Summary
סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.
Abstract
בפרוטוקול זה, אנו מציגים את החומרים דרושים, ואת ההליך להכנת C שונה. Legans דואר מדיה הרגלה והרבייה (mCeHR). בנוסף, הצעדים לחשיפה והתאקלמות ג elegans גדל על E. coli לaxenic תקשורת נוזלית מתוארים. לבסוף, ניסויים במורד הזרם לנצל ג axenic elegans להמחיש את היתרונות של הליך זה. היכולת לנתח ולקבוע ג הדרישה התזונתית elegans שהומחש על ידי גידול תולעים מסוג בר N2 בתקשורת נוזלית axenic עם ריכוזי heme שונים. הליך זה יכול להיות משוכפל עם חומרים מזינים אחרים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לצמיחה והתפתחות או תולעת, כדי לקבוע את השפעות טוקסיקולוגי של טיפולים תרופתיים. ההשפעות של ריכוזי heme מגוונים על הצמיחה של תולעים מסוג בר נקבעו באמצעות תצפית מיקרוסקופית איכותית ועל ידי quantitating tהוא מספר התולעים שגדלו בכל ריכוז heme. בנוסף, ההשפעה של ריכוזים תזונתיים מגוונים ניתן assayed ידי ניצול תולעים המבטאים חיישני ניאון שמגיבים לשינויים בתזונתיים של עניין. יתרה מזאת, מספר גדול של תולעים יוצרו בקלות עבור הדור של elegans המהונדס ג באמצעות הפגזת microparticle.
Introduction
נמטודות הקרקע, elegans Caenorhabditis, הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במחקרים רבים מתחום הגנטיקה לטוקסיקולוגיה. כתוצאה מגודלו 1 מ"מ, זמן דור המהיר של ארבעה ימים, קל טיפוח, ומספרי צאצאים גדולים, נמטודות אלה כבר נוצלו במספר מסכי גנטיים תרופתיים 1, 2. חוקרים לנצל את תולעת זה כדי לזהות מולקולות ומסלולים נשמרים במערכות בעלי חוליות. מסלולים אלה כוללים אותות מוות של תאים, מסלולים של הזדקנות ואת חילוף חומרים, ואת מערכת העצבים 3-6. בנוסף, השקיפות של ג elegans מאפשר לדור של קווים מהונדסים באמצעות כתבי חלבון פלואורסצנטי, אשר ניתן דמיינו ישירות לנתח דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון.
במחקרים רבים נמטודות זה תרבית על משטח המבוסס על אגר מוצק באמצעות מדיום גידול נמטודות צלחות (NGM) או בליטרתרבויות iquid זרע עם Escherichia coli כמקור מזון 7,8. מקורות מזון של חיידקים אלה יכולים לבלבל את מחקרים ביוכימיים ורעלים עם הפרעות מחיידקי תוצרי המשפיעים על הפרשנות של תוצאות. על מנת להימנע מתופעות הרכבה אלה, ג יכול להיות מתורבת elegans בתקשורת נוזלית axenic כי הוא נטול חיידקים כמקור מזון. שימוש בתקשורת זו, אנו תרבית בהצלחה מיליוני תולעים מסונכרנים היטב עבור רבים ג הסטנדרטי פרוטוקולי elegans כולל ניתוח microarray של גנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי בג elegans נחשף לריכוזי heme שונים, וייצור של תולעים מהונדסים באמצעות הפגזת גן. מדיה זו הגדרה כימית ושונה ממתכון מקורי שגובש על ידי ד"ר אריק קלג 9. השימוש במדים mCeHR זה, זיהינו בהצלחה את הגנים מעורבים בהומאוסטזיס heme, המכונה גנים כheme מגיבים (HRG ים) 10, שהייתלא היה אפשרי בתנאי גידול רגילים אשר מנצלים צלחות אגר NGM seeded עם א ' coli.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההליך להחדרה ושמירה על ג elegans גדל על E. coli לmCeHR axenic ולנצל בשיטה זו כדי לקבל מספר גדול של תולעים לייצור ג המהונדס קווי elegans באמצעות הפגזת microparticle. אנחנו גם לימודים הנוכחיים המציגים את התועלת של שימוש במדים axenic לקביעת הדרישה התזונתית של ג elegans באמצעות heme לדוגמא ירושלים. מחקרים אלה מראים כי השימוש במדים mCeHR מאפשר צמיחה מהירה של מספר גדול של ג elegans עבור יישומים במורד הזרם רבים מנוצלים על ידי חוקרי תולעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זני תולעת
- השג ג elegans wildtype זני בריסטול N2 ממרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) ולשמור אותם על צלחות NGM seeded עם א ' OP50 זן חיידק 7. הערה: תולעת מהונדס זני IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) מנוצל נוצרו כמתואר 11 בעבר. ניתן לבקש IQ6011 מן המחבר המתאים.
