Summary
C. elegans est généralement cultivées sur des plaques de gélose solide ou dans des cultures liquides ensemencés avec E. coli. Pour éviter des sous-produits bactériens de confondre les études toxicologiques et nutritionnels, nous avons utilisé un milieu liquide axénique, CEHR, de croître et de synchroniser un grand nombre de vers pour une gamme d'applications en aval.
Abstract
Dans ce protocole, nous présentons les matériaux nécessaires, et la procédure de mise C modifié. Legans e habituation et de reproduction médias (mCeHR). En outre, les étapes de l'exposition et l'acclimatation C. elegans cultivés sur E. coli à axéniques milieux liquides sont décrits. Enfin, des expériences en aval qui utilisent axénique C. elegans illustrent les avantages de cette procédure. La capacité d'analyser et de déterminer C. besoins nutritionnels elegans a été illustrée par la croissance N2 vers de type sauvage dans des milieux liquides axéniques avec des concentrations variables de l'hème. Cette procédure peut être reproduit avec d'autres substances nutritives afin de déterminer la concentration optimale pour la croissance et le développement de la vis sans fin ou, pour déterminer les effets toxicologiques des traitements médicamenteux. Les effets des concentrations d'hème variées sur la croissance des vers de type sauvage ont été déterminés par l'observation microscopique qualitative et en quantifiant til nombre de vers qui poussaient dans chaque concentration de l'hème. En outre, l'effet des concentrations de nutriments variés peut être testée en utilisant des vers qui expriment capteurs fluorescents qui répondent à l'évolution du nutriment d'intérêt. En outre, un grand nombre de vers de terre ont été facilement réalisée pour la génération de C. elegans transgéniques en utilisant un bombardement de microparticules.
Introduction
Le nématode du sol, Caenorhabditis elegans, est un organisme modèle puissant utilisé dans de nombreuses études de la génétique à la toxicologie. En raison de sa taille de 1 mm, le temps de génération rapide de quatre jours, de facilité de culture, et un grand nombre de descendants, ces nématodes ont été utilisés dans un certain nombre de cribles génétiques et pharmacologiques 1, 2. Les chercheurs profitent de ce ver à identifier les molécules et les voies conservés dans les systèmes vertébrés. Ces voies comprennent des signaux de mort cellulaire, les voies de vieillissement et de métabolisme et du système nerveux 6.3. En outre, la transparence de C. elegans permet la génération de lignées transgéniques en utilisant des protéines reporters fluorescents, qui peuvent être visualisées directement pour analyser les modèles d'expression génique et la localisation des protéines.
Dans de nombreuses études ce nématode est cultivée sur une surface à base d'agar-solide en utilisant un milieu de croissance de nématodes (NGM) ou de plaques dans liquid cultures ensemencées avec Escherichia coli en tant que source d'alimentation 7,8. Ces sources alimentaires bactériennes peuvent confondre les études biochimiques et toxicologiques avec l'interférence de sous-produits bactériens qui affectent l'interprétation des résultats. Afin d'éviter ces effets combinés, C. elegans peuvent être cultivées dans un milieu liquide axéniques qui est dépourvu de bactéries en tant que source de nourriture. L'utilisation de ce média, nous avons cultivé avec succès des millions de vers très synchronisées pour beaucoup norme C. protocoles elegans, y compris l'analyse des microréseaux de gènes régulés de manière différentielle dans C. elegans exposée à différentes concentrations d'hème, et la production des vers transgéniques en utilisant un bombardement de gène. Ce support est chimiquement défini et modifié à partir d'une recette originale formulée par le Dr Eric Clegg 9. L'utilisation de ce média mCeHR, nous avons réussi à identifier les gènes impliqués dans l'homéostasie de l'hème, parlé à des gènes sensibles comme l'hème (hrg s) 10, ce qui seraitont pas été possible dans des conditions de croissance réguliers qui utilisent des plaques de gélose NGM ensemencé avec E. coli.
Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour l'introduction et le maintien C. elegans cultivés sur E. coli à la mCeHR axénique et d'utiliser cette méthode pour obtenir un grand nombre de vers de production transgénique C. lignes elegans utilisant un bombardement de microparticules. Nous avons également des études actuelles qui montrent l'utilité de l'utilisation des médias axéniques pour déterminer les besoins nutritionnels de C. elegans en utilisant, par exemple, l'hème. Ces études montrent que l'utilisation de supports mCeHR permet une croissance rapide d'un grand nombre de C. elegans pour de nombreuses applications en aval utilisés par les chercheurs de vers.
