Summary
C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.
Abstract
In dit protocol, presenteren we de benodigde materialen, en de procedure voor het maken van aangepaste C. E legans Gewenning en Reproductie media (mCeHR). Bovendien, de stappen voor het blootstellen en acclimatiseren C. elegans gekweekt op E. coli om vloeibare media axenische worden beschreven. Tenslotte downstream experimenten die axenic C. gebruiken elegans illustreren de voordelen van deze procedure. Kunnen analyseren en bepalen C. elegans voedingsstoffen eis werd geïllustreerd door de groeiende N2 wild type wormen in axenische vloeibare media met verschillende concentraties heem. Deze procedure kan worden herhaald met andere voedingsstoffen om de optimale concentratie voor groei en ontwikkeling worm bepalen of de toxische effecten van behandeling met geneesmiddelen te bepalen. De effecten van verschillende concentraties heem op de groei van wildtype wormen werden bepaald door kwalitatieve microscopische waarneming en kwantificeren tHij aantal wormen die groeide in elk heem concentratie. Bovendien kan het effect van verschillende concentraties nutriënten worden getest door gebruik te maken van wormen die fluorescerende sensoren die reageren op veranderingen in de voedingsoplossing van belang uit te drukken. Bovendien werden een groot aantal wormen gemakkelijk geproduceerd voor het genereren van transgene C. elegans met bombardement met microdeeltjes.
Introduction
De bodem nematode Caenorhabditis elegans, is een krachtige modelorganisme gebruikt in tal van studies van de genetica tot toxicologie. Door de 1 mm grootte, korte generatietijd vier dagen kweekgemak en grote aantallen nakomelingen zijn deze nematoden is gebruikt in een aantal genetische en farmacologische screens 1, 2. Onderzoekers profiteren van deze worm aan moleculen en wegen bewaard in gewervelde systemen te identificeren. Deze routes omvatten celdood signalen, paden van het ouder worden en het metabolisme en het zenuwstelsel 3-6. Bovendien, de transparantie van C. elegans maakt het genereren van transgene lijnen met fluorescerende proteïne reporters, die direct gevisualiseerd kunnen worden om genexpressiepatronen en eiwit lokalisatie analyseren.
In veel studies deze nematode wordt gekweekt op een stevige agar oppervlak met behulp van nematode groeimedium (NGM) platen of in liquid culturen bezaaid met Escherichia coli als voedselbron 7,8. Deze bacteriële voedselbronnen kunnen biochemische en toxicologische studies verwarren met interferentie van bacteriële bijproducten die de interpretatie van de resultaten. Om deze effecten te voorkomen compounding, C. elegans kan worden gekweekt in een axenische vloeibare media die verstoken is van bacteriën als voedselbron. Met behulp van deze media, hebben we met succes gekweekt miljoenen hoogst gesynchroniseerde wormen voor vele standaard C. elegans protocollen waaronder microarray analyse van differentieel gereguleerde genen in C. elegans blootgesteld aan verschillende concentraties heem en productie van transgene wormen middels gen bombardement. Deze media is chemisch gedefinieerd en gewijzigd van een origineel recept van Dr Eric Clegg 9 geformuleerd. Met deze mCeHR media, hebben we met succes geïdentificeerde genen betrokken bij homeostase heem, genoemd heem responsieve genen (HRG s) 10, die zouniet mogelijk geweest in de reguliere groei omstandigheden die NGM agar platen geënt met E. benutten coli.
In dit protocol beschrijven we de procedure voor het invoeren en bijhouden van C. elegans gekweekt op E. coli de axenic mCeHR en gebruik deze methode om een groot aantal wormen te vinden voor het produceren van transgene C. elegans lijnen met behulp van microdeeltjes bombardement. We aanwezig studies die het nut van het gebruik axenic media voor het bepalen van de nutritionele behoefte C. tonen elegans gebruik heem als voorbeeld. Deze studies tonen aan dat het gebruik mCeHR media maakt snelle groei van een groot aantal C. elegans voor vele downstream toepassingen gebruikt door worm onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Worm Stammen
- Verkrijgen C. elegans wildkleur Bristol N2 stammen uit de Caenorhabditis Genetics Center (CBC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) hen op NGM platen geënt met E. coli stam OP50 7. Opmerking: Transgene worm stammen IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) gebruikt werden gegenereerd zoals eerder beschreven 11. IQ6011 kan worden aangevraagd bij de betreffende auteur.