2. הכנת ג השתנה elegans מגורים ורבייה בינוני (mCeHR)
הכן תקשורת נוזלית mCeHR כמתואר להלן 12. תקשורת נוזלית axenic זה מאפשרת לגדל התולעים ללא כל מקורות מזון נוספים. לבצע את כל המניפולציות של תקשורת axenic נוזלית ותולעי axenic באמצעות תנאים סטריליים לחלוטין כגון זרימה למינרית.
- השג חלב ללא שומן מפוסטר אולטרה ממכולת. השתמש בפרו בקירורדביק ולא את המוצר בטמפרטורת החדר. לפני שימוש בmCeHR בינוני, פס חלב על מוח לב עירוי (BHI) אגר צלחות דגירה במשך 3 ימים ב30 מעלות צלזיוס ו37 ° C כדי לבדוק על סטריליות. מעביר את חלב ל50 צינורות מ"ל ולאחסן סטרילי ב -80 ° C
- הכן את כל אחד מהמרכיבים הבאים ולשלב בהוראה ובסכומים שניתן להכין 1 ליטר של mCeHR (לוח 1 א): 10 מיליליטר של 2 ציטראט diacid כולין מ"מ, 10 מיליליטר של ויטמין ותמהיל גורם גדילה (ראה מתכון בטבלה 1 ב '), 10 מיליליטר של 2.4 מיו-אינוסיטול מ"מ, 10 מיליליטר של 2 כלוריד hemin מ"מ, 250 מיליליטר של מים deionized. החל יניקה וסינון באמצעות יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר.
- הוסף 20 מיליליטר של תערובת חומצות גרעין (מתכון בטבלה 1 ג), של תערובת מינרלים 100 מיליליטר (מתכון בטבלה 1D), 20 מיליליטר של 170 מ"ג / מיליליטר lactalbumin hydrolyzate, 20 מיליליטר של חומצות אמינו חיוניות, 10 מיליליטר של אמינו לא חיוני חומצות, 20 מיליליטר של 450 מ"מ KH 2 PO 4,50 מיליליטר של 1.45 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 1 M HEPES, מלח נתרן, 250 מיליליטר מים deionized.
- החל יניקה לסינון לעקר את הרכיבים. הסר את המסנן ולהוסיף 1 מיליליטר של 5 מ"ג כולסטרול / מיליליטר. ודא כי ה-pH של התקשורת היא כ 6-6.5. הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת.
- הוסף 20% (v / v) חלב רזה אורגני אולטרה מפוסטרת למדיום mCeHR לפני השימוש. השתמש בטכניקה בקפדנות סטרילי (למשל בזרימה למינרית) בעת הפתיחה וaliquoting חלב. אחסן את המדיה ב 4 ° C.
3. היכונו ג elegans לתרבות בAxenic mCeHR הנוזלי בינוני
- לגדול תולעים בעשר צלחות NGM 60 מ"מ עד שיש הרבה תולעים הרה להולדת וכמות מינימאלית של OP50 E. coli על הצלחות.
- הסר את התולעים מכל צלחת על ידי שטיפה עם 5 מיליליטר של חיץ M9 (מתכון בטבלה 1F), ולשלב בצינור חרוטי 50 מיליליטר.
- לאפשר לתולעים ליםettle ידי השארת הצינור לעמוד במשך 5 דקות עד 10 לאחר מכן להסיר את supernatant המכיל E. בזהירות coli.
- חזור על שלבים 3.2 ו3.3 2x כדי להסיר כמה שיותר החיידקים השיורי ככל האפשר לפני שתמשיכו את ההליך.
- Resuspend התולעים ב0.1 N NaCl בנפח שהוא כפול של שלוש, למשל 1.5 מיליליטר, 3 מיליליטר או 6 מיליליטר שבו ניתן לראות תולעים בודדים בצינור.
- להלבין את התולעים על ידי הוספת 5 N NaOH ו -5% נתרן היפוכלוריט פתרון (אקונומיקה) ביחס 1:02:06 להשעית התולעת. לדוגמא, 1 מיליליטר 5 N NaOH: 2 מיליליטר 5% נתרן היפוכלוריט: 6 מיליליטר של ההשעיה התולעת. מערבבים את NaOH ואקונומיקה לפני שמוסיף להשעית התולעת.
- ורטקס הפתרון במרץ עד התולעים הרה להולדת הם מומסים ורק ביצים הן גלויות בתוך ההשעיה (כ 5 דקות עד 10). לפקח על התהליך באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב עם מטרת 10X.
- אחרי התולעים נמסו לגמרי, מייד גלולהביצים על XG 800 ל45 שניות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולשטוף את הכדור פעמיים עם 10 מיליליטר של מים סטריליים על ידי צנטריפוגה גלולה ב XG 800 ל45 שניות ב 4 ° C.
- אחרי הלבנה, להעביר את כדור הביצה לבקבוק תרבית רקמה 25 2 סנטימטר המכיל 10 מיליליטר של תקשורת mCeHR תוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין. לבצע הליך זה באמצעות טכניקות סטרילית. אם תרצה, להוסיף אנטיביוטיקה נוספת, ובכלל 250 מיקרוגרם / חומצת nalidixic מיליליטר, כדי למנוע התפתחות חיידקים בתרבויות נוזלי axenic.