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Protocol
1. Souches de vers
- Obtenir C. elegans de type sauvage souches Bristol N2 du Centre de Génétique Caenorhabditis (CCG) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) et de les maintenir sur des plaques NGM ensemencé avec E. coli souche OP50 7. Remarque: le ver transgénique souches IQ6011 (PHRG-1 :: GFP) utilisés ont été générés comme décrit précédemment 11. IQ6011 peut être demandé à l'auteur correspondant.
2. Préparation de modification C. elegans Habitation et Reproduction moyen (mCeHR)
Préparez le support de liquide mCeHR comme décrit ci-dessous 12. Ce support liquide axénique permet aux vers de se développer sans sources de nourriture. Effectuer toutes les manipulations de milieux liquides axéniques et vers axéniques en utilisant des conditions strictement stériles comme une hotte à flux laminaire.
- Obtenir ultra lait pasteurisé d'une épicerie sans gras. Utilisez le pro réfrigéréconduit pas et le produit de la température ambiante. Avant de procéder au mCeHR moyen, zèbrent le lait sur cœur-cervelle (BHI) plaques de gélose et incuber pendant 3 jours à 30 ° C et 37 ° C pour vérifier la stérilité. Transvaser le lait à 50 ml tubes stériles et conserver à -80 ° C
- Préparer chacun des éléments suivants et de les combiner dans l'ordre et les montants proposés pour préparer 1 L de mCeHR (Tableau 1A): 10 ml d'mM choline diacide citrate 2, 10 ml de vitamine et facteur de croissance mélange (voir la recette dans le tableau 1B), 10 ml de 2,4 mM de myo-inositol, 10 ml de 2 mM de chlorure de l'hémine, 250 ml d'eau désionisée. Appliquer le vide et le filtre à travers une unité de filtre de 0,22 um.
- Ajouter 20 ml de mélange d'acide nucléique (recette dans le tableau 1C), 100 ml de mélange minéral (recette dans le tableau 1D), 20 ml de 170 mg / ml d'hydrolysat de lactalbumine, 20 ml d'acides aminés essentiels, 10 ml d'aminé non essentiel acides, 20 ml de 450 mM KH 2 PO 4,50 ml de 1,45 M de D-glucose, 10 ml de HEPES 1 M, sel de sodium, 250 ml d'eau désionisée.
- Appliquer le vide pour filtrer stériliser les composants. Retirez le filtre et ajouter 1 ml de 5 mg / ml cholestérol. Assurez-vous que le pH du milieu est d'environ 6-6,5. Remarque: cette solution peut être stockée à -80 ° C pendant jusqu'à un an.
- Ajouter 20% (v / v) ultra lait écrémé pasteurisé organique au milieu mCeHR avant utilisation. Utiliser une technique scrupuleusement stérile (par exemple dans une hotte à flux laminaire) lors de l'ouverture et aliquotage le lait. Conservez le support à 4 ° C.
3. Préparer C. elegans pour la culture en milieu liquide Axenic mCeHR
- Grandir vers sur dix de 60 mm plaques NGM jusqu'à il ya beaucoup de vers gravides et une quantité minimale de OP50 E. coli sur les plaques.
- Retirer les vers à partir de chaque plaque en rinçant avec 5 ml de tampon M9 (recette dans le tableau 1F), et combiner dans un tube conique de 50 ml.
- Autoriser les vers à settle en laissant le tube reposer pendant 5 à 10 min puis retirez délicatement le surnageant contenant le E. coli.
- Répéter les étapes 3.2 et 3.3, 2x pour enlever autant de bactéries résiduelles que possible avant de poursuivre la procédure.
- Remettre en suspension les vers dans 0,1 N de NaCl dans un volume qui est un multiple de trois, par exemple 1,5 ml, 3 ml ou 6 ml dans lequel les vers individuels peuvent être vus dans le tube.
- Blanchir les vers de terre en ajoutant du NaOH 5 N et de l'hypochlorite de sodium à 5% (eau de Javel) dans un rapport de 01:02:06 pour la suspension à vis sans fin. Par exemple, 1 ml de NaOH 5 N: 2 ml 5% d'hypochlorite de sodium: 6 ml de la suspension de la vis sans fin. Mélanger le NaOH et l'eau de Javel avant d'ajouter à la suspension de ver.
- Vortex la solution vigoureusement jusqu'à ce que les vers gravides sont dissous et que des œufs sont visibles au sein de la suspension (environ 5 à 10 min). Surveiller le processus en utilisant un microscope à contraste de phase avec un objectif 10X.