2. Voorbereiding van de Modified C. elegans Habitation en Reproductie Medium (mCeHR)
Bereid mCeHR vloeibare media zoals hieronder beschreven 12. Dit axenische vloeibare media laat de wormen te groeien zonder extra voedselbronnen. Voer alle manipulaties van axenische vloeibare media en axenische wormen gebruik strikt steriele omstandigheden zoals een laminaire stroming kap.
- Verkrijgen ultra gepasteuriseerde vetvrije melk uit een supermarkt. Gebruik de gekoelde product en niet de ruimtetemperatuur product. Voorafgaand aan het gebruik in mCeHR medium, streep de melk op Brain Heart Infusion (BHI) agar platen en incubeer gedurende 3 dagen bij 30 ° C en 37 ° C om te controleren op steriliteit. Breng de melk 50 ml steriele buizen en bewaar bij -80 ° C
- Bereid een van de volgende componenten te combineren in de volgorde en hoeveelheden aan 1 liter mCeHR bereiden (Tabel 1A): 10 ml 2 mM choline dizuur citraat, 10 ml vitamine en groeifactor mix (zie recept in tabel 1B) 10 ml van 2,4 mM myo-inositol, 10 ml 2 mM hemine chloride, 250 ml gedeïoniseerd water. Afzuigen en filteren door een 0,22 urn filter unit.
- Voeg 20 ml nucleïnezuur mengsel (recept in tabel 1C), 100 ml mineralenmix (recept in tabel 1D), 20 ml 170 mg / ml lactalbumine hydrolysaat, 20 ml essentiële aminozuren, 10 ml van niet-essentiële aminozuren zuren, 20 ml 450 mM KH 2PO 4,50 ml 1,45 M D-glucose, 10 ml 1 M HEPES, natriumzout, 250 ml gedeïoniseerd water.
- Afzuigen te filteren steriliseren van de componenten. Verwijder het filter en voeg 1 ml van 5 mg / ml cholesterol. Zorg ervoor dat de pH van de media is ongeveer 6-6,5. Opmerking: Deze oplossing kan worden bewaard bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar.
- Voeg 20% (v / v) ultra gepasteuriseerde biologische afgeroomde melk aan de mCeHR medium vóór gebruik. Gebruik strikt steriele techniek (bijvoorbeeld in een laminaire stroming kap) bij het openen en aliquoting de melk. Bewaar de media bij 4 ° C.
3. Bereid C. elegans voor cultuur in Axenische mCeHR vloeibaar medium
- Kweek wormen tien 60 mm NGM platen tot er vele zwangere wormen en een minimale hoeveelheid OP50 E. coli op de platen.
- Verwijder de wormen uit elke plaat gespoeld met 5 ml M9 buffer (recept in tabel 1F) en gecombineerd in een 50 ml conische buis.
- Laat de wormen settle door uit de buis gedurende 5 tot 10 minuten staan dan voorzichtig de supernatant dat de E. coli.
- Herhaal de stappen 3.2 en 3.3 2x zoveel mogelijk van de resterende bacteriën mogelijk te verwijderen alvorens verder de procedure.
- Resuspendeer de wormen in 0,1 N NaCl in een volume dat een veelvoud van drie, bijvoorbeeld 1,5 ml, 3 ml of 6 ml waarin afzonderlijke wormen zichtbaar in de buis.
- Bleach de wormen door toevoeging van 5 N NaOH en 5% natriumhypochloriet (bleek) oplossing in een verhouding 01:02:06 naar de worm suspensie. Bijvoorbeeld, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% natriumhypochloriet: 6 ml van de worm suspensie. Meng de NaOH en bleekmiddel voor het toevoegen aan de worm schorsing.
- Vortex de oplossing krachtig tot het zwangere wormen opgelost en uitsluitend eieren zijn zichtbaar in de suspensie (ongeveer 5 tot 10 min). Toezien op het proces met behulp van een fase-contrast microscoop met een 10x doelstelling.
- Nadat de wormen volledig is opgelost, onmiddellijk pellet deeieren bij 800 xg gedurende 45 seconden bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en spoel de pellet twee keer met 10 ml steriel water door de pellet centrifugeren bij 800 g gedurende 45 seconden bij 4 ° C.
