Summary
C. elegans är oftast odlas på fasta agarplattor eller i flytande kulturer ympats med E. coli. För att förhindra bakteriella biprodukter från confounding toxikologiska och näringsmässiga undersökningar, utnyttjade vi en axenisk flytande medium, CeHR, att växa och synkronisera ett stort antal maskar för en rad tillämpningar i efterföljande led.
Abstract
I detta protokoll, presenterar vi material som krävs, och förfarandet för att göra modifierat C. E legans tillvänjning och reproduktions media (mCeHR). Dessutom stegen för att exponera och acklimatisera C. elegans odlas på E. coli för att axenisk flytande medier beskrivs. Slutligen, nedströms experiment som utnyttjar axenisk C. elegans illustrera fördelarna med detta förfarande. Förmågan att analysera och bestämma C. elegans näringsbehov illustrerades av växande N2 vildtyp maskar i axeniska flytande medier med varierande heme koncentrationer. Denna procedur kan upprepas med andra näringsämnen för att bestämma den optimala koncentrationen för mask tillväxt och utveckling, eller, för att fastställa de toxikologiska effekterna av läkemedelsbehandlingar. Effekterna av varierande heme koncentrationer på tillväxten av vildtyp maskar bestämdes genom kvalitativ mikroskopisk observation och genom att kvantifiera tHan antal maskar som växte i varje hem-koncentration. Dessutom kan effekten av olika koncentrationer av näringsämnen analyseras genom utnyttjande av maskar som uttrycker fluorescerande sensorer som reagerar på förändringar i närings av intresse. Dessutom är ett stort antal maskar var lätt produceras för alstring av transgena C. elegans med användning av mikropartikelbombardemang.
Introduction
Jorden nematoden, Caenorhabditis elegans, är en kraftfull modell organism som används i ett flertal studier från genetik till toxikologi. Som ett resultat av dess 1 mm storlek, snabba generationstiden av fyra dagar, enkel odling, och stora avkommevirioner siffror har dessa nematoder utnyttjats i ett antal genetiska och farmakologiska skärmarna 1, 2. Forskarna utnyttjar denna mask för att identifiera molekyler och vägar bevarade i ryggradsdjur system. Dessa vägar innefattar celldödssignaler, vägar av åldrande och metabolism och nervsystemet 3-6. Dessutom insyn i C. elegans möjliggör generering av transgena linjer med användning av fluorescerande protein reportrar, som direkt kan visualiseras för att analysera genuttryck mönster och proteinlokalisering.
I många studier denna nematod odlas på ett fast agar-baserad ytan med nematod tillväxtmedium (NGM) plattor eller liquid kulturer seedade med Escherichia coli som en näringskälla 7,8. Dessa bakterie födokällor kan förbrylla biokemiska och toxikologiska studier med störningar från bakteriella biprodukter som påverkar tolkningen av resultaten. För att undvika dessa sammansatta effekterna, C. elegans kan odlas i en axeniska flytande media som saknar bakterier som en näringskälla. Med hjälp av detta medium, vi framgångsrikt odlas miljontals starkt synkroniserade maskar för många standard C. elegans protokoll inklusive microarray analys av differentiellt reglerade gener i C. elegans utsatta för olika heme koncentrationer, och produktion av transgena maskar som använder genen bombardemang. Detta media är kemiskt definierade och ändras från ett original recept formulerades av Dr Eric Clegg 9. Med hjälp av denna mCeHR media, har vi lyckats identifiera gener som är involverade i heme homeostas, kallas heme känsliga gener (HRG s) 10, vilket skullehar inte varit möjligt i vanliga tillväxtbetingelser, vilka utnyttjar NGM agarplattor ympade med E. coli.
I detta protokoll beskriver vi förfarandet för att införa och upprätthålla C. elegans odlas på E. coli till axenisk mCeHR och använda denna metod för att erhålla ett stort antal maskar för att producera transgena C. elegans linjer med mikropartikelbombardemang. Vi presenterar också studier som visar nyttan av att använda axeniska medier för att bestämma näringsmässiga krav på C. elegans med hjälp av heme som exempel. Dessa studier visar att användning av mCeHR media möjliggör snabb tillväxt av ett stort antal C. elegans för många nedströms applikationer som används av snäck forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Worm Stammar
- Erhåll C. elegans vildtyp Bristol N2 stammar från Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) och hålla dem på NGM plattor ympats med E. coli stam OP50 7. OBS: Transgena mask stammar IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utnyttjad genererades som tidigare beskrivits 11. IQ6011 kan begäras från motsvarande författare.