- Après les vers sont complètement dissous, culot immédiatement leœufs à 800 g pendant 45 sec à 4 ° C. Enlever le surnageant et rincer le culot deux fois avec 10 ml d'eau stérile par centrifugation le culot à 800 g pendant 45 sec à 4 ° C.
- Après le blanchiment, transférer le culot d'oeuf à un ballon de 25 cm de tissu 2 de culture contenant 10 ml de milieu mCeHR supplémenté avec 100 ug / ml de tetracycline. Effectuer cette procédure en utilisant des techniques stériles. Si vous le souhaitez, ajouter d'autres antibiotiques, y compris 250 pg / ml d'acide nalidixique, à prévenir la croissance bactérienne dans les cultures liquides axéniques.
- Incuber les cultures liquides à 20 ° C sur un incubateur à agitation par secousses à environ 70 tours par minute.
- Vérifier les vers tous les jours de noter le stade de développement et le taux de croissance.
Remarque: Worms seront d'abord se développer lentement et nécessitent 7 à 10 jours pour devenir gravide. Cependant, comme les vers s'acclimater au milieu liquide le temps de génération diminue à environ 4 jours pour type sauvage (N2) vers. - Après les vers ont développé au stade gravide en milieu liquide, transférer la culture à vis sans fin à un tube conique et un culot les vers à 800 xg pendant 5 min à 4 ° C en utilisant un rotor à godets oscillants.
- Eliminer le surnageant et remettre le culot en douceur à vis sans fin dans un volume égal de 0,1 M de NaCl. Par exemple, utiliser 10 ml de NaCl 0,1 M pour les vers cultivées dans 10 ml de mCeHR. Autoriser les vers de se contenter de 5 min sur la glace.
- Effectuer la procédure de blanchiment tel que décrit ci-dessus dans les étapes 3.5 à 3.8, et permettre aux vers de se développer pour une deuxième génération dans les milieux liquides axéniques. Si nécessaire, ajouter à nouveau de l'antibiotique pour inhiber la croissance bactérienne.
- Encore une fois les vers permettent de devenir gravide alors culot et remettre les vers dans 0,1 M de NaCl comme décrit dans les étapes 3.12 et 3.13, puis blanchir à nouveau comme décrit dans les étapes 3.5 à 3.8, pour produire une population synchronisée. Cultiver les vers larvaires L1 dans des milieux liquides sans antibiotiques à partir de maintenant.
4. Synchronisation Worms de liquideCulture
- Pellet et remettre les vers dans 0,1 M de NaCl, comme décrit ci-dessus dans les étapes 3.12 et 3.13. Bleach comme décrit ci-dessus dans les étapes 3.5 à 3.8.
- Remettre en suspension le culot de l'oeuf dans 10 ml de tampon M9 et laisser les larves éclosent O / N à 20 ° C sur un agitateur à plateau tournant. Remarque: Les œufs éclosent en larves L1, mais ne seront pas développer davantage, la synchronisation des vers au stade L1.
- Pour maintenir et vers la sous-culture, culot L1 larves à 800 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les larves dans 10 ml de mCeHR et transférer dans une fiole de 25 cm 2. Autoriser les vers de se développer à 20 ° C sur une plate-forme tournante. Maintenir une densité maximale de 3000 vers / ml / cm 2 pour assurer une nutrition adéquate pour les vers.
Remarque: A ce stade, les antibiotiques ne sont pas nécessaires pour maintenir des conditions axéniques lorsque les procédures sont effectuées en utilisant des techniques stériles dans une hotte à flux laminaire. Worms doivent être contrôlés quotidiennement pour surveiller la croissance.
5. Gratuitzing et de décongélation pour Worms cultures axéniques moyennes
- Geler les cultures de vers ou de larves axéniques asynchrones de L1 synchronisée dans l'azote liquide. vers de granulés à 800 g pendant 5 min, puis remises en suspension dans un tampon de S (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, NaCl 146.25) en utilisant 0,5 ml de chaque flacon. Ajouter un volume égal de tampon S avec 30% v / v de glycérol à chaque flacon et transférer les vers à -80 ° C avant l'entreposage à long terme dans du N2 liquide. Congeler environ 1 x 10 6 par ml de vers dans chaque flacon.
- Décongeler les vers en incubant les flacons à 37 ° C pendant environ 2 min jusqu'à ce que la quasi-totalité de la glace est fondue. Dans une hotte à flux laminaire, transférer les vers dans un flacon stérile contenant mCeHR et placez-les à 20 ° C.