- דגירה התרבויות נוזלית ב20 ° C בחממה רועדת בכ 70 סל"ד.
- בדקו את התולעים מדי יום כדי לציין את השלב של פיתוח וקצב צמיחה.
הערה: תולעים יהיו בתחילה לגדול לאט ודורשים 7-10 ימים להפוך להרה. עם זאת, כמו התולעים להתאקלם למדיום הנוזלי זמן הדור יקטן לכ -4 ימים לwildtype תולעים (N2). - אחרי שיש לי התולעים developed לבמה ההרה להולדת בתקשורת נוזלית, להעביר את תרבות תולעת צינור חרוטי וגלולים את התולעים ב800 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
- הסר את supernatant ועדינות resuspend את כדור התולעת בנפח שווה של 0.1 M NaCl. לדוגמא, השתמש 10 מיליליטר של 0.1 M NaCl לתולעים בתרבית 10 מיליליטר של mCeHR. לאפשר התולעים להתיישב למשך 5 דקות על קרח.
- לבצע את הליך הלבנת כפי שתואר לעיל בצעדי 3.5-3.8, ולאפשר לתולעים לגדול לדור שני בתקשורת נוזלית axenic. במידת צורך, להוסיף את האנטיביוטיקה שוב כדי לעכב את צמיחת חיידקים.
- שוב לאפשר התולעים להפוך הרה להולדת אז גלולה ו resuspend את התולעים ב0.1 M NaCl כפי שמתוארים בצעדים 3.12 ו3.13, אז להלבין שוב כפי שמתואר בצעדים 3.5-3.8, כדי לייצר אוכלוסייה מסונכרנת. לגדל את תולעי זחל L1 בתקשורת נוזלית ללא אנטיביוטיקה מעתה והלאה.
4. תולעים סנכרון מנוזליםתרבות
- גלולה וresuspend התולעים ב0.1 M NaCl כפי שתואר לעיל בצעדים 3.12 ו3.13. אקונומיקה כפי שתואר לעיל בצעדי 3.5-3.8.
- Resuspend את כדור הביצה ב10 מיליליטר של חיץ M9 ולאפשר לזחלים לבקוע O / N ב 20 ° C על שייקר פלטפורמה מסתובב. הערה: הביצים יבקעו לזחלי L1, אבל לא לפתח עוד יותר, סנכרון התולעים בשלב L1.
- כדי לשמור ותולעים תת, גלולה זחלי L1 בXG 800 למשך 5 דקות, ולאחר מכן resuspend הזחלים ב10 מיליליטר של mCeHR והעברה לבקבוק 25 2 סנטימטר. לאפשר התולעים לגדול ב 20 ° C על פלטפורמה מסתובבת. לשמור על צפיפות מקסימלית של 3,000 תולעים / מיליליטר / 2 סנטימטר, כדי להבטיח תזונה נאותה לתולעים.
הערה: בשלב זה, אנטיביוטיקה אינן נדרשת לשמור על תנאי axenic כאשר ההליכים מתבצעים באמצעות טכניקות סטרילית בזרימה למינרית. תולעים יש לבדוק מדי יום כדי לעקוב אחר צמיחה.
5. חינםזיע ותולעי הפשרה לתרבויות Axenic בינוני
- להקפיא תרבויות axenic אסינכרוני תולעת או זחלי L1 מסונכרנים בחנקן נוזלי. תולעים גלולה ב XG 800 למשך 5 דקות ואז resuspend במאגר S (6.45 מ"מ 4 KHPO, 43.55 מ"מ 4 KHPO, 146.25 מ"מ NaCl) באמצעות 0.5 מ"ל לכל בקבוקון. הוסף נפח שווה של חיץ S עם 30% גליצרול v / v לכל בקבוקון ולהעביר את התולעים ל-80 מעלות צלזיוס לפני אחסון לטווח ארוך בנוזל N 2. הקפא כ 1 x 10 6 תולעים לכל מיליליטר בבקבוקון אחד.
- להפשיר תולעים על ידי דוגרים הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 2 דקות עד שכמעט כל הקרח נמס. בזרימה למינרית, להעביר את התולעים לבקבוק סטרילי המכיל mCeHR ולמקם אותם ב20 ° C.
6. לקבוע את ההשפעה של ריכוז hemin על צמיחה ועל העתקה מmCeHR
- השתמש בתקשורת mCeHR axenic לassay צמיחה תלויה תזונתית של ג elegans. על מנת לקבוע את השפעת of ריכוז hemin על צמיחת תולעת ופיתוח, משתמש מסונכרן תולעי N2 axenic או זנים אחרים של עניין. לסנכרן זחלי L1 כפי שתואר לעיל בסעיף 4.