2. Beredning av modifierad C. elegans Habitation och Reproduktion Medium (mCeHR)
Förbered mCeHR flytande media enligt nedan 12. Denna axenisk flytande media gör maskarna att växa utan några extra mat källor. Utför alla manipulationer av axeniska flytande media och axeniska maskar som använder strikt sterila förhållanden såsom ett laminärt flöde huva.
- Skaffa ultra pastöriserad fettfri mjölk från en livsmedelsbutik. Använd den kylda prokanalen och inte produkten rumstemperatur. Före användning i mCeHR medium, strimma mjölken på Brain Heart Infusion (BHI)-agar-plattor och inkubera under 3 dagar vid 30 ° C och 37 ° C för att kontrollera med avseende på sterilitet. Överför mjölken till 50 ml sterila rör och förvaras vid -80 ° C
- Förbered varje av följande komponenter och kombinera i ordning och belopp som anges för att bereda 1 liter mCeHR (tabell 1A): 10 ml 2 mM kolin disyra citrat, 10 ml av vitamin-och tillväxtfaktor mix (se recept i tabell 1B), 10 ml av 2,4 mM myo-inositol, 10 ml av 2 mM hemin klorid, 250 ml avjoniserat vatten. Applicera sug och filtrera genom ett 0,22 | im filterenhet.
- Tillsätt 20 ml nukleinsyra mix (recept i tabell 1C), 100 ml mineralblandning (recept i Tabell 1D), 20 ml av 170 mg / ml laktalbuminhydrolysat, 20 ml av essentiella aminosyror, 10 ml av icke-essentiella aminosyror syror, 20 ml 450 mM KH 2 PO 4,50 ml av 1,45 M D-glukos, 10 ml av 1 M HEPES, natriumsalt, 250 ml avjoniserat vatten.
- Applicera sug för att filtrera sterilisera komponenterna. Ta bort filtret och tillsätt 1 ml 5 mg / ml kolesterol. Säkerställ att pH hos mediet är ca 6-6,5. Anmärkning: Denna lösning kan förvaras vid -80 ° C i upp till ett år.
- Lägg till 20% (volym / volym) ultra pastöriserad organiskt skummjölk till mCeHR mediet före användning. Använd noggrant steril teknik (till exempel i en huv med laminärt flöde) vid öppning och alikvotering mjölken. Förvara medier vid 4 ° C.
3. Förbered C. elegans för kultur i axenisk mCeHR Liquid Medium
- Odla maskar på tio 60 mm NGM plattor tills det finns många gravida maskar och en minimal mängd av OP50 E. coli på plattorna.
- Avlägsna maskarna från varje platta genom sköljning med 5 ml av M9-buffert (recept i tabell 1 F), och kombinera i ett 50 ml koniskt rör.
- Låt maskarna till settle genom att lämna röret stå under 5 till 10 min därefter försiktigt avlägsna supernatanten innehållande E. coli.
- Upprepa steg 3,2 och 3,3 2x att avlägsna så mycket av de kvarvarande bakterier som möjligt innan den fortsätter förfarandet.
- Resuspendera maskar i 0,1 N NaCl i en volym som är en multipel av tre, till exempel 1,5 ml, 3 ml eller 6 ml i vilka enskilda maskar kan ses i röret.
- Bleach maskarna genom tillsats av 5 N NaOH och 5% natriumhypoklorit (blekmedel) lösning i en 01:02:06 förhållande till snäckskruven suspensionen. Till exempel, en ml 5 N NaOH: 2 ml 5% natriumhypoklorit: 6 ml av snäck suspension. Blanda NaOH och blekmedel före tillsats till snäck suspensionen.
- Vortex lösningen kraftigt tills den gravida maskar upplöses och bara ägg är synliga i suspensionen (ca 5-10 min). Övervaka processen med hjälp av ett faskontrastmikroskop med en 10X mål.