6. Déterminer l'effet de Hemin concentration sur la croissance et la reproduction dans mCeHR
- Utiliser les médias mCeHR axéniques pour doser la croissance dépend de nutriments C. elegans. Pour déterminer l'effet of concentration héminique sur la croissance du ver et le développement, l'utilisation synchronisée vers N2 axéniques ou d'autres souches d'intérêt. Synchroniser les larves de L1 comme décrit ci-dessus à la section 4.
- Le lendemain, granulés et compter les larves L1 synchronisé et diluer à 1 ver par ml de médias axéniques. Faire 10 mM de chlorure de hémine dans 0,3 M NH 4 OH et ajuster le pH à 8 avec HCl concentré.
- Ajouter 800 ul de milieu mCeHR à une plaque de 24 puits. Ajouter 100 vers à chaque puits dans 100 ul de milieu. Ajouter le chlorure d'hémine à chaque puits à des concentrations allant de 0 uM, 1,5 uM à 1,000 uM, en triple exemplaire. Assurez-vous que tous les puits contiennent la même concentration de 0,3 M NH 4 OH. Remises en suspension doucement les vers avant pipetage afin de s'assurer que 100 larves L1 sont ajoutés à chaque puits.
- Examiner les vers tous les jours et noter la croissance dans chaque concentration dans chaque puits. Comptez le nombre de vers après 9 jours d'incubation et tracer le nombre de vers de terre / ml correspondant à chaque hèmeconcentration (Figure 1).
7. Effet de Hemin Concentration sur hème capteur Worms
- Incuber L1 vers des capteurs de l'hème synchronisés (PHRG-1 :: GFP) dans mCeHR contenant 4 uM, 8 uM, 10 uM et 20 uM hémine.
- Image les vers utilisant la microscopie confocale de fluorescence, 48 heures après l'incubation (Figure 2).
8. Utilisant mCeHR pour générer transgénique C. elegans utilisant un bombardement de microparticules
Remarque: La procédure pour générer et effectuer un bombardement de microparticules en utilisant les vers adultes dans mCeHR unc-119 (ed3) est décrit à la figure 3 13.
- Préparation de Worm
- Transférer environ 1 x 10 6 asynchrones unc-119 (ed3) vers dans 90 ml de milieu mCeHR dans un 175 cm 2 flacon une semaine avant le bombardement. Autoriser les vers de se développer à 20 ° C ona secouant plate-forme à ~ 70 min (figure 3-1).
Remarque: Une semaine plus tard, la densité de la vis sans fin doit être significativement plus nombreux vers adultes gravides. Environ 3 x 10 7 vers seront nécessaires pour un bombardement de microparticules. - Froid JM109 E. coli ensemencé 10 cm de plaques NGM sur la glace.
- Transférer les vers axéniques à deux tubes de 50 ml coniques et centrifuger les vers à 800 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et remettre les vers dans chaque tube 50 ml de tampon M9 (figure 3-2).
- Laissez les vers adultes de granulés par gravité pendant 10 à 15 min sur la glace.
Remarque: Le 2 ml culot doit maintenant contenir> 90% vers adultes. Ce 2 ml culot doit avoir environ 5 x 10 6 vers et est suffisant pour un bombardement de microparticules. - Manteau de toute la surface de la JM109 réfrigérés ensemencée plaque NGM avec 2 ml de culot vers. Laisser le liquide soit complètement absorbé puis laisser la plaquependant 30 min sur la glace avant de poursuivre (figure 3-3).
- Transférer environ 1 x 10 6 asynchrones unc-119 (ed3) vers dans 90 ml de milieu mCeHR dans un 175 cm 2 flacon une semaine avant le bombardement. Autoriser les vers de se développer à 20 ° C ona secouant plate-forme à ~ 70 min (figure 3-1).
- Préparation de particules d'or
- Peser 30 mg de particules d'or dans un tube à centrifuger siliconé. Ajouter 1 ml de 70% d'éthanol et vortex le tube pendant 5 min.
- Laisser le tube reposer pendant 15 min, puis centrifuger à 6000 g pendant 10 secondes pour sédimenter les particules d'or. Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette en touchant soigneusement la pointe sur le côté du tube opposée à des particules d'or.