- Na het bleken, breng de pellet ei een 25 cm2 weefselkweek kolf die 10 ml mCeHR medium aangevuld met 100 ug / ml tetracycline. Doe dit met behulp van steriele technieken. Indien gewenst, extra antibiotica, waaronder 250 ug / ml nalidixinezuur, om bacteriegroei in de axenic vloeibare kweken voorkomen.
- Incubeer de vloeibare kweken bij 20 ° C op een schuddend incubator bij ongeveer 70 rpm.
- Controleer de wormen dagelijks te merken het ontwikkelingsstadium en de snelheid van de groei.
Opmerking: Worms zal aanvankelijk langzaam groeien en vereisen 7-10 dagen aan zwangere geworden. Aangezien de wormen acclimatiseren aan het vloeibare medium de generatietijd zal afnemen tot ongeveer 4 dagen wildtype (N2) wormen. - Na de wormen hebben ontkeld om de zwangere fase in vloeibare media, overdracht van de worm cultuur tot een conische buis en de pellet wormen bij 800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C met een swinging bucket rotor.
- Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet worm in een gelijk volume van 0,1 M NaCl. Gebruik bijvoorbeeld 10 ml 0,1 M NaCl voor wormen gekweekt in 10 ml mCeHR. Laat de wormen rusten gedurende 5 minuten op ijs.
- Voer het bleken procedure als hierboven beschreven in stappen 3.5-3.8, en laat de wormen groeien voor een tweede generatie de axenic vloeibare media. Indien nodig, voeg het antibioticum opnieuw om de groei van bacteriën te remmen.
- Opnieuw laat de wormen te gravid worden dan pellet en resuspendeer de wormen in 0,1 M NaCl, zoals beschreven in de stappen 3.12 en 3.13, daarna bleken opnieuw zoals beschreven in de stappen 3,5-3,8, een gesynchroniseerde bevolking te produceren. Groeien de L1 larven wormen in vloeibare media zonder antibiotica vanaf nu.
4. Synchroniseren Worms van LiquidCultuur
- Pellet en resuspendeer de wormen in 0,1 M NaCl zoals hierboven beschreven in stappen 3.12 en 3.13. Bleach zoals hierboven beschreven in stappen 3.5-3.8.
- Resuspendeer de pellet in ei 10 ml M9 buffer en laat de larven uitkomen O / N bij 20 ° C op een roterend platform shaker. Opmerking: De eieren uitkomen in L1 larven, maar niet verder ontwikkelen synchroniseren van de wormen in de fase L1.
- Stand houden en subcultuur wormen, pellet L1 larven bij 800 xg gedurende 5 minuten, dan resuspendeer de larven in 10 ml mCeHR en overbrengen in een 25 cm2 kolf. Laat de wormen te groeien bij 20 ° C op een roterend platform. Handhaven van een maximale dichtheid van 3000 / wormen ml / cm 2 om adequate voeding te verzekeren voor de wormen.
Opmerking: In dit stadium zijn antibiotica niet verplicht axenische omstandigheden te handhaven wanneer de procedures worden uitgevoerd onder toepassing van steriele technieken in een laminaire stroming kap. Wormen moet dagelijks worden gecontroleerd om de groei te volgen.
5. Gratiszing en ontdooien Worms voor Axenische Medium Culturen
- Freeze axenische asynchrone worm culturen of gesynchroniseerd L1 larven in vloeibare stikstof. Pellet wormen bij 800 xg gedurende 5 minuten daarna opnieuw in suspensie in S-buffer (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCl) met behulp van 0,5 ml per flacon. Voeg een gelijk volume S buffer met 30% v / v glycerol aan elk flesje en breng de wormen tot -80 ° C voor langdurige opslag in vloeibare N2. Freeze ongeveer 1 x 10 6 wormen per ml in elke flacon.
- Ontdooi wormen door incuberen van de flesjes bij 37 ° C gedurende ongeveer 2 minuten totdat vrijwel al het ijs is gesmolten. In een laminaire stroming kap, breng de wormen een steriele kolf die mCeHR en plaats ze bij 20 ° C.
6. Bepaal het effect van Hemin concentratie op groei en voortplanting in mCeHR
- Gebruik axenische mCeHR media om voedingsstoffen afhankelijke groei van C. assay elegans. Om het effect te bepalen of hemine concentratie op groei en ontwikkeling worm, gebruik gesynchroniseerd axenische N2 wormen of andere stammen van belang. Synchroniseer L1 larven, zoals hierboven beschreven in paragraaf 4.