- Efter odlingen fullständigt upplöst, omedelbart pelleteraägg vid 800 x g under 45 sek vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 10 ml sterilt vatten genom centrifugering av pelleten vid 800 x g under 45 sek vid 4 ° C.
- Efter blekning överföra ägget pelleten i ett 25 cm 2 vävnadsodlingskolv innehållande 10 ml av mCeHR medium kompletterat med 100 | ig / ml tetracyklin. Genomför denna procedur med sterila tekniker. Om du vill lägga till ytterligare antibiotika, däribland 250 mikrogram / ml nalidixinsyra, för att förhindra bakterietillväxt i axeniska flytande kulturer.
- Inkubera flytande kulturer vid 20 ° C på en skakinkubator vid ca 70 rpm.
- Kontrollera maskarna dagligen att notera utvecklingsstadium och tillväxttakten.
OBS: Maskar kommer inledningsvis växer långsamt och kräver 7 till 10 dagar för att bli gravid. Men eftersom maskarna acklimatiseras till det flytande mediet generering tiden kommer att minska till cirka 4 dagar för vildtyp (N2) maskar. - När maskarna har utvecklats till en dräktig fas i flytande form, överföra snäck kulturen till en konisk tub och pelle maskarna vid 800 xg under 5 min vid 4 ° C med användning av en svängrotor.
- Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera masken pelleten i en lika volym av 0,1 M NaCl. Använd till exempel 10 ml 0,1 M NaCl för maskar odlas i 10 ml mCeHR. Låt maskarna att nöja sig med 5 minuter på is.
- Utför blekningsförfarandet som beskrivits ovan i steg från 3,5 till 3,8, och låta maskarna att växa för en andra generation i axeniska flytande media. Om det behövs, tillsätt antibiotika igen för att förhindra bakterietillväxt.
- Återigen tillåter maskarna att bli gravid sedan pellets och suspendera maskar i 0,1 M NaCl som beskrivs i steg 3.12 och 3.13, sedan bleka igen enligt beskrivningen i steg från 3,5 till 3,8, för att producera en synkroniserad population. Väx L1-larver maskar i flytande medium utan antibiotika från och med nu.
4. Synkronisera Worms från LiquidKultur
- Pellet och suspendera maskar i 0,1 M NaCl, såsom beskrivits ovan i steg 3,12 och 3,13. Blekmedel såsom beskrivits ovan i steg från 3,5 till 3,8.
- Resuspendera ägg pelleten i 10 ml M9-buffert och låta larver kläcks O / N vid 20 ° C på en roterande plattform skakapparat. OBS: Äggen kläcks i L1 larver, men kommer inte att utvecklas vidare, synkronisering maskarna på L1 scenen.
- För att bibehålla och subkultur maskar, pellets L1 larver vid 800 xg under 5 minuter, sedan suspendera larver i 10 ml mCeHR och överföring till en 25 cm 2-kolv. Tillåt maskarna att växa vid 20 ° C på en roterande plattform. Upprätthålla en maximal densitet på 3.000 maskar / ml / cm 2 för att säkerställa tillräcklig näring för maskarna.
OBS: I detta skede är antibiotika inte behövs för att upprätthålla axeniska förhållanden när förfarandena utförs med sterila tekniker i ett laminärt flöde huva. Maskar bör kontrolleras dagligen för att övervaka tillväxten.
5. Gratiszing och upptining Worms för axenisk Medium kulturer
- Freeze axeniska asynkrona snäck kulturer eller synkroniserad L1 larver i flytande kväve. Pellets maskar vid 800 xg under 5 minuter resuspendera sedan i S-buffert (6,45 mM KHPO 4, 43.55 mM KHPO 4, 146.25 mM NaCl) med 0,5 ml för varje flaska. Tillsätt en lika volym av S-buffert med 30% volym / volym glycerol till varje flaska och överföra maskar till -80 ° C innan långtidslagring i flytande N2. Frys ca 1 x 10 6 maskar per ml i varje flaska.
- Tina maskar genom inkubering av rören vid 37 ° C under ca 2 min tills nästan all isen har smält. I ett dragskåp med laminärt flöde, överföra maskar till en steril flaska innehållande mCeHR och placera dem vid 20 ° C.