- Laver les particules d'or avec 1 ml d'eau stérile, vortex pendant 1 min et centrifuger brièvement le tube à 6000 g pendant 10 sec. Répéter l'étape de lavage deux fois, puis remettre en suspension les particules d'or dans 0,5 ml de glycerol à 50% stérile.
Remarque: La concentration finale des particules d'or sera de 60 mg / ml et il peut être stocké pendant 1 à 2 mois à 4 ° C.
- Préparer le mélange de particules d'ADN d'or
- Moissonneuse 10 pg de l'ADN de plasmide désiré avec 10 &# 956; g de l'unc-119 de sauvetage plasmide dans un tube de 1,5 ml microtubes siliconé. Ajouter 50 ul d'eau DI et 100 ul de solution de particules d'or et ensuite remises en suspension à vortex pendant 1 minute.
- Ajouter 150 ul de 2,5 M de CaCl2 et le vortex à nouveau la solution pendant 1 min. A cette solution, ajouter 60 ul de 0,1 M de spermidine et vortex pendant 3 à 5 min.
- Pulse centrifuger la solution à 6000 g pendant 10 sec, éliminer le surnageant et ajouter 300 ul d'éthanol à 70%. Vortex bien pendant 1 min, impulsion centrifuge à 6000 xg, enlever le surnageant et remettre en suspension dans 170 ul d'éthanol 100%. Vigoureusement vortex la solution pendant 5 à 10 minutes, puis pouls centrifugeuse et enlever le surnageant.
- Bombardement (figure 3-3)
Remarque: Ce protocole est réalisé avec le système de délivrance de particules indiquée dans le tableau des matériaux / équipement. Suivez les instructions de l'instrument de délivrance de particules disponibles.- <li> Placez une feuille de papier de soie dans une plaque de 15 cm. L'aide de pinces, tremper sept macrocarriers individuellement dans 100% d'éthanol et les poser sur le tissu à sécher.
- Bien nettoyer la chambre biolistique, titulaire macrosupport, et la plaque de la cible avec 70% d'éthanol. Nettoyer et stériliser à l'autoclave les écrans d'arrêt avant chaque procédure de bombardement.
- Chargez les macrocarrriers dans le support en utilisant des pinces et appuyez sur le support en utilisant l'outil de coin.
- Répartir uniformément 20 pl de l'ADN des particules recouvertes d'or dans le centre de chaque macrosupport puis laisser la solution sécher complètement.
- Nettoyer les deux parties du diviseur de pression avec de l'éthanol et de l'éthanol à assembler nettoyé disques de rupture. Visser le diviseur de pression assemblés et des disques de rupture dans la chambre de bombardement.
- Assembler un écran d'arrêt à l'autoclave avec le support de macrosupport et placer l'appareil sur le plateau de métal nécessaire et verrouillage en place.
- Insérez le macr assembléAppareil ocarrier dans la chambre biolistique dans l'emplacement alloué au-dessous du diviseur de pression et de s'aligner avec le diviseur de pression.
- Collez la plaque NGM ouvert avec les vers sur le plateau de plaque cible et fermer la porte de la chambre.
- Pour bombarder vers, ajuster la pression de ce qui est nécessaire pour casser les disques de rupture. Allumez le vide à 28 pouces de Hg, puis appuyez sur le bouton de tir jusqu'à ce que les disques se rompent.
- Relâchez le vide et retirer la plaque NGM de l'appareil. Laver les vers de la plaque et de les redistribuer dans vingt dix plaques cm de NGM ensemencées avec JM109 E. coli (figure 3-4).
- Autoriser les vers de se développer pendant 10 à 14 jours à 25 ° C et mourir de faim les plaques. Worms sauvés du défaut unc-119 auront mouvement normal et peuvent être identifiées à ce moment. Choisissez au moins 10 vers "de type sauvage" de plaques séparées pour une analyse plus approfondie que celles-ci représentent des lignées transgéniques indépendantes (Figure 5.3).
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Representative Results
La culture de C. elegans dans axéniques aides milieu liquide dans la détermination des éléments nutritifs qui sont requis par les vers, sans ingérence des métabolites secondaires produits par E. coli. Vers de type sauvage N2 s'acclimater aux médias mCeHR dans les trois générations et montrent une croissance comparable à des vers adultes sur des plaques bactériennes NGM. En effet, ces vers deviennent gravides dans les 4 jours que comparativement à 3,5 jours pour les vers adultes sur les bactéries OP50.
