Summary
C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.
Abstract
In diesem Protokoll stellen wir die benötigten Materialien und das Verfahren zur Herstellung von modifizierten C. E legans Gewöhnung und Wiedergabemedien (mCeHR). Darüber hinaus sind die Schritte zum Belichten Akklimatisierung und C. elegans auf E. gewachsen coli, um flüssige Medien axenischen beschrieben. Schließlich abwärts Experimente, die axenischen C nutzen elegans veranschaulichen die Vorteile dieses Verfahrens. Die Fähigkeit, zu analysieren und festzustellen, C. elegans Nährstoffbedarf wurde durch den Anbau von N2 Wildtyp-Würmer in axenischen flüssigen Medien mit unterschiedlichen Häm-Konzentrationen dargestellt. Dieses Verfahren kann mit anderen Nährstoffen repliziert werden, um die optimale Konzentration für Schnecken Wachstum und Entwicklung zu bestimmen, oder, um die toxikologischen Wirkungen von medizinischen Behandlungen zu bestimmen. Die Auswirkungen von verschiedenen Häm-Konzentrationen auf das Wachstum von Wildtyp-Würmer wurden durch qualitative mikroskopische Beobachtung und Quantifizierung von t bestimmter Anzahl der Würmer, die in jedem Häm-Konzentration wuchs. Zusätzlich kann die Wirkung von verschiedenen Nährstoffkonzentrationen durch Verwendung Würmer, Fluoreszenzsensoren, die auf Änderungen in den Nährstoff von Interesse reagieren auszudrücken getestet werden. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Würmern leicht zur Erzeugung von transgenen C. elegans mittels Mikropartikelbeschuss erzeugt.
Introduction
Der Boden Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus in zahlreichen Studien von der Genetik zur Toxikologie verwendet. Als Ergebnis der 1 mm Größe, Generationszeit von vier Tagen Kultivierung einfache schnelle und große Zahlen Nachkommen haben diese Nematoden in einer Reihe von pharmakologischen und genetischen Bildschirme 1, 2 verwendet wurden. Forscher nutzen diese Wurm-Moleküle und Signalwege in Wirbelsysteme erhalten zu identifizieren. Diese Wege sind Zelltod-Signale, Wege des Alterns und der Stoffwechsel und das Nervensystem 6.3. Zusätzlich wird die Transparenz der C elegans können für die Erzeugung von transgenen Linien mit fluoreszierenden Reporter-Proteins, die direkt sichtbar ist, um die Genexpression und Proteinlokalisation Muster analysieren.
In vielen Studien auf einem festen Agar-basierte Oberfläche mit Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten oder in l dieser Nematoden gezüchtetiquid Kulturen ausgesät mit Escherichia coli als Nahrungsquelle 7,8. Diese bakteriellen Nahrungsquellen können biochemischen und toxikologischen Studien mit Störungen von bakteriellen Nebenprodukten, die die Interpretation der Ergebnisse zu verwechseln. Um diese Effekte zu vermeiden Compoundierung, C. elegans kann in einer keimfreien flüssigen Medien, die frei von Bakterien als Nahrungsquelle kultiviert werden. Mit Hilfe dieser Medien, erfolgreich wir Millionen von hochsynchrone Würmer für viele Standard-C kultiviert elegans Protokolle wie Microarray-Analyse von differentiell regulierten Gene in C. elegans ausgesetzt, um verschiedene Häm-Konzentrationen und Herstellung von transgenen Würmer Verwendung von Gen-Bombardement. Dieses Medium ist chemisch definiert und von einem Original-Rezept von Dr. Eric Clegg 9 formuliert modifiziert. Mit dieser mCeHR Medien, haben wir erfolgreich Gene in Häm-Homöostase beteiligt identifiziert, die als Häm-responsive Gene (HRG n) 10, was wärewurden nicht in regulären Wachstumsbedingungen, die NGM-Agar-Platten mit E. ausgesät nutzen möglich coli.
In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Einführung und Beibehaltung C. elegans auf E. gewachsen coli auf die axenischen mCeHR und nutzen diese Methode, um eine große Anzahl von Würmern zur Herstellung von transgenen C zu erhalten elegans Linien mit Mikropartikelbeschuss. Außerdem präsentieren wir Studien, die den Nutzen der Verwendung axenischen Medien für die Bestimmung der Nährstoffbedarf von C. zeigen elegans mit Häm als Beispiel. Diese Studien zeigen, dass die Verwendung mCeHR Medien ermöglicht schnelle Wachstum von einer großen Anzahl von C elegans für viele Forscher von Wurm genutzt Downstream-Anwendungen.