6. Bestämma effekten av Hemin Koncentration på tillväxt och reproduktion i mCeHR
- Använd axeniska mCeHR media för att analysera näringsberoende tillväxt av C. elegans. För att bestämma effekten of hemin koncentration på masken tillväxt och utveckling, använder synkroniserade axeniska N2 maskar eller andra stammar av intresse. Synkronisera L1 larver som beskrivs ovan i avsnitt 4.
- På den följande dagen, pellets och räkna synkroniserade L1 larver och späd till 1 mask per il axeniska medier. Gör 10 mM hemin-klorid i 0,3 M NH4OH och justera till pH 8 med användning av koncentrerad HCl.
- Addera 800 pl av mCeHR media till en 24-brunnsplatta. Lägg 100 maskar till varje brunn i 100 | il medium. Lägg hemin klorid till varje brunn i koncentrationer som sträcker sig från 0 pM, 1,5 pM till 1000 pM i triplikat. Säkerställ att alla brunnar innehåller samma koncentration av 0,3 M NH4OH. Resuspenderas försiktigt maskarna innan pipettering att 100 L1 larver till varje brunn.
- Undersök maskarna dagligen och notera tillväxten i varje koncentration i varje brunn. Räkna antalet maskar efter 9 dagars inkubering och plotta antalet maskar / ml motsvarande varje hemekoncentration (figur 1).
7. Effekt av Hemin Koncentration på Heme Sensor Worms
- Inkubera synkroniserade L1 heme sensor maskar (Phrg-1 :: GFP) i mCeHR innehållande 4 ^ M, 8 ^ M, 10 ^ M och 20 mikroM hemin.
- Image maskarna som använder fluorescens konfokalmikroskopi, 48 h efter inkubation (figur 2).
8. Använda mCeHR att generera Transgena C. elegans Använda mikropartikelbombardemang
OBS: Förfarandet för att generera och genomföra mikropartikelbeskjutning genom att använda UNC-119 (ED3) maskar som odlas i mCeHR beskrivs i figur 3 13.
- Worm Framställning
- Överför ca 1 x 10 6 asynkrona UNC-119 (ED3) maskar i 90 ml mCeHR media i en 175 cm 2-kolv en vecka före bombardemang. Tillåt maskarna att växa vid 20 ° C ona skaka plattform vid ~ 70 rpm (Figur 3-1).
OBS: En vecka senare, bör masken tätheten vara betydligt större med många vuxna gravida maskar. Cirka 3 x 10 7 maskar kommer att krävas för mikropartikelbeskjutning. - Chill JM109 E. coli seedad 10 cm NGM plattor på is.
- Överför axeniska maskar till två 50 ml koniska rör och centrifugera maskarna vid 800 x g under 2 min. Aspirera supernatanten och resuspendera maskar i varje rör i 50 ml M9-buffert (Figur 3-2).
- Låt vuxna maskar för att pelletera genom tyngdkraften under 10 till 15 min på is.
Anmärkning: 2 ml pellets bör nu innehålla> 90% vuxna maskar. Detta 2 ml pellet bör ha ca 5 x 10 6 maskar och räcker till en mikropartikelbombardemang. - Coat hela ytan av den kylda JM109 ympades NGM plattan med 2 ml pellet av maskar. Låt vätskan vara helt absorberad lämna sedan plattani 30 minuter på is innan du fortsätter (Figur 3-3).
- Överför ca 1 x 10 6 asynkrona UNC-119 (ED3) maskar i 90 ml mCeHR media i en 175 cm 2-kolv en vecka före bombardemang. Tillåt maskarna att växa vid 20 ° C ona skaka plattform vid ~ 70 rpm (Figur 3-1).
- Beredning av guldpartiklar
- Väg 30 mg guldpartiklar i ett silikon mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml 70% etanol och vortexblanda röret i 5 min.
- Låt röret stå under 15 minuter, därefter centrifugera vid 6000 x g under 10 sek för att pelleguldpartiklarna. Avlägsna supernatanten med användning av en pipettspets genom att försiktigt röra spetsen till sidan av röret mittemot guldpartiklarna.