Un avantage d'utiliser mCeHR a été vu dans les études qui ont examiné l'exigence nutritive exacte de ces vers 14. Sur la figure 1 ont été cultivées dans des vers mCeHR complétées par des quantités croissantes de l'hème, jusqu'à 1 mM. Observations de ces vers ont montré un retard distinct de la croissance à des concentrations de l'hème de moins de 4 pm, vers le développement de stade larvaire L4 mais incapable de passer à l'étape gravide après neuf jours de mCeHR. A des concentrations de 10 pM et 2056; M hème les vers se développent à l'étape gravide en 4 jours et produire grand nombre de descendants. Un nombre maximum de descendance a été observée lorsque les vers ont été cultivées dans mCeHR contenant 20 uM hème. Worms continué à se développer et produire une descendance à 100 uM et 500 uM hème. Toutefois, le nombre de descendants des larves significativement diminué par rapport à des vers adultes, à la concentration optimale de l'hème de 20 uM de l'hème. concentrations d'hème ou au-dessus de 800 uM ont entraîné un retard de croissance, vers malades au stade larvaire L3, qui ont indiqué que ces concentrations d'hème sont toxiques pour les vers.
En plus de déterminer la concentration optimale de l'hème et de l'effet de la privation de l'hème et de la toxicité de l'hème en C. elegans croissance, les souches rapporteuses hème pourrait être utilisé pour évaluer indirectement l'état de l'hème de la vis sans fin dans une plage de concentration plus faible. Le ver de IQ6011 est un ver transgénique qui exprime un hème sensible rapporteur transcriptionnel, P hrg-1 la figure 2. Expression de la GFP est réprimé à 20 uM hème et augmente à mesure que la concentration de l'hème est diminuée. Les changements incrémentiels de la concentration d'hème peuvent être corrélées avec précision à la réponse des gènes et l'expression dans des milieux mCeHR.
En plus d'être capable de contrôler soigneusement les teneurs en nutriments fournis à la vis sans fin, mCeHR médias axénique permet la croissance efficace d'un grand nombre de vers synchronisées. Cette fonction peut être exploitée pour un bombardement de microparticules (figure 3). En utilisant cette procédure, au moins une conduite intégrée ont été développés à partir de chaque bombardement de microparticules effectuées (Tableau 2).
Figure 1. C. elegans hème courbe de croissance. Worms ont été cultivés dans une gamme de concentrations d'hème à partir de 0 à 1000 pM pM dans mCeHR pour 9 jours. Le nombre de vers dans chaque concentration a été compté et tracée. À 1,5 um hème concentrations vers étaient L4 et incapable de se développer. À 800 uM hème les vers ont été rabougris à des stades L2-L3 et effets de la toxicité de l'hème ont montré.
Figure 2. Réponse du capteur de l'hème (PHRG-1 :: GFP) souche à différentes concentrations d'hème dans mCeHR. Synchronisée transgénique C. elegans exprimant HRG-1 :: GFP ont été cultivées dans un milieu supplémenté avec mCeHR 4, 8, 10, ou 20 uM pendant 48 h hème. Les images ont été prises avec un Zeiss LSM 710 confocal microscope. La barre d'échelle est de 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Schéma de bombardement de microparticules dans C. elegans utilisant unc-119 vers adultes dans mCeHR. (1) Environ 3 x 10 7 unc-119 (ed3) vers sont cultivées dans 90 ml mCeHR médias. (2) gravides ont été autorisés à s'installer sur de la glace pendant 10-15 min dans 50 ml tubes coniques. (3) A 2 ml culot d'environ 5 x 10 6 vers gravides a été répartie uniformément sur une plaque non ensemencée NGM. Les vers ont été bombardés de 12 ug de plasmide d'intérêt et 6 pg d'unc-119 de sauvetage plasmide complexé à des particules d'or. (4) Til a bombardé vers ont été répartis sur vingt plaques de 10 cm ensemencées avec le E. coli souche JM109. (5) Après 2 semaines d'incubation à 25 ° C, les plaques avec des vers de type sauvage ont été sélectionnés pour l'analyse de la force de l'expression du transgène et taux de ségrégation.