- ביום הבא, גלולה ולספור זחלי L1 מסונכרנים ולדלל את תולעת 1 לμl של תקשורת axenic. הפוך כלוריד hemin 10 מ"מ ב0.3 4 OH M NH ולהתאים את ה-pH 8 באמצעות HCl המרוכז.
- הוספת 800 μl של תקשורת mCeHR לצלחת 24 גם. הוספת 100 תולעים היטב כל אחד באמצעי תקשורת 100 μl. הוספת כלוריד hemin היטב כל אחד בריכוזים הנעים בין 0 מיקרומטר, 1.5 מיקרומטר ל1,000 מיקרומטר בשלושה עותקים. ודא שכל הבארות מכילות את אותו הריכוז של 0.3 4 OH M NH. בעדינות resuspended התולעים לפני pipetting כדי להבטיח ש100 זחלי L1 מתווספים היטב כל אחד.
- לבחון את התולעים יומיים ולציין את הצמיחה בכל ריכוז בכל טוב. לספור את מספר התולעים לאחר 9 ימים של דגירה, ותתאר את מספר תולעי מיליליטר / המתאים לכל אחד hemeריכוז (איור 1).
7. השפעה של ריכוז hemin על תולעים חיישן הרן
- דגירה תולעים מסונכרנים L1 חיישן heme (GFP Phrg-1 ::) בmCeHR המכילים 4 מיקרומטר, 8 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו20 hemin מיקרומטר.
- תמונת התולעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal, 48 הודעה שעה דגירה (איור 2).
8. ניצול mCeHR ליצור מהונדס ג elegans שימוש microparticle הפצצה
הערה: ההליך להפקת וביצוע הפגזת microparticle באמצעות UNC-119 (ed3) תולעים גדלו בmCeHR מתואר באיור 3 13.
- הכנת תולעת
- העבר את התולעים כ 1 x 10 6 אסינכרוני UNC-119 (ed3) ב90 מיליליטר של תקשורת mCeHR ב175 סנטימטר 2 בקבוק שבוע לפני הפצצה. לאפשר התולעים לגדול ב20 o C °na רועד פלטפורמה ב ~ 70 סל"ד (איור 3-1).
הערה: שבוע לאחר מכן, בצפיפות התולעת צריכה להיות גדולה יותר באופן משמעותי עם תולעים הרה להולדת למבוגרים רבים. כ 3 x 10 7 תולעים יידרשו להפגזת microparticle. - צ'יל JM109 E. coli זורעים 10 צלחות NGM סנטימטר על קרח.
- העבר את תולעי axenic לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר ו צנטריפוגות התולעים בXG 800 למשך 2 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend את התולעים בכל צינור ב50 מיליליטר של חיץ M9 (איור 3-2).
- לאפשר לתולעים בוגרות כדי גלולה על ידי כוח הכבידה ל10-15 דקות על קרח.
הערה: גלולה 2 מיליליטר עכשיו צריכה להכיל תולעים בוגרות> 90%. גלולה 2 מיליליטר זה צריכה להיות כ 5 x 10 6 תולעים, והוא מספיק להפגזת microparticle אחד. - מעייל את פני השטח כולו של JM109 המצונן זורעים צלחת NGM עם גלולה 2 מיליליטר של תולעים. לאפשר לנוזלים להיספג לחלוטין ולאחר מכן לעזוב את הצלחתל30 דקות על קרח לפני שתמשיך (איור 3-3).
- העבר את התולעים כ 1 x 10 6 אסינכרוני UNC-119 (ed3) ב90 מיליליטר של תקשורת mCeHR ב175 סנטימטר 2 בקבוק שבוע לפני הפצצה. לאפשר התולעים לגדול ב20 o C °na רועד פלטפורמה ב ~ 70 סל"ד (איור 3-1).
- הכנה של חלקיקי זהב
- שוקל 30 מ"ג של חלקיקי זהב לתוך צינור microcentrifuge siliconized. הוסף 1 מיליליטר אתנול 70% ומערבולת בצינור למשך 5 דקות.
- לאפשר את הצינור לשבת במשך 15 דקות, אז צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 שניות לגלולת חלקיקי הזהב. הסר את supernatant באמצעות פיפטה קצה על ידי הנגיעה בזהירות את הקצה בצד של ההפך הצינור לחלקיקי זהב.
- לשטוף את חלקיקי זהב עם 1 מיליליטר של מים סטריליים, מערבולת דקות 1 ובקצרה צנטריפוגות הצינור ב6,000 XG במשך 10 שניות. חזור על השלב לשטוף פעמיים, ואז resuspend חלקיקי זהב ב0.5 מיליליטר של גליצרול 50% סטרילי.
שים לב: הריכוז הסופי של חלקיקי הזהב יהיה 60 מ"ג / מיליליטר, וזה יכול להיות מאוחסן במשך 1 עד 2 חודשים ב 4 ° C.
- מכין את תערובת חלקיקי DNA-זהב
- שלב 10 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד הרצוי עם 10 &# 956; גרם של פלסמיד הצלת UNC-119 בצינור microcentrifuge siliconized 1.5 מיליליטר. הוסף 50 μl מים DI ושל תמיסת חלקיקי זהב resuspended גם אז מערבולת דקות 1 100 μl.