- Tvätta guldpartiklar med en ml sterilt vatten, vortex under 1 min och centrifugera kort röret vid 6000 x g under 10 sek. Upprepa tvättsteg två gånger och sedan återsuspendera de guldpartiklar i 0,5 ml steril 50% glycerol.
Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av guldpartiklarna kommer att vara 60 mg / ml och det kan lagras under 1 till 2 månader vid 4 ° C.
- Förbered mixen DNA-guldpartikel
- Kombinera 10 pg av det önskade plasmid-DNA med 10 &# 956; g av UNC-119 räddnings plasmiden i en silikoniserad 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 50 | il avjoniserat vatten och 100 | il väl återsuspenderades guldpartikel lösning sedan vortex under 1 min.
- Addera 150 pl av 2,5 M CaCl2 och vortexblanda lösning igen under 1 min. Till denna lösning, tillsätt 60 ul av 0,1 M spermidin och vortexa i 3-5 min.
- Puls centrifugera lösningen vid 6000 x g under 10 sek, avlägsna supernatanten och tillsätt 300 | il av 70% etanol. Vortex väl under 1 min, puls centrifug vid 6000 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 170 | il 100% etanol. Med kraft vortexblanda lösningen under 5 till 10 min puls centrifugera och avlägsna supernatanten.
- Beskjutning (Figur 3-3)
OBS: Detta protokoll utförs med partikelleveranssystem som anges i tabellen för material / utrustning. Följ instruktionerna för partikelleverans instrument tillgängliga.- <li> Placera ett ark av silkespapper i en 15 cm platta. Med hjälp av en pincett, doppa sju macrocarriers individuellt i 100% etanol och lägg dem på vävnaden torka.
- Rengör biolistiska kammare, macrocarrier hållare, och måltavla med 70% etanol. Rengör och autoklavera stoppskärmar före varje bombardemang förfarande.
- Ladda macrocarrriers i hållaren med hjälp av pincett och tryck i hållaren med hjälp av sittverktyget.
- Jämnt fördelade 20 pl av DNA-belagda guldpartiklar i centrum av varje macrocarrier och sedan låta lösningen torka helt.
- Rengör de två delarna av tryckdelaren med etanol och montera med etanol rengjorda brott diskar. Skruva fast monterade tryckavdelare och brott diskar i bombardemanget kammaren.
- Montera en autoklav stopp skärm med macrocarrier hållaren och placera apparaten på att metallhyllan krävs och lås på plats.
- För in det monterade macrocarrier apparat i biolistiska kammaren i den tilldelade kortplatsen under trycket delaren och justera med tryckavdelare.
- Tejpa den öppna NGM tallrik med maskarna på måltavlan hyllan och stäng dörren till kammaren.
- För att bombardera maskar, justera trycket till det som behövs för att bryta brott diskar. Slå på vakuum till 28 inches Hg tryck, tryck sedan elden knappen tills diskarna brista.
- Släpp vakuumet och avlägsna NGM plattan från apparaten. Tvätta maskar från plattan och omfördela i tjugo 10 cm NGM plattor ympats med JM109 E. coli (Figur 3-4).
- Tillåt maskarna växa under 10 till 14 dagar vid 25 ° C och svälta plattorna. Worms räddade från UNC-119 fel har normal rörlighet och kan identifieras vid denna tidpunkt. Välj minst 10 "vildtyp" maskar från separata plattor för vidare analys som dessa representerar oberoende transgena linjer (Figure 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odling av C. elegans i axeniska flytande medel hjälpmedel i fastställandet av näringsämnen som krävs av maskar, utan inblandning från sekundära metaboliter som produceras av E. coli. Vildtyp N2 maskar acklimatiseras till mCeHR media inom tre generationer och visar tillväxt jämförbar med maskar som odlas på NGM bakterieplattor. Faktum är att dessa maskar blir gravid inom 4 dagar jämfört med 3,5 dagar för maskar som odlas på OP50 bakterier.