- Op de volgende dag, pellet en tel gesynchroniseerd L1 larven en vul aan tot 1 worm per pl axenische media. Voeg 10 mM hemine chloride in 0,3 M NH4OH en breng de pH 8 met geconcentreerde HCl.
- Voeg 800 ul van mCeHR media om een 24-well plaat. Voeg 100 wormen aan elk putje in 100 pl medium. Voeg hemine chloride aan elk putje in concentraties variërend van 0 uM, 1,5 uM tot 1,000 uM in drievoud. Zorg ervoor dat alle putjes bevatten dezelfde concentratie van 0,3 M NH 4 OH. Voorzichtig geresuspendeerd de wormen voor pipetteren zodat 100 L1 larven worden toegevoegd aan elk putje.
- Onderzoek de wormen per dag en let op de groei in elke concentratie in elk putje. Tel het aantal wormen na 9 dagen incubatie en plot het aantal wormen / ml overeenkomstig elke hemeconcentratie (Figuur 1).
7. Effect van Hemin concentratie op Heme Sensor Worms
- Incubeer gesynchroniseerd L1 heem sensor wormen (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR met 4 uM, 8 uM, 10 uM en 20 uM hemine.
- Afbeelding de wormen met behulp van fluorescentie confocale microscopie, 48 uur na incubatie (Figuur 2).
8. Gebruik makend mCeHR het genereren van transgene C. elegans gebruiken microdeeltjes bombardement
Opmerking: De procedure voor het genereren en uitvoeren van microdeeltjes bombardement behulp unc-119 (ED3) wormen gekweekt in mCeHR is geschetst in figuur 3 13.
- Worm Voorbereiding
- Breng circa 1 x 10 6 asynchrone unc-119 (ED3) wormen in 90 ml mCeHR media in een 175 cm2 kolf een week voorafgaand aan beschieting. Laat de wormen te groeien bij 20 ° C ona schudden platform bij ~ 70 rpm (Figuur 3-1).
Opmerking: Een week later, dient de worm dichtheid significant groter met veel volwassen zwangere wormen. Ongeveer 3 x 10 7 wormen is vereist voor bombardement met microdeeltjes. - Chill JM109 E. coli gezaaid 10 cm NGM platen op ijs.
- Breng de axenic wormen twee 50 ml conische buizen en centrifugeer de wormen bij 800 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de wormen in elke buis 50 ml M9 buffer (Figuur 3-2).
- Laat de volwassen wormen pellet door de zwaartekracht gedurende 10 tot 15 minuten op ijs.
Opmerking: De pellet 2 ml moet bevatten nu> 90% volwassen wormen. Deze 2 ml pellet moet ongeveer 5 x 10 6 wormen te hebben en is voldoende voor een bombardement met microdeeltjes. - Smeer het gehele oppervlak van de gekoelde JM109 gezaaid NGM plaat met de 2 ml pellet van wormen. Laat de vloeistof volledig geabsorbeerd dan Laat de plaatgedurende 30 minuten op ijs voordat u verder gaat (Figuur 3-3).
- Breng circa 1 x 10 6 asynchrone unc-119 (ED3) wormen in 90 ml mCeHR media in een 175 cm2 kolf een week voorafgaand aan beschieting. Laat de wormen te groeien bij 20 ° C ona schudden platform bij ~ 70 rpm (Figuur 3-1).
- Bereiding van gouddeeltjes
- Weeg 30 mg goud deeltjes in een gesiliconiseerde microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 70% ethanol en vortex de buis 5 minuten.
- Laat de buis zitten gedurende 15 minuten en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 seconden aan de gouddeeltjes pellet. Verwijder het supernatant met een pipet tip door voorzichtig aanraken van de punt aan de zijkant van de buis tegenover de gouddeeltjes.
- Was de gouddeeltjes met 1 ml steriel water, vortex gedurende 1 minuut en kort centrifugeer de buis bij 6.000 g gedurende 10 sec. Herhaal de wasstap maal, vervolgens resuspendeer de gouddeeltjes in 0,5 ml steriel 50% glycerol.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de goud deeltjes 60 mg / ml en bewaard kan worden gedurende 1 tot 2 maanden bij 4 ° C.