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Protocol
1. Worm Stämme
- Erhalten C. elegans Wildtyp N2 Bristol-Sorten von Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) und halten sie auf NGM-Platten ausgesät mit E. coli-Stamm OP50 7. Hinweis: Transgene Wurm Stämme IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) verwendet wurden, wie zuvor beschrieben, erzeugt 11. IQ6011 können aus dem entsprechenden Autor angefordert werden.
2. Herstellung des modifizierten C elegans Wohn-und Reproduktion Medium (mCeHR)
Bereiten mCeHR flüssigen Medien wie unten 12 beschrieben. Diese axenischen flüssigen Medien können die Würmer ohne zusätzliche Nahrungsquellen wachsen. Führen Sie alle Manipulationen axenischen flüssigen Medien und axenischen Würmer mit streng sterilen Bedingungen, wie einer Steril.
- Erhalten Ultra pasteurisierte fettfreie Milch aus einem Lebensmittelgeschäft. Verwenden Sie die Kühl proKanal und nicht die Raumtemperatur Produkt. Vor der in mCeHR Medium, streifen verwenden Sie die Milch auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platten und Inkubation für 3 Tage bei 30 ° C und 37 ° C, um die Sterilität zu überprüfen. Bringen Sie die Milch auf 50 ml sterilen Röhrchen und bei -80 ° C
- Bereiten Sie jede der folgenden Komponenten kombinieren und in der Reihenfolge und Mengen gegeben, um 1 l mCeHR vorbereiten (Tabelle 1A): 10 ml 2 mM Cholin Disäure Citrat, 10 ml Vitamin-und Wachstumsfaktor-Mix (siehe Rezept in Tabelle 1B), 10 ml von 2,4 mM myo-Inositol, 10 ml 2 mM Hämin Chlorid, 250 ml deionisiertes Wasser. Bewerben Absaug-und Filter durch ein 0,22 um Filtereinheit.
- 20 ml der Nukleinsäuremischung (Rezeptur in Tabelle 1C) wurden 100 ml Mineralmischung (Rezeptur in Tabelle 1D), 20 ml 170 mg / ml Lactalbumin-Hydrolysat, 20 ml essentielle Aminosäuren, 10 ml nicht-essentiellen Aminosäuren Säuren mit 20 ml 450 mM KH 2 PO 4,50 ml von 1,45 M D-Glucose, 10 ml 1 M HEPES, Natriumsalz, 250 ml entionisiertem Wasser.
- Absaugen zu filtern sterilisieren der Komponenten. Entfernen Sie den Filter und 1 ml 5 mg / ml Cholesterin. Sicherzustellen, dass der pH-Wert des Mediums beträgt etwa 6-6,5. Anmerkung: Diese Lösung kann bei -80 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden.
- Mit 20% (v / v) organische Ultra pasteurisierte Magermilch auf die mCeHR Medium vor der Verwendung. Verwenden Sie gewissenhaft steriler Technik (zum Beispiel in einer Steril) beim Öffnen und Aliquotierung die Milch. Lagern Sie das Material bei 4 ° C
3. Bereiten C. elegans für die Kultur in Axenic mCeHR Flüssigmedium
- Wachsen Würmer auf zehn 60 mm NGM-Platten, bis es viele graviden Würmer und eine minimale Menge an OP50 E. coli auf den Platten.
- Entfernen Sie die Würmer von jeder Platte durch Spülen mit 5 ml M9-Puffer (Rezept in Tabelle 1F), und verbinden in einem 50 ml konischen Röhrchen.
- Lassen Sie die Würmer zu sEttle, indem man das Rohr auf 5 bis 10 Minuten stehen dann vorsichtig den Überstand mit dem E. coli.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 2x so viel von den restlichen Bakterien wie möglich vor der Fortsetzung des Verfahrens zu entfernen.
- Resuspendieren der Würmer in 0,1 N NaCl in einem Volumen, das ein Vielfaches von drei ist, beispielsweise 1,5 ml, 3 ml oder 6 ml in denen einzelne Würmer in dem Rohr zu erkennen.