En fördel med att använda mCeHR sågs i studier som undersökt den exakta krav näringsämnen av dessa maskar 14. I figur 1 maskar odlades i mCeHR kompletterat med ökande mängder av heme, upp till 1 mM. Observationer av dessa maskar visade en tydlig fördröjning av tillväxten hos heme koncentrationer under 4 ^ M, med maskar utvecklas till L4 larvstadiet, men oförmögen att gå vidare till gravid scenen efter nio dagar i mCeHR. Vid koncentrationer av 10 jiM och 2056, M heme maskarna utvecklas till en dräktig steget i 4 dagar och producera stort antal avkommor. Maximalt antal avkomma sågs när maskarna odlades i mCeHR innehållande 20 ^ M heme. Worms fortsatt att utveckla och producera avkomma vid 100 ^ M och 500 mikroM heme. Men antalet larver avkomma minskat betydligt i jämförelse med maskar som odlas på den optimala heme koncentrationen av 20 mikroM heme. Heme koncentrationer på eller över 800 iM ledde förkrympta, sjukliga maskar på L3 larvstadiet, vilket indikerade att dessa heme koncentrationerna giftigt för maskarna.
Förutom att bestämma den optimala heme koncentrationen och effekten av heme deprivation och heme toxicitet på C. elegans tillväxt kunde heme reporterstammar utnyttjas för att indirekt bedöma heme status av masken inom en mindre koncentrationsområde. Den IQ6011 mask är en transgen mask som uttrycker en heme lyhörd transkriptions reporter, P HRG-1 figur 2. Är GFP-uttryck undertryckt vid 20 | iM heme och ökar då heme koncentration minskas. De stegvisa förändringar i heme koncentrationen noggrant kan korreleras med gen respons och uttryck i mCeHR media.
Förutom att kunna noggrant kontrollera halter av näringsämnen som till masken, gör mCeHR axenisk media för effektiv tillväxt av ett stort antal synkroniserade maskar. Denna funktion kan utnyttjas för mikropartikelbombardemang (Figur 3). Med hjälp av denna procedur minst en integrerad linje har utvecklats från varje mikropartikelbeskjutning genomförts (tabell 2).
Figur 1. C. elegans heme tillväxtkurva. Worms odlades i ett intervall av heme koncentrationer från 0 pM till 1000 pM i mCeHR för nio dagar. Antalet maskar i varje koncentration räknades och plottades. Vid 1,5 ^ M heme koncentrationer maskar var L4 och oförmögna att vidareutveckla. Vid 800 ^ M heme maskarna var hämmad vid L2-L3 stadier och visade effekter av heme toxicitet.
Figur 2. Svar av heme-sensor (Phrg-1 :: GFP) stam till olika hem-koncentrationer i mCeHR. Synkroniserad transgen C. elegans uttrycker HRG-1 :: GFP odlades i mCeHR medium kompletterat med 4, 8, 10 eller 20 | iM heme för 48 timmar. Bilder tagna med en Zeiss LSM 710 confocal mikroskop. Skala bar är 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schematisk bild av mikropartikelbeskjutning i C. elegans med hjälp av UNC-119 maskar odlas i mCeHR. (1) Ungefär 3 x 10 7 UNC-119 (ED3) maskar odlas i 90 ml mCeHR media. (2) Gravids fick sedimentera på is under 10-15 minuter i 50 ml koniska rör. (3) En 2 ml pellet av ca 5 x 10 6 gravida maskar spreds jämnt på en unseeded NGM tallrik. Maskarna bombarderades med 12 pg av plasmiden av intresse och 6 pg av UNC-119 räddnings plasmid komplex till guldpartiklar. (4) THan bombarderade maskar delades på tjugo 10 cm plattor ympats med E. coli-stam JM109. (5) Efter två veckors inkubering vid 25 ° C och plattor med vildtyp maskar valdes ut för analys av transgen expression styrka och segregationshastigheter.