- Bereid de DNA-goud deeltje mix
- Combineer 10 ug van het gewenste plasmide DNA met 10 &# 956; g van de unc-119 redding plasmide in een gesiliconiseerde 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 50 ul van DI water en 100 ui en geresuspendeerd gouddeeltje oplossing vervolgens vortex gedurende 1 minuut.
- Voeg 150 ul van 2,5 M CaCl2 en geschud oplossing opnieuw gedurende 1 minuut. Aan deze oplossing, voeg 60 ul van 0,1 M spermidine en vortex gedurende 3 tot 5 minuten.
- Pulscentrifugeer de oplossing bij 6000 g gedurende 10 seconden, verwijder het supernatant en voeg 300 pl 70% ethanol. Vortex goed voor 1 min, pols centrifuge bij 6000 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 170 pi van 100% ethanol. Krachtdadig vortex de oplossing gedurende 5 tot 10 minuten puls dan centrifuge en verwijder het supernatant.
- Bombardement (Figuur 3-3)
Opmerking: Dit protocol wordt uitgevoerd met het deeltje levering systeem aangegeven in de tabel van Materialen / Equipment uitgevoerd. Volg de instructies voor het deeltje levering instrument beschikbaar.- <li> Leg een vel vloeipapier in een 15 cm plaat. Met een pincet, dip zeven macrocarriers individueel in 100% ethanol en leg ze op het weefsel te drogen.
- Grondig reinigen van de biolistische kamer, macrodrager houder, en target plaat met 70% ethanol. Schoon en autoclaaf het stoppen van schermen voor elk bombardement procedure.
- Laad de macrocarrriers in de houder met een pincet en druk in de houder met behulp van de zitplaatsen tool.
- Verdeel 20 ul van de met DNA beklede gouddeeltjes in het midden van elke macrodrager en laat de oplossing volledig drogen.
- Maak de twee delen van de druk verdeler met ethanol en monteren met ethanol gereinigd breekplaten. Schroef de gemonteerde druk divider en breekplaten in het bombardement kamer.
- Monteer een autoclaaf stopscherm met de macrodrager houder en plaats het apparaat op de metalen rek nodig is en vast te zetten.
- Plaats de geassembleerde macrocarrier apparaat in de biolistische kamer in de toegewezen sleuf onder de druk verdeler en lijn met de druk divider.
- Tape de open NGM plaat met de wormen op het doel plaat plank en sluit de deur van de kamer.
- Om wormen bombarderen, pas de druk aan die nodig is om de breuk schijven breken. Schakel het vacuüm tot 28 inch Hg druk, druk op de vuurknop totdat de schijven scheuren.
- Laat het vacuüm en verwijder de NGM plaat uit het apparaat. Was de wormen van de plaat en herverdelen op de twintig 10 cm NGM platen geënt met JM109 E. coli (Afbeelding 3-4).
- Laat de wormen te groeien gedurende 10 tot 14 dagen bij 25 ° C en verhongeren de platen. Wormen gered van de unc-119 defect zal de normale beweging te hebben en kunnen worden geïdentificeerd op dit moment. Kies ten minste 10 "wild-type" wormen uit afzonderlijke platen voor verdere analyse als deze vertegenwoordigen onafhankelijke transgene lijnen (Figure 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het kweken van C. elegans axenic vloeibaar medium helpt bij het bepalen van de voedingsstoffen die nodig zijn door wormen zonder interferentie van secundaire metabolieten die door E. coli. Wildkleur N2 wormen acclimatiseren aan mCeHR media binnen drie generaties en groei vertonen vergelijkbaar met wormen gegroeid op NGM bacteriële platen. Inderdaad, deze wormen worden gravid binnen 4 dagen vergeleken met 3,5 dagen wormen gekweekt op OP50 bacteriën.