- הוסף 150 μl של 2.5 M CaCl 2 ומערבולת הפתרון שוב דקות 1. לפתרון זה, להוסיף 60 μl של 0.1 M spermidine ו מערבולת במשך 3 עד 5 דקות.
- דופק צנטריפוגה הפתרון ב6,000 XG במשך 10 שניות, להסיר את supernatant ולהוסיף 300 μl של 70% אתנול. גם מערבולת דקות 1, צנטריפוגה הדופק ב6,000 XG, להסיר את supernatant ו resuspend ב 170 μl של 100% אתנול. במרץ מערבולת הפתרון ל5-10 דקות לאחר מכן דופק צנטריפוגות ולהסיר את supernatant.
- הפצצה (איור 3-3)
הערה: פרוטוקול זה מתבצע במערכת מסירת החלקיקים המפורטת בטבלה של חומרים / ציוד. בצע את ההוראות למכשיר משלוח החלקיקים זמינים.- <li> הנח גיליון נייר רקמה לתוך צלחת 15 סנטימטר. בעזרת פינצטה, לטבול שבע macrocarriers בנפרד לתוך 100% אתנול ולהניח אותם על הרקמות לייבוש.
- לנקות ביסודיות את חדר biolistic, בעל macrocarrier, וצלחת היעד עם 70% אתנול. נקי וחיטוי מסכי לעצור לפני כל הליך הפגזה.
- טען את macrocarrriers לתוך המחזיק באמצעות פינצטה ולחץ לתוך מחזיק שימוש באפשרות הישיבה.
- להתפשט באופן שווה 20 μl של חלקיקי זהב DNA מצופה במרכזו של כל macrocarrier ולאחר מכן לאפשר הפתרון להתייבש לחלוטין.
- יש לנקות את שני חלקי מחיצת לחץ עם אתנול ולהרכיב עם דיסקי קרע אתנול ניקה. לדפוק את מחיצת הלחץ התאסף ודיסקי קרע לתוך תא ההפצצות.
- להרכיב מסך עצירת autoclaved עם בעל macrocarrier ולמקם את המנגנון על מדף המתכת הנדרש ונעילה במקום.
- הכנס את macr התאסףמנגנון ocarrier לתוך תא biolistic בחריץ שהוקצה מתחת למחיצת הלחץ וליישר עם מחיצת הלחץ.
- תדביק את צלחת NGM הפתוחה עם התולעים על מדף צלחת היעד ולסגור את הדלת של החדר.
- להפציץ תולעים, להתאים את הלחץ לכי צריך לשבור דיסקי הקרע. הפעל את הוואקום כדי 28 סנטימטרים של לחץ כספית, ולאחר מכן לחץ על כפתור האש עד הדיסקים להתפקע.
- לשחרר את הוואקום ולהסיר את צלחת NGM מהמנגנון. שטוף את התולעים מהצלחת ולהפיץ בעשרים 10 צלחות NGM סנטימטר זורעים עם JM109 E. coli (איור 3-4).
- לאפשר התולעים לגדול ל10-14 ימים ב ° C25 ולהרעיב את הצלחות. תולעים חולצו מפגם UNC-119 יהיו תנועה רגילה וניתן לזהות בשלב זה. לאסוף לפחות 10 תולעים "wildtype" מצלחות נפרדות לניתוח נוסף כמו אלה מייצגים קווים מהונדסים עצמאיים (figurדואר 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Culturing ג elegans בעזרי axenic נוזל בינוניים בקביעה של חומרים מזינים הנדרשים על ידי תולעים, ללא הפרעה מצד מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי א coli. תולעי wildtype N2 להתאקלם לתקשורת mCeHR בתוך שלושה דורות ולהציג צמיחה דומה לתולעים גדלו על צלחות חיידקי NGM. ואכן, התולעים אלה הופכים הרה להולדת בתוך 4 ימים לעומת 3.5 ימים לתולעים גדלו על OP50 חיידקים.
אחד יתרונות של שימוש mCeHR היה לראות במחקרים שבחנו את הדרישה התזונתית המדויקת של תולעים אלה 14. באיור 1 תולעים גודלו בmCeHR השלים עם כמויות הולכים וגדלות של heme, עד 1 מ"מ. תצפיות של תולעים אלה הראו עיכוב ברור בצמיחה בריכוזים heme להלן 4 מיקרומטר, עם תולעים מתפתח בשלב זחל L4 אבל לא הצליחו להתקדם לשלב הרה להולדת אחרי תשעה ימים בmCeHR. בריכוזים של 10 מיקרומטר ו2056; heme M התולעים לפתח לבמה ההרה להולדת ב4 ימים ולייצר מספר רב של צאצאים. מספר מקסימאלי של צאצאים היה לראות כאשר תולעים גודלו בmCeHR מכילים 20 heme מיקרומטר. תולעים המשיכו לפתח ולייצר צאצאים ב100 מיקרומטר ו500 heme מיקרומטר. עם זאת, מספרם של צאצאי זחל ירד באופן משמעותי בהשוואה לתולעים גדלו בריכוז האופטימלי של heme 20 heme מיקרומטר. ריכוזי heme או מעל 800 מיקרומטר הביאו תולעים ננסיים, חולניים בשלב זחל L3, שהצביע על כך שריכוזי heme אלה היו רעילים לתולעים.