| Tabell 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| Med användning av steril teknik och en 1 L (0,22 | im) vakuumfilterenhet, välja följande volymer av stamlösningar och vatten i den ordning som beskrivs. | |
| Kolin disyra citrat | 10 ml |
| Vitamin-och tillväxtfaktor mix | 10 ml |
| myo-inositol | 10 ml |
| Hemin klorid | 10 ml |
| Avjoniserat vatten | 250 ml |
| Nukleinsyra mix | 20 ml |
| Mineralblandning | 100 ml |
| Laktalbuminhydrolysat | 20 ml |
| Essential Amino Acid Mix | 20 ml |
| Icke-essentiella aminosyran Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-glukos | 50 ml |
| HEPES, natriumsalt | 10 ml |
| Avjoniserat vatten | 250 ml |
| Volymen blir 800 ml vid denna punkt Avlägsna filterenheten ur vakuum sedan lägga till: | |
| Kolesterol | 1 ml |
| Ultra-pastöriserad skummjölk | 200 ml |
| Tabell 1B | |
| Vitamin-och tillväxtfaktor mix, 100 ml | |
| Lösning 1: Till 60 ml vatten add: | |
| N-acetyl-α-D-glukosamin | 0,15 g |
| DL-alanin | 0,15 g |
| Nikotinamid | 0,075 g |
| D-pantetin | 0,0375 g |
| DL-pantotensyra, hemikalciumsalt | 0,075 g |
| Folsyra | 0,075 g |
| Pyridoxamin-2HCl | 0,0375 g |
| Pyridoxin HCl | 0,075 g |
| Flavinmononukleotid, natriumsalt | 0,075 g |
| Tiamin-hydroklorid | 0,075 g |
| Lösning 2: Förbered följande kemikalier i 5 ml 1 N KOH: | |
| p-aminobensoesyra | 0,075 g |
| D-biotin | 0,0375 g |
| Cyanokobalamin (B12) | 0,0375 g |
| Folinsyra, kalciumsalt | 0,0375 g |
| Nikotinsyra | 0,075 g |
| Pyridoxal 5-fosfat | 0,0375 g |
| Lösning 3: 0,0375 g (±)-α-L-liponsyra, oxiderad form i 1 ml etanol: | |
| Kombinera lösningarna 1, 2 och 3 och bringa den slutliga volymen till 100 ml. Förvaras i mörker vid 4 ° C eller frys alikvoter vid -20 ° C. Gör små volymer av bestånd för denna blandning så det används snabbt. | |
| Tabell 1C | |
| Nukleinsyra mix, 100 ml | |
| Till 60 ml vatten add: | |
| Adenosin 5'-monofosfat, natriumsalt | 1,74 g |
| Cytidin 5 '-fosfat | 1,84 g |
| Guanosin 2 "- och 3"-monofosfat | 1,82 g |
| ELLER | |
| Guanosin 5 '-fosfat | 2,04 g |
| Uridin-5 '-fosfat, dinatriumsalt | 1,84 g |
| Tymin (lägg till sist) | 0,63 g |
| Ta lösning till 100 ml och lagra i mörker vid 4 ° C eller frys alikvoter vid -20 ° C. Gör små volymer av bestånd för denna blandning så det används snabbt. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl2 • 6 H2O | 4,1 g |
| Natriumcitrat | 2,9 g |
| Kaliumcitrat monohydrat | 4,9 g |
| CUCI2 • 2 H2O | 0,07 g |
| MnCl2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl2 | 0,1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 • 6 H2O | 0,6 g |
| CaCl2 • 2 H2O (alltid lägga till sist) | 0,2 g |
| Gör små volymer av bestånd för denna blandning så det används snabbt. | |
| Andra komponenter | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Kolin-di-syra-citrat | 2 mM |
| myo-inositol | 2,4 mM |
| D-glukos | 1,45 M |
| Hemin klorid | 2 mM i 0,1 N NaOH pH 8,0 |
| HEPES, natriumsalt | 1 M stamlösning |
| Kolesterol | 5 mg / ml i etanol |
| Laktalbumin enzymatiska hydrolysat | 170 mg / ml |
| Tabell 1F | |
| M9 buffert, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H2O | 1 L |
| Autoklavera 30 min | |
| 1 M MgSO 4 (steril) | 1 ml |
Tabell 1. Recept för komponenter i mCeHR och mCeHR.
| Bombardment | Linjer med vildtyp räddning | Rader med räddning / transgen | Stabila linjer |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Genomsnitt | 4,8 | 3,2 | 1 |
Tabell 2. AveraGE antal transgena C. elegans genereras med hjälp av mikropartikelbombardemang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll presenterar vi en modifierad axenisk flytande media mCeHR som möjliggör snabb C. elegans generation med produktionen av ett stort antal maskar. Detta media visar flera fördelar eftersom maskarna odlas utan att förorena E. coli eller bakteriella biprodukter och kan utnyttjas i näringsmässiga och toxikologiska studier. Användningen av E. coli eller andra bakterier i sådana studier har flera nackdelar. Till exempel, kan tillväxten av bakterier förändras under olika förhållanden och bakterierna kan metabolisera molekyler som håller på att analyseras, confounding tolkningen av resultaten. Därför är utvecklingen av ett definierat medium för att utföra dessa studier mycket fördelaktig.