Een voordeel van het gebruik van mCeHR werd gezien in studies die de nauwkeurige behoefte voedingsstoffen van deze wormen 14 onderzocht. In figuur 1 zijn wormen gekweekt in mCeHR aangevuld met toenemende hoeveelheden van heem, tot 1 mM. Waarnemingen van deze wormen toonde een duidelijke vertraging in de groei van heem concentraties onder 4 micrometer, met wormen ontwikkelen om de L4 larvale stadium, maar niet in staat om de voortgang van de zwangere podium na negen dagen in mCeHR. Bij concentraties van 10 uM en 2056, M heem de wormen ontwikkelen om de zwangere podium in 4 dagen en produceren grote aantal nakomelingen. Een maximum aantal nakomelingen werd gezien toen wormen werden gekweekt in mCeHR met 20 uM heem. Wormen blijven ontwikkelen en produceren van nakomelingen bij 100 uM en 500 uM heem. Echter, het aantal larvale nakomelingen significant gedaald in vergelijking met wormen gekweekt bij de optimale concentratie heem van 20 uM heem. Heem concentraties op of boven 800 uM resulteerde in onvolgroeide, ziekelijk wormen bij de L3 larvale stadium, waaruit bleek dat deze heem concentraties giftig voor de wormen.
Naast het bepalen van de optimale concentratie heem en het effect van haem deprivatie en toxiciteit heem op C. elegans groei kan heem reporter stammen worden gebruikt om de heem status van de worm in een beperkte concentratiebereik indirect beoordelen. De IQ6011 worm is een transgene worm die een heem responsieve transcriptionele reporter uitdrukt, P HRG-1 figuur 2. GFP expressie wordt onderdrukt bij 20 uM heem en neemt toe als de concentratie heem wordt verminderd. De incrementele veranderingen in concentratie heem nauwkeurig worden gecorreleerd met gen respons en expressie in mCeHR media.
Naast de mogelijkheid om zorgvuldig controleren nutriënten concentraties die aan de worm, mCeHR axenic media maakt de efficiënte groei van een groot aantal gesynchroniseerde wormen. Deze functie kan worden benut voor het bombardement met microdeeltjes (figuur 3). Met deze procedure ten minste een geïntegreerde regel zijn ontwikkeld uit alle microdeeltjes bombardement uitgevoerd (tabel 2).
Figuur 1. C. elegans heem groeicurve. wormen werden in verschillende concentraties heem 0 uM tot 1,000 uM in mCeHR 9 dagen. Het aantal wormen in elke concentratie werd geteld en uitgezet. Op 1,5 waren uM heem concentraties wormen L4 en niet in staat zich verder te ontwikkelen. Bij 800 uM heem werden de wormen belemmerd bij L2-L3 stadia en liet toxische effecten heem.
Figuur 2. Respons van heem sensor (Phrg-1 :: GFP) stam op verschillende heem concentraties in mCeHR. Synchronized transgene C. elegans tot expressie HRG-1 :: GFP werden gekweekt in media waaraan mCeHR 4, 8, 10 of 20 uM heem voor 48 uur. Beelden zijn gemaakt met een Zeiss LSM 710 confocal microscoop. Schaal bar is 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Schematische voorstelling van microdeeltjes bombardement in C. elegans behulp unc-119 wormen gekweekt in mCeHR. (1) Ongeveer 3 x 10 7 unc-119 (ED3) wormen worden gekweekt in 90 ml mCeHR media. (2) Gravids mochten vestigen op ijs gedurende 10-15 minuten in 50 ml conische buizen. (3) Een 2 ml pellet van ongeveer 5 x 10 6 gravid wormen werd gelijkmatig uitgespreid op een ongeplaatste NGM plaat. De wormen werden gebombardeerd met 12 ug van plasmide van belang en 6 ug unc-119 rescue plasmide gecomplexeerd aan gouddeeltjes. (4) Thij gebombardeerd wormen werden verdeeld op twintig 10 cm platen geënt met de E. coli-stam JM109. (5) Na 2 dagen incubatie bij 25 ° C, platen met wildtype wormen werden geselecteerd voor analyse van transgene expressie sterkte en segregatie tarieven.
