verileri gösterir. Arka arkaya dokuz yorum adımları 4,1-4,13 izleyerek tepe ve listelenen solunum parametreleri elde etmek salınımları solunum olukları ile ilave edilmektedir. Zaman Repre olduğunux-ekseni (sn) ve y ekseni boyunca basınç değişiklikleri boyunca bütçe sahibi (cm.H 2 O). resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Kontrol ve bleomisin arasında karşılaştırıldı Şekil 8. Solunum fonksiyon Burada temsil ne benzer sonuçlara kullanıcının sağlayacak UWBP kullandıktan sonra pletismografi analizlerini gerçekleştirmektedir. C57Bl / 6 fareler meydan okudu. Bu rakam bleomisin meydan hayvanın (noktalı gri çizgi) ve kontrol hayvanları (katı siyah çizgi) arasındaki fizyolojik farklılıklar göstermektedir. Bu grafikler a) Sona erme süresi (sn karşılaştırmalar), b) Inspiration süresi (sn), c) İlham görev çevrimi (%), d) İnspiratuar akış hızı (ml / sn) göstermeke) Solunum hızı (solunum / dk), f) Dakika hacmi (ml / dak / kg), g) soluk hacmi (ml / kg) ve h) Toplam çevrim süresi (sn). Akciğer fonksiyon verileri bleomisin cebine İlerleyen günlerde 0, 7 hayvanların aynı kohort uzunlamasına toplandı ve 14 tanesi. Temsilcisi veri Murphy ve ark adapte edilmiştir. (2012) 16. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan tekniği pervasız ve anestezisiz farelerde solunum parametrelerinin değerlendirilmesi için invaziv olmayan bir yöntemdir. Bu protokolün güçlü minimal eserler ile uzunlamasına akciğer fonksiyonu ölçmek için sadeliği ve hassasiyet bulunur. Ancak, bazı sınırlamalar ve kritik adımlar prosedürü hakkında dikkat edilmesi vardır. Birincisi ve en önemlisi, fare beş saniye en az odasının içinde sakin kalmak gerekir. Fare solunum şeklini bozmak ve dolayısıyla değişken sonuçlar (Şekil 6a) sağlayacaktır Eklenen stres. Bu dezavantajı olasılıkla kalır ve zaman zaman beklenebilir olacaktır. Ancak, ev-kafes içinde fare yerine ve ona kolayca bu düzeltecektir yerleşmek için zaman tanıyacaktır. Bu hayvan, uygun / kullanışlı veri beş saniye elde etmek için bölme ortamında rahat hissettiği önemlidir. Ayrıca göz odasının çevre konusunda gereklidir. Çevre uSolunum mekaniği nrelated, sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir. Değerlendirme arttıkça artar oda ısı, nem, ve bunun yanı sıra oksijen azalan süresi de önemli ölçüde havalandırma etkilemektedir. Havalandırma zamanlaması nem ve sıcaklık bölmenin ve bunun yanı sıra, oksijen 21 azalan artırır. Oda içinde küçük bir sızıntı ısınma 22,23 oluşturulan ısı akımlarını azaltılmasında yardımcı olabilir. Tartışılan protokolü belirtilen ekipman ve araçların özgüdür. Bölümünde iki köprü amplifikatör kalibrasyonu okuyucunun ekipman bağlı olacaktır. Bu boru uzunluğu gibi faktörler farklı olduğu takdirde bir hava enjeksiyonu, 300 ul 1 cm.H 2 O sapmaya neden olmayabilir.
Analiz zamanına bağlı fizyolojik farklılıklar vardır. Kemirgenler sonuçta değişiklikleri oluşturmak, hangi doğal gece yaratıklar ve sirkadiyen döngüleri vardırDeney 24 zamanlama zaman solunum dikkate alınmalıdır. Bu zaman, böylece gerekli olan ve deneysel veri doğru kohort arasında mukayese edilebilir şekilde, deneyler planı. Bu iz hareketi dikkat çekmek için de önemlidir. Salınımlar doğrusal bir model çalışan değilseniz, bunun nedeni odasına bir yapı odası (Şekil 6b) içindeki yoğuşma veya nem yukarı veya etkisiz mühür için genellikle. Sonuçta, bu sınırlamalar için dikkate alınabilir ve UWBP süreç hassas solunum ölçümü sağlamak için uygun bir şekilde yapılması. Bu yöntem, yenidoğan standart laboratuvar farelerinde solunum değişiklikleri ölçmek için modifikasyonu (küçük odacık boyutu) gerektireceğini dikkat etmek de önemlidir (örneğin, <2 hafta C57Bl / 6) o boyutta hayvanların solunum basınç değişiklikleri tespit etmek için .
UWBP önemli avantajlarını ortaya çıkarmaktadır, ancak bu aynı zamanda bir tartışma taşır.Müfettişler tartışma ile kendilerini oldum ve bu teknik araştırma sorusu için uygun olup olmadığını bilinçli bir karar vermesi gerekiyor. Başlangıçta, Fenn ve Drorbaugh (1955) 8, oda basıncında bir artış ısıtıldı ve pulmoner değerlere nemlendirilmesi solunan havanın neden olduğu düşünülmektedir; ters ekspirasyon oluştu. Bu tidal hacim hesaplama izin verdi. Sonraki araştırmalar basıncı değişiklikleri hava akımının 25 üretimi sırasında alveol basıncını değiştirerek neden olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma, hava yolu direnci hesaplama için pletismografi kullanımını belirtti. Enhorning vd. (1998) 26 kanıt sağladığını tidal hacim, solunum hızı ve hava yolu direnç pletismografi odasının içindeki tüm etki basınç dalgalanmaları. Bölme içindeki hava ısıtılır ve vücut şartlarına nemlendirilir zaman basınç dalgalanmaları üçte iki oranında azaltılır ve artan dirençler amplifiye edilir <sup> 21. Tüm bu bileşenler basınç dalgalanmalarını yansıtacak gibi belirli bir solunum parametrelerinin ölçümleri doğru olup olmadığı tartışmalıdır. Sonuç olarak pletismografisi elde tidal hacmi kantitatif değerlendirmesinde 26 ziyade nitel olduğu sonucuna varılmıştır. Hem üst ve alt solunum yolu dirençleri bronkokonstriksiyonu 27 ölçüm belirsizlik yaratan pletismografi sisteminin bileşenleridir. Bu UWBP invaziv analizler ile karşılıklı kullanılmalıdır yazarın görüşündedir. Bu, aslında, sadece UWBP verilere dayanarak el yazmalarının belli dergilerin politikası kabul görmeyecektir. Bu okuyucu için başka bir göz olacak.
Özetle, UWBP uzunlamasına çalışmalarla özellikle mükellef standart laboratuvar kemirgenler, solunum parametrelerindeki değişiklikleri ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Bu tekniğin önemli avantajları invaziv prosedürlerin kaçınma vardır, kimyasalzorluklar ve anestezi gereksinimi. Bu araştırmacılar en yakından doğal olarak oluşan olayları temsil eder ve deneysel değişkenliği azaltmak fizyolojik veri toplamak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1 m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | Mac OS X 10.4 or later | |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5 ml Serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50 mm(w) x 1,500 mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80 mm(l) x 80 mm(w). Each lid has a 60 mm wide circular hole cut on the face of the lid 50 mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5 mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25 mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4 L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