Trots att C. elegans har odlats i flytande media i tidigare studier 15, maskar odlas i C. elegans underhåll medium (Cemm) visar en tydlig fördröjning i generationstider 16, till skillnad från vad vi observe i mCeHR medium. Vårt huvudsakliga mål var att utnyttja C. elegans att studera närings homeostas med särskild tonvikt på heme och metall ämnesomsättning. Med detta i åtanke, mCeHR och modifieringar som genereras av vår grupp uppnå detta mål och har direkt lett till identifiering av ett antal gener som krävs för att upprätthålla hem-homeostas i masken och slutligen i ryggradsdjur modellsystem 17, 18. Omformulerade mCeHR-1 media kan också utnyttjas för andra nematodarter inklusive Panagrellus Redivivus, Oscheius myriophila och C. remanei. Dessutom låg metallformuleringar mCeHR-2 och mCeHR-3 kan utnyttjas i studier som undersökt toxicitet tungmetall och krav 12.
Före acklimatisering, N2 maskar uppvisar en längre generationstid på ca 7 till 10 dagar i mCeHR media. Eftersom maskarna subodlas, minskar denna generation tid till 4 dagar, som liknar maskar odlas på OP50 bakterier. Emellertid kan den generationstid vara längre för vissa muterade maskar, rimligen på grund av brister i utfodring, rörelse, eller särskilda näringsbehov.
Vid användning axeniska flytande medier är det viktigt att kräsna sterila tekniker utnyttjas. Vanligtvis är användningen av antibiotika minimeras och så småningom elimineras som maskarna acklimatiseras till mediet och de kvarvarande bakterier elimineras. Antibiotika initialt för att säkerställa att kulturerna är axenisk när etablerad som den förhindrar tillväxten av kvarvarande bakterier som kan överväldiga masken kulturer. Efter två på varandra följande rundor av blekning, är antibiotika utelämnats från de kulturer som kontinuerlig användning av antibiotika bara masker dåliga aseptiska tekniker som är nödvändiga för att odla maskar axeniskt. Med hjälp av dessa tekniker i ett laminärt flöde skåp, har författarna kunnat växa maskarna axeniskt utan kontaminering. Dessutom, korrekt lagring av MEDia och delar är nödvändig för mask underhåll och tillväxt. Maskarna bör kontrolleras för tillväxttakten och subkultiveras för att undvika trängsel, vilket kan leda till dauer bildning som viktiga näringsämnen är uttömda. Detta kan förhindras genom att säkerställa att tätheten av maskar inte överstiger 3000 maskar / ml / cm 2. Forskare som är nya att växa C. elegans axeniskt kan uppnå detta genom att kontrollera maskarna dagligen och räkna maskarna i veckan.
C. elegans forskare utnyttja dess transparenta egenskaper genom att generera transgena maskarna uttrycker fluorescerande-märkta markörer som möjliggör visualisering av genuttryck och proteinlokalisering. Använda biolistisk bombardemang tillåtet för generering av låga kopierings integranter som undvek frågor om extrakromosomala arrayer och förhöjt genuttryck noterade med transgena genereras med hjälp av injektion 19. Tidigare har en nackdel av att generera transgena användamikropartikelbeskjutning av C. elegans var kravet för ägg plattan förberedelse för att generera stora antal av unc-119 (ED3) maskar som är nödvändiga för proceduren 20. Varje omvandling krävs 20 ägg plattor för antalet maskar som behövs. Använda axenisk mCeHR flytande kultur tillåter mer effektiv tillväxt och därefter fler maskar för bombningarna. Dessutom kan beskjutningar användas tillsammans med läkemedelsselektion för att undvika användning av unc-119 (ED3) maskar 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande ekonomiska intressen eller intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of HealthGrants DK85035 och DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