| Tabel 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| Met behulp van steriele techniek en een 1 L (0,22 pm) vacuümfilter eenheid, filteren de volgende hoeveelheden voorraad oplossingen en water in de beschreven volgorde. | |
| Choline dizuur citraat | 10 ml |
| Vitamine-en groeifactor mix | 10 ml |
| myo-inositol | 10 ml |
| Hemin chloride | 10 ml |
| Gedemineraliseerd water | 250 ml |
| Nucleïnezuur mix | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| Lactalbuminehydrolysaat | 20 ml |
| Essential Amino Acid Mix | 20 ml |
| Niet-essentieel aminozuur Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-glucose | 50 ml |
| HEPES, natriumzout | 10 ml |
| Gedemineraliseerd water | 250 ml |
| Volume wordt 800 ml op dit punt Verwijder filter unit uit vacuüm voeg dan: | |
| Cholesterol | 1 ml |
| Ultra-gepasteuriseerde magere melk | 200 ml |
| Tabel 1B | |
| Vitamine-en groeifactor mix, 100 ml | |
| Oplossing 1: 60 ml water toe te voegen: | |
| N-acetyl-α-D-glucosamine | 0,15 g |
| DL-alanine | 0,15 g |
| Nicotinamide | 0,075 g |
| D-pantethine | 0.0375 g |
| DL-pantotheenzuur, hemicalciumzout | 0,075 g |
| Foliumzuur | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCl | 0.0375 g |
| Pyridoxine HCl | 0,075 g |
| Flavinmononucleotide, natriumzout | 0,075 g |
| Thiaminewaterstofchloride | 0,075 g |
| Oplossing 2: Bereid de volgende chemicaliën in 5 ml 1 N KOH: | |
| p-aminobenzoëzuur | 0,075 g |
| D-biotine | 0.0375 g |
| Cyanocobalamine (B12) | 0.0375 g |
| Folinezuur, calciumzout | 0.0375 g |
| Nicotinezuur | 0,075 g |
| Pyridoxal 5-fosfaat | 0.0375 g |
| Oplossing 3: 0,0375 g (±) α-L-liponzuur, geoxideerde vorm in 1 ml ethanol: | |
| Combineer oplossingen 1, 2 en 3 en breng het uiteindelijke volume op 100 ml. Bewaren in het donker bij 4 ° C of porties invriezen bij -20 ° C. Maak kleine volumes van de voorraden voor deze mix, zodat het snel wordt gebruikt. | |
| Tabel 1C | |
| Nucleïnezuur mix, 100 ml | |
| Tot 60 ml water toe te voegen: | |
| Adenosine 5 '-monofosfaat, natriumzout | 1,74 g |
| Cytidine 5'-fosfaat | 1,84 g |
| Guanosine 2 "- en 3 '-monofosfaat | 1.82 g |
| OR | |
| Guanosine 5'-fosfaat | 2,04 g |
| Uridine 5'-fosfaat dinatriumzout | 1,84 g |
| Thymine (voeg vorige) | 0,63 g |
| Breng de oplossing tot 100 ml en op te slaan in het donker bij 4 ° C of porties invriezen bij -20 ° C. Maak kleine volumes van de voorraden voor deze mix, zodat het snel wordt gebruikt. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl2 • 6H 2 O | 4,1 g |
| Natriumcitraat | 2,9 g |
| Kalium citraat monohydraat | 4,9 g |
| CuCl2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCl2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl2 | 0,1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O | 0,6 g |
| CaCl2 • 2H 2 O (altijd op de laatste) | 0,2 g |
| Maak kleine volumes van de voorraden voor deze mix, zodat het snel wordt gebruikt. | |
| Andere componenten | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Choline di-zuur citraat | 2 mM |
| myo-inositol | 2.4 mM |
| D-glucose | 1.45 M |
| Hemin chloride | 2 mM in 0,1 N NaOH pH 8,0 |
| HEPES, natriumzout | 1 M stockoplossing |
| Cholesterol | 5 mg / ml in ethanol |
| Lactalbumine enzymatisch hydrolysaat | 170 mg / ml |
| Tabel 1F | |
| M9 buffer, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H2O | 1 L |
| Autoclaaf 30 min | |
| 1 M MgSO4 (steriel) | 1 ml |
Tabel 1. Recepten voor componenten van mCeHR en mCeHR.
| Bombardement | Lijnen met wild type redding | Lijnen met rescue / transgene | Stabiele lijnen |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Gemiddelde | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tabel 2. Average aantal transgene C. elegans gegenereerd via bombardement met microdeeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol presenteren we een gemodificeerde axenische vloeibare media mCeHR dat zorgt voor een snelle C. elegans generatie met productie van een groot aantal wormen. Deze media toont een aantal voordelen zoals de wormen worden geteeld zonder vervuilen E. coli of bacteriële bijproducten en kan in voedings-en toxicologisch onderzoek worden benut. Het gebruik van E. coli of andere bacteriën in deze studies heeft verschillende nadelen. Bijvoorbeeld kan de groei van de bacteriën onder verschillende omstandigheden veranderen en de bacteriën metaboliseren moleculen die worden getest, verwarren de interpretatie van resultaten. De ontwikkeling van een bepaald middel om deze studies uit te voeren is zeer voordelig.