בנוסף לקביעת הריכוז האופטימלי heme ואת האפקט של חסך heme ורעילות heme על ג צמיחת elegans, יכול להיות מנוצל זני כתב heme להעריך בעקיפין את מעמד heme של התולעת בטווח ריכוז קטן יותר. תולעת IQ6011 היא תולעת מהונדס המבטאת כתב תעתיק מגיב heme, P HRG-1 > :: ה-GFP, כי הפוך מבטא GFP בתגובה לריכוזי heme הסביבתי. כאשר תולעת זו חשופה לheme הסביבתי הנמוך בmCeHR, GFP מתבטא מאוד. תגובה זו היא הפוכה בתנאים גדוש heme, כפי שניתן לראות באיור 2. הביטוי של GFP מודחק ב20 heme מיקרומטר וגדל ככל שריכוז heme הוא ירד. השינויים מצטברים בריכוז heme יכולים להיות מתואמים באופן מדויק עם תגובת גנים וביטוי בתקשורת mCeHR.
בנוסף להיותו מסוגל לשלוט בזהירות בריכוזי חומרי הזנה המסופקים לתולעת, תקשורת axenic mCeHR מאפשרת צמיחה היעילה של מספר גדול של תולעים מסונכרנים. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת להפגזת microparticle (איור 3). באמצעות הליך זה שורה אחת לפחות משולבת פותחו מכל הפגזת microparticle בוצעה (טבלה 2).
n-page = "תמיד"> 
איור 1. ג עקומת צמיחת heme elegans. תולעים גודלו בטווח של ריכוזי heme מ0 מיקרומטר ל1,000 מיקרומטר בmCeHR עבור 9 ימים. מספר התולעים בכל ריכוז נספר וזמם. ב1.5 מיקרומטר תולעי ריכוזי heme היו L4 ולא מסוגל לפתח עוד יותר. ב 800 heme מיקרומטר התולעים היו ננסיים בשלבי L2-L3 והראו השפעות של רעילות heme.
איור 2. תגובה של חיישן heme מתח (Phrg-1 :: GFP) לריכוזי heme שונים בmCeHR. מסונכרן ג המהונדס GFP HRG-1 :: elegans לבטא גודלו בתקשורת mCeHR השלימה עם 4, 8, 10, או 20 heme מיקרומטר ל48 שעות. תמונות צולמו עם confoca Zeiss LSM 710מיקרוסקופ ליטר. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. סכמטי של הפגזת microparticle בג תולעי elegans באמצעות UNC-119 תולעים גדלו בmCeHR. (1) UNC-119 כ 3 x 10 7 (ed3) גדלים ב90 מיליליטר mCeHR תקשורת. (2) Gravids הורשו להתיישב על קרח למשך 10-15 דקות ב50 מיליליטר צינורות חרוטי. (3) גלולה 2 מיליליטר של כ 5 x 10 6 תולעים הרה להולדת הייתה להתפשט באופן שווה על גבי צלחת NGM unseeded. התולעים היו מופגזים 12 מיקרוגרם של פלסמיד של עניין ו6 מיקרוגרם של פלסמיד הצלת UNC-119 ומורכבים לחלקיקי זהב. (4) Tהוא הפציץ תולעים פוצלו על עשרים 10 צלחות סנטימטר זורעים עם E. JM109 זן חיידק. (5) לאחר דגירה 2 שבועות ב ° C25, צלחות עם תולעים מסוג בר נבחרו לניתוח של כוח ביטוי transgene ושיעורי הפרדה.