| Tableau 1A | |
| CEHR, 1 L | |
| En utilisant une technique stérile et 1 L (0,22 um) unité de filtre sous vide, filtrage du volume des solutions mères et de l'eau suivants dans l'ordre décrit. | |
| Choline diacide citrate | 10 ml |
| Vitamine et facteur de croissance mélange | 10 ml |
| myo-Inositol | 10 ml |
| chlorure de Hemin | 10 ml |
| De l'eau déminéralisée | 250 ml |
| Mélange d'acide nucléique | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| L'hydrolysat de lactalbumine | 20 ml |
| Aminés essentiels Acid Mix | 20 ml |
| Aminé non essentiel Acid Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-Glucose | 50 ml |
| HEPES, sel de sodium | 10 ml |
| De l'eau déminéralisée | 250 ml |
| Volume sera de 800 ml à ce point Retirer l'unité de filtre de vide puis ajouter: | |
| Cholestérol | 1 ml |
| Lait écrémé ultra-pasteurisé | 200 ml |
| Tableau 1B | |
| Vitamine et facteur de croissance mélange, 100 ml | |
| Solution 1: Pour 60 ml d'ajouter de l'eau: | |
| N-acétyl-α-D-glucosamine | 0,15 g |
| DL-alanine | 0,15 g |
| Nicotinamide | 0,075 g |
| D-pantethine | 0,0375 g |
| acide DL-pantothénique, sel de calcium hémi | 0,075 g |
| L'acide folique | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCI | 0,0375 g |
| Pyridoxine HCl | 0,075 g |
| Flavine mononucléotide, le sel de sodium | 0,075 g |
| Thiamine chlorhydrate | 0,075 g |
| Solution 2: Préparer les produits chimiques suivants dans 5 ml 1 N KOH: | |
| l'acide p-aminobenzoïque | 0,075 g |
| D-biotine | 0,0375 g |
| Cyanocobalamine (B12) | 0,0375 g |
| L'acide folinique, le sel de calcium | 0,0375 g |
| L'acide nicotinique | 0,075 g |
| Pyridoxal 5-phosphate | 0,0375 g |
| Solution 3: 0,0375 g (±) α-L-lipoïque, forme oxydée dans 1 ml d'éthanol: | |
| Combiner les solutions 1, 2 et 3, et amener le volume final à 100 ml. Magasin dans l'obscurité à 4 ° C ou congeler des aliquotes à -20 ° C. Faites de petits volumes de stocks pour ce mélange de sorte qu'il est utilisé rapidement. | |
| Tableau 1C | |
| Mélange d'acide nucléique, 100 ml | |
| 60 ml de complément de l'eau: | |
| L'adénosine 5 '-monophosphate, sel de sodium | 1,74 g |
| Cytidine 5'-phosphate | 1,84 g |
| Guanosine 2 '- et 3'-monophosphate | 1,82 g |
| OU | |
| La guanosine 5'-phosphate | 2,04 g |
| Uridine 5 '-phosphate, sel de disodium | 1,84 g |
| Thymine (l'ajouter en dernier) | 0,63 g |
| Amener la solution à 100 ml et conserver à l'obscurité à 4 ° C ou congeler des aliquotes à -20 ° C. Faites de petits volumes de stocks pour ce mélange de sorte qu'il est utilisé rapidement. | |
| Mélange minéral, 1 L | |
| MgCl 2 • 6H 2 O | 4,1 g |
| citrate de sodium | 2,9 g |
| Le citrate de potassium monohydraté | 4,9 g |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl2 | 0,1 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O | 0,6 g |
| CaCl 2 • 2H 2 O (toujours ajouter dernier) | 0,2 g |
| Faites de petits volumes de stocks pour ce mélange de sorte qu'il est utilisé rapidement. | |
| Autres Composants | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Choline citrate di-acide | 2 mM |
| myo-Inositol | 2,4 mM |
| D-Glucose | 1,45 M |
| chlorure de Hemin | 2 mM dans du NaOH 0,1 N à pH 8,0 |
| HEPES, sel de sodium | 1 M de solution stock |
| Cholestérol | 5 mg / ml dans l'éthanol |
| Hydrolysat enzymatique de lactalbumine | 170 mg / ml |
| Tableau 1F | |
| M9 tampon, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H 2 O | 1 L |
| Autoclave 30 min | |
| 1 M MgSO 4 (stérile) | 1 ml |
Tableau 1. Recettes pour les composants de mCeHR et mCeHR.
| Bombardement | Lignes de type sauvage sauvetage | Lignes avec sauvetage / transgène | Des lignées stables |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Moyenne | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tableau 2. Average nombre de transgénique C. elegans généré en utilisant un bombardement de microparticules.