Hoewel C. elegans zijn geteeld in vloeibare media in eerdere studies 15, wormen gekweekt in de C. elegans onderhoud medium (CeMM) laten een duidelijke vertraging in de generatie tijden 16, in tegenstelling tot wat we kunnerve in mCeHR medium. Ons belangrijkste doel was om C. te exploiteren elegans nutriënten homeostase studeren met specifieke nadruk op heem en metalen metabolisme. Met dit in gedachten, mCeHR en modificaties die door onze fractie dit doel te bereiken en rechtstreeks geleid tot de identificatie van een aantal genen vereist voor het handhaven heem homeostase in de worm en uiteindelijk in vertebrate modellen 17, 18. Geherformuleerd mCeHR-1 media kunnen ook worden benut voor andere soorten nematoden waaronder Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila, en C. remanei. Daarnaast laag metaal formuleringen mCeHR-2 en mCeHR-3 in studies naar de toxiciteit van zware metalen en eisen 12 kan worden benut.
Vóór acclimatisatie, N2 wormen vertonen langere generatietijd van ongeveer 7 tot 10 dagen mCeHR media. Aangezien de wormen gesubcultureerd, deze generatie afneemt tot 4 dagen, vergelijkbaar met die van wormen gekweekt op OP50 bacteriën. Echter, de generatie langer voor bepaalde mutant wormen, aannemelijk wegens gebreken in voeding, beweging, of specifieke voedingsbehoeften.
Bij het gebruik van axenische vloeibare media is het essentieel dat fastidious steriele technieken worden gebruikt. Gewoonlijk wordt het gebruik van antibiotica geminimaliseerd en uiteindelijk geëlimineerd als de wormen acclimatiseren aan het medium en de resterende bacteriën geëlimineerd. Antibiotica worden aanvankelijk ervoor te zorgen dat de culturen axenic wanneer opgericht als het voorkomt de groei van residuele bacteriën die de worm culturen overweldigen. Na twee opeenvolgende ronden van bleken, zijn antibiotica weggelaten uit de culturen als voortdurende gebruik van antibiotica alleen maskers arme aseptische technieken die essentieel zijn voor het kweken van wormen axenisch. Behulp van deze technieken in een laminaire stroming kast zijn, hebben de auteurs in staat om de wormen axenisch te groeien zonder verontreiniging. Bovendien, de juiste opslag van de media en componenten is essentieel voor worm onderhoud en groei. De wormen moeten worden gecontroleerd op de snelheid van de groei en gesubcultureerd van het verzamelen, wat kan leiden tot dauer formatie als essentiële voedingsstoffen zijn uitgeput voorkomen. Dit kan worden voorkomen door ervoor te zorgen dat de dichtheid van wormen niet meer dan 3000 wormen / ml / cm 2. Onderzoekers die nieuw zijn voor groeiende C. zijn elegans axenisch kunt dit bereiken door de dagelijkse controle van de wormen en het tellen van de wormen wekelijks.
C. elegans onderzoekers profiteren van de transparante eigenschappen door het genereren van transgene wormen uiten fluorescent gelabeld markers die het mogelijk maken voor de visualisatie van genexpressie en eiwit lokalisatie. Gebruik makend biolistische bombardement toegestaan voor generatie low copy integranten dat de kwesties van extrachromosomaal arrays en verhoogde genexpressie vermeden opgemerkt met transgenics gegenereerd met behulp van injectie 19. Voorheen, een nadeel genereren transgenen metmicrodeeltjes bombardement van C. elegans was de vereiste ei plaat voorbereiding op het grote aantal unc-119 (ED3) wormen voor de procedure 20 genereren. Elke transformatie vereiste 20 ei platen voor het aantal wormen nodig. Met behulp axenische mCeHR vloeibare cultuur maakt een efficiëntere groei en vervolgens meer wormen voor bombardementen. Bovendien kan bombardementen worden gebruikt in combinatie met drugs selectie om te voorkomen dat het gebruik van UNC-119 (ED3) wormen 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren er geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of HealthGrants DK85035 en DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