| לוח 1 א | |
| CeHR, 1 ליטר | |
| באמצעות טכניקה סטרילית וL 1 (0.22 מיקרומטר) יחידת מסנן אבק, לסנן את הכרכים של פתרונות מניות ומים הבאים, לפי הסדר המתואר. | |
| ציטראט diacid כולין | 10 מיליליטר |
| תערובת ויטמינים וגורם הגדילה | 10 מיליליטר |
| מיו-אינוזיטול | 10 מיליליטר |
| כלוריד hemin | 10 מיליליטר |
| מים Deionized | 250 מיליליטר |
| תערובת חומצות גרעין | 20 מיליליטר |
| המינרלים Mix | 100 מיליליטר |
| hydrolyzate lactalbumin | 20 מיליליטר |
| חיוני חומצת אמינו מיקס | 20 מיליליטר |
| שאינו חיוני חומצת אמינו מיקס | 10 מיליליטר |
| KH 2 PO 4 | 20 מיליליטר |
| D-גלוקוז | 50 מיליליטר |
| HEPES, מלח נתרן | 10 מיליליטר |
| מים Deionized | 250 מיליליטר |
| נפח יהיה 800 מיליליטר בשלב זה הסר את יחידת מסנן מואקום ולאחר מכן להוסיף: | |
| כולסטרול | 1 מיליליטר |
| חלב רזה Ultra-מפוסטר | 200 מיליליטר |
| לוח 1 ב | |
| ויטמין וגורם גדילת תערובת, 100 מיליליטר | |
| פתרון 1: כדי 60 מיליליטר של תוספת מים: | |
| N-אצטיל-α-D-גלוקוזאמין | 0.15 גרם |
| DL-אלנין | 0.15 גרם |
| Nicotinamide | 0.075 גרם |
| D-pantethine | 0.0375 גרם |
| חומצת DL-פנטותנית, מלח סידן חמי | 0.075 גרם |
| חומצה פולית | 0.075 גרם |
| Pyridoxamine 2HCl | 0.0375 גרם |
| פירידוקסין HCl | 0.075 גרם |
| mononucleotide פלבין, מלח נתרן | 0.075 גרם |
| hydrochloride תיאמין | 0.075 גרם |
| פתרון 2: הכן את הכימיקלים הבאים ב 5 מיליליטר 1 N KOH: | |
| חומצת p-aminobenzoic | 0.075 גרם |
| D-ביוטין | 0.0375 גרם |
| Cyanocobalamin (B12) | 0.0375 גרם |
| חומצת Folinic, מלח סידן | 0.0375 גרם |
| חומצה ניקוטינית | 0.075 גרם |
| Pyridoxal 5 פוספט | 0.0375 גרם |
| פתרון 3: 0.0375 g (±) α-L-חומצה ליפואית, טופס חמצון ב 1 מיליליטר אתנול: | |
| לשלב פתרונות 1, 2, ו -3 ולהביא את הנפח הסופי ל100 מיליליטר. חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס או להקפיא aliquots ב -20 ° C. הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. | |
| לוח 1 ג | |
| תערובת חומצות גרעין, 100 מיליליטר | |
| ל60 מיליליטר של תוספת מים: | |
| אדנוזין 5 '-monophosphate, מלח נתרן | 1.74 גרם |
| Cytidine 5 'פוספט | 1.84 גרם |
| Guanosine 2 '- ו 3'-monophosphate | 1.82 גרם |
| או | |
| Guanosine 5 'פוספט | 2.04 גרם |
| Uridine 5 'פוספט, מלח disodium | 1.84 גרם |
| תימין (להוסיף אחרון) | 0.63 גרם |
| להביא פתרון ל100 מיליליטר ולאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס או להקפיא aliquots ב -20 ° C. הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. | |
| מינרלי מיקס, 1 ליטר | |
| MgCl 2 • 6 שעות 2 O | 4.1 גרם |
| ציטרט הנתרן | 2.9 גרם |
| מונוהידראט אשלגן ציטרט | 4.9 גרם |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0.07 גרם |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0.2 גרם |
| ZnCl 2 | 0.1 גרם |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6 שעות 2 O | 0.6 גרם |
| CaCl 2 • 2H 2 O (תמיד להוסיף אחרון) | 0.2 גרם |
| הפוך נפחים קטנים של מניות לזו תמהיל ולכן הוא משמש במהירות. | |
| רכיבים אחרים | |
| KH 2 PO 4 | 450 מ"מ |
| ציטראט di-חומצת כולין | 2 מ"מ |
| מיו-אינוזיטול | 2.4 מ"מ |
| D-גלוקוז | 1.45 M |
| כלוריד hemin | 2 מ"מ ב0.1 N NaOH pH 8.0 |
| HEPES, מלח נתרן | 1 M פתרון מניות |
| כולסטרול | 5 מ"ג / מיליליטר באתנול |
| hydrolyzate האנזימטית lactalbumin | 170 מ"ג / מיליליטר |
| שולחן 1F | |
| M9 הצפת, 1 ליטר | |
| KH 2 PO 4 | 3 גרם |
| Na 2 HPO 4 | 6 גרם |
| NaCl | 5 גר ' |
| H 2 O | L 1 |
| 30 דקות החיטוי | |
| 1 M MgSO 4 (סטרילי) | 1 מיליליטר |
טבלה 1. מתכונים למרכיבי mCeHR וmCeHR.
| הפצצה | קווים עם הצלה מסוג בר | קווים עם ההצלה / transgene | קווים יציבים |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| ממוצע | 4.8 | 3.2 | 1 |
טבלה 2. אברהמספר ge של ג המהונדס elegans נוצר באמצעות הפגזת microparticle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה אנו מציגים mCeHR הותאם axenic נוזל מדיה המאפשרת לג המהיר דור elegans עם ייצור של מספר רב של תולעים. מדיה זו מציגה מספר יתרונות כמו התולעים גדלים בלי לזהם E. coli או תוצרי לוואי וחיידקים יכול להיות מנוצלים במחקרים תזונתיים וטוקסיקולוגי. שימושו של ע ' יש חיידק או חיידקים אחרים במחקרים מסוג זה יש כמה חסרונות. למשל, הצמיחה של החיידקים יכולה להשתנות בתנאים שונים והחיידקים יכולים לעכל מולקולות שנמצאים assayed, ובלבלו את הפרשנות של תוצאות. לכן, הפיתוח של מדיום מוגדר לביצוע מחקרים אלה הוא יתרון מאוד.