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Discussion
Dans ce protocole, nous présentons une mCeHR liquide axénique modifié médiatique qui permet rapide C. génération elegans avec production d'un grand nombre de vers. Ce support présente plusieurs avantages que les vers sont cultivés sans contaminer E. coli ou des sous-produits bactériens et peuvent être exploitées dans les études nutritionnelles et toxicologiques. L'utilisation de E. coli ou d'autres bactéries dans ces études a plusieurs inconvénients. Par exemple, la croissance de la bactérie peut modifier dans diverses conditions et les bactéries peuvent métaboliser les molécules qui sont en cours d'analyse, confondant l'interprétation des résultats. Par conséquent, le développement d'un milieu défini pour effectuer ces études est très avantageux.
Bien que C. elegans ont été cultivés dans des milieux liquides dans des études antérieures 15, vers cultivées en C. milieu d'entretien elegans (CeMM) montrent un retard distinct des temps de génération de 16, contrairement à ce que nous OBSErve en milieu mCeHR. Notre principal objectif était d'exploiter C. elegans pour étudier l'homéostasie des éléments nutritifs avec un accent particulier sur l'hème et le métabolisme de métal. Dans cet esprit, mCeHR et modifications engendrées par notre groupe atteindre cet objectif et a directement conduit à l'identification d'un certain nombre de gènes nécessaires au maintien de l'homéostasie de l'hème dans la vis sans fin et finalement dans des systèmes modèles vertébrés 17, 18. Reformulés mCeHR-1 médias peuvent également être exploitées pour d'autres espèces de nématodes dont Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila, et C. remanei. En plus des formulations faibles de métaux mCeHR-2 et mCeHR-3 peuvent être exploitées dans les études portant sur la toxicité et les exigences de 12 métaux lourds.
Avant acclimatation, vers N2 présentent un temps de génération plus d'environ 7 à 10 jours dans mCeHR médias. Comme les vers sont repiquées, ce temps de génération décroît à 4 jours, semblables à celle de vers de terre cultivés sur OP50 bactéries. Cependant, le temps de génération peut être plus long pour certains vers mutants, vraisemblablement en raison de défauts dans l'alimentation, le mouvement, ou des besoins nutritionnels spécifiques.
Lors de l'utilisation des milieux liquides axéniques il est essentiel que les techniques stériles exigeants sont utilisés. Habituellement, l'utilisation d'antibiotiques est réduite au minimum et par la suite éliminé comme les vers s'acclimater à la moyenne et les bactéries résiduelles sont éliminées. Les antibiotiques sont initialement nécessaires pour s'assurer que les cultures sont établies lorsque axénique car elle empêche la croissance de bactéries résiduelles qui peut submerger les cultures à vis sans fin. Après deux cycles successifs de blanchiment, les antibiotiques sont omis dans les cultures que l'utilisation continue d'antibiotiques que des masques de techniques aseptiques pauvres qui sont essentiels pour la croissance vers axéniquement. L'utilisation de ces techniques dans une hotte à flux laminaire, les auteurs ont pu se développer les vers axéniquement sans contamination. En outre, la bonne conservation de la media et composants est essentiel pour la maintenance de ver et de la croissance. Les vers doivent être vérifiés pour le taux de croissance et repiquées pour éviter l'encombrement, ce qui peut conduire à la formation de dauer comme éléments nutritifs essentiels sont épuisés. Ceci peut être évité en faisant en sorte que la densité de vers n'excède pas 3000 vers / ml / cm 2. Les chercheurs qui sont nouveaux à la croissance de C. elegans peut axéniquement parvenir en cochant les vers tous les jours et compter les vers hebdomadaire.
C. elegans chercheurs de profiter de ses propriétés transparentes en générant vers transgéniques exprimant des marqueurs étiquetées par fluorescence qui permettent la visualisation de l'expression génique et la localisation des protéines. Utilisant bombardement biolistique permis pour la production de intégrants bas de copie éviter les problèmes de réseaux extra-chromosomiques et l'expression du gène élevée a noté avec transgéniques générées par injection 19. Auparavant, un inconvénient de générer des transgéniques à l'aidebombardement de microparticules de C. elegans était l'exigence pour la préparation de la plaque d'oeuf pour générer un grand nombre de unc-119 (ed3) vers nécessaires pour la procédure 20. Chaque transformation doit 20 plats d'oeufs pour le nombre de vers nécessaires. Utiliser la culture axénique de liquide mCeHR permet une croissance plus efficace et plus par la suite vers des bombardements. En outre, les bombardements peuvent être utilisées en conjonction avec la sélection de médicaments pour éviter d'utiliser unc-119 (ED3) vers 21.
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Disclosures
Les auteurs déclarent il n'y a aucun intérêt ou conflit d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of HealthGrants DK85035 et DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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