- Bleichen die Würmer durch Zugabe von 5 N NaOH und 5% Natriumhypochlorit (Bleichmittel)-Lösung in einem Verhältnis zum 01.02.06 Wurm Federung. Beispielsweise 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% Natriumhypochlorit: 6 ml des Schnecken Suspension. Mischen Sie die NaOH und Bleichmittel, bevor Sie mit der Schnecken Federung.
- Wirbel die Lösung kräftig, bis graviden Würmer gelöst und nur Eier in der Suspension (etwa 5 bis 10 min) sichtbar sind. Beobachtung des Prozesses unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops mit einem 10X-Objektiv.
- Nachdem die Würmer vollständig gelöst, die sofort zu pelletierenEier bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und spülen das Pellet zweimal mit 10 ml sterilem Wasser durch Zentrifugieren des Pellets bei 800 × g für 45 sec bei 4 ° C.
- Nach dem Bleichen das Ei übertragen Pellets in ein 25 cm 2-Gewebekulturkolben mit 10 ml mCeHR Medien mit 100 ug / ml Tetracyclin ergänzt. Führen Sie diesen Vorgang mit sterilen Techniken. Wenn gewünscht, fügen Sie zusätzliche Antibiotika, darunter 250 ug / ml Nalidixinsäure, um das Bakterienwachstum in den axenischen Flüssigkulturen zu verhindern.
- Flüssigkulturen bei 20 ° C inkubieren auf einem Schüttelinkubator bei etwa 70 Umdrehungen pro Minute.
- Überprüfen Sie die Würmer täglich zu beachten die Phase der Entwicklung und der Wachstumsrate.
Hinweis: Worms wird zunächst langsam wachsen und erfordern 7 bis 10 Tage, um trächtig zu werden. Da die Würmer akklimatisieren zu dem flüssigen Medium der Erzeugungszeit wird auf etwa 4 Tage Wildtyp (N2) Würmer verringern. - Nachdem die Würmer Entwickelt, um der schwangeren Bühne in flüssigen Medien, übertragen den Wurm Kultur zu einem konischen Rohr und Pellet die Würmer bei 800 g für 5 min bei 4 ° C mit einem Ausschwingrotor.
- Entfernen des Überstandes und vorsichtig resuspendieren Schnecken Pellet in einem gleichen Volumen von 0,1 M NaCl. Verwenden Sie beispielsweise 10 ml 0,1 M NaCl für Würmer in 10 ml mCeHR kultiviert. Lassen Sie die Würmer für 5 min auf Eis zu begleichen.
- Führen Sie die Schritte wie oben in 3.5-3.8 beschriebenen Bleichverfahren und ermöglichen die Würmer, für eine zweite Generation in den axenischen flüssigen Medien wachsen. Falls erforderlich, das Antibiotikum wieder um das Bakterienwachstum zu hemmen.
- Auch hier ermöglichen die Würmer zu gravid werden dann Pellet resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl wie in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben, dann wieder wie in den Schritten bleichen 3.5-3.8 beschrieben, um eine synchronisierte Bevölkerung zu produzieren. Wachsen die L1-Larven Würmer in flüssigen Medien ohne Antibiotika von nun an.
4. Synchronisieren von Worms aus FlüssigKultur
- Pellet zu resuspendieren und die Würmer in 0,1 M NaCl, wie oben in den Schritten 3.12 und 3.13 beschrieben. Bleach, wie oben beschrieben, in Schritten von 3,5 bis 3,8.
- Resuspendieren Sie das Ei Pellet in 10 ml M9-Puffer und damit die Larven zu O / N bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform Schüttler schlüpfen. Hinweis: Die Eier werden in die L1-Larven schlüpfen, wird aber nicht weiter zu entwickeln, die Synchronisation der Würmer an der L1 Bühne.
- Zur Erhaltung und Subkultur Würmer, Pellet-L1-Larven bei 800 g für 5 min, dann wieder zu suspendieren die Larven in 10 ml mCeHR und in ein 25 cm 2-Kolben. Ermöglichen die Würmer bei 20 ° C auf einer rotierenden Plattform wächst. Aufrechterhaltung einer maximalen Dichte von 3,000 Würmern / ml / cm 2, um eine angemessene Ernährung für die Würmer zu gewährleisten.
Anmerkung: In diesem Stadium werden Antibiotika nicht erforderlich axenischen Bedingungen aufrechtzuerhalten, wenn