למרות שג elegans כבר גדל בתקשורת נוזלית במחקרים קודמים 15, תולעים שגדלו בג מדיום תחזוקת elegans (CeMM) מראה עיכוב ברור בזמני דור 16, שלא כמו מה שאנחנו obseRVE במדיום mCeHR. המטרה העיקרית שלנו הייתה לנצל ג elegans ללמוד הומאוסטזיס תזונתי עם דגש ספציפי על heme וחילוף חומרי מתכת. עם זאת בחשבון, mCeHR ושינויים שנוצרו על ידי הקבוצה שלנו להשיג מטרה זו והוביל ישירות לזיהוי של מספר גנים הנדרשים לשמירה על הומאוסטזיס heme בתולעת וסופו של דבר במערכות חוליות מודל 17, 18. תקשורת mCeHR-1 מחדש יכולה גם להיות מנוצלת למינים אחרים, כולל נמטודות redivivus Panagrellus, myriophila Oscheius, וג remanei. בנוסף ניתן לנצל ניסוחים מתכת נמוכים mCeHR-2 וmCeHR-3 שבמחקרים שבחנו הרעלת מתכות כבדות ודרישות 12.
לפני ההתאקלמות, תולעי N2 תערוכת זמן דור ארוך יותר של כ 7 עד 10 ימים בתקשורת mCeHR. כתולעי subcultured, זמן הדור הזה יורד עד 4 ימים, בדומה לזה של תולעים גדלו על OP50 חיידקים. עם זאת, זמן הדור עשוי להיות ארוך יותר לתולעי מוטציה מסוימים, מתקבל על הדעת בגלל הפגמים בהאכלה, תנועה, או לדרישות תזונתיות ספציפיות.
בעת השימוש במדיה נוזליים axenic זה קריטי, כי בטכניקות סטריליות האנינות מנוצלים. בדרך כלל, השימוש באנטיביוטיקה הוא ממוזער וסופו של דבר בוטל כתולעים להתאקלם לטווח הבינוני וחיידקי השייר בוטלו. אנטיביוטיקה בתחילה נדרשות על מנת להבטיח שהתרבויות הן axenic כאשר הוקמו כפי שהיא מונעת את התפתחותם של חיידקים שיורית שיכול להכריע תרבויות התולעת. לאחר שני סיבובים רצופים של הלבנת, אנטיביוטיקה הושמטה מהתרבויות כחלק משימוש מתמשך באנטיביוטיקה רק מסכות טכניקות אספטיים עניות, כי הם חיוניים לגידול תולעי axenically. שימוש בשיטות אלה בזרימה למינרית, המחברים הצליחו לגדול תולעי axenically ללא זיהום. בנוסף, אחסון נכון של הרפואהIA ורכיבים חיוניים לתחזוקת תולעת וצמיחה. התולעים צריכים להיבדק על קצב צמיחה וsubcultured כדי למנוע צפיפות, אשר יכול להוביל להיווצרות dauer כחומרים מזינים חיוניים מתרוקנים. זה ניתן למנוע על ידי הקפדה על הצפיפות של תולעים אינה עולה על 3,000 תולעים / מיליליטר / 2 סנטימטר. חוקרים כי הם חדשים גדל ג elegans axenically יכול להשיג זאת על ידי בדיקת התולעים יומיות ולספור את התולעים שבועיים.
חוקרי סי אלגנס לנצל את התכונות שקופות שלה על ידי יצירת תולעים מהונדסים מבטא סמני fluorescently-מתויגים המאפשרים הדמיה של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. הפגזת biolistic ניצול אפשרה לדור של integrants עותק הנמוך שנמנע מהבעיות של מערכי extrachromosomal וביטוי גנים מוגבהים ציינה בtransgenics נוצר באמצעות הזרקה 19. בעבר, חסרון של transgenics יצירה אחת באמצעותהפגזת microparticle של ג elegans היה הדרישה להכנת צלחת ביצה כדי ליצור את המספר הגדול של תולעי UNC-119 (ed3) נחוצים להליך 20. כל שינוי הנדרש 20 צלחות ביצה למספר תולעי צורך. באמצעות התרבות נוזלית mCeHR axenic מאפשר צמיחה יעילה יותר, ולאחר מכן יותר תולעים להפצצות. בנוסף, ניתן להשתמש בהפצצות בשיתוף עם בחירת תרופה כדי להימנע מהשימוש UNC-119 תולעים (ed3) 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד העניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לHealthGrants DK85035 וDK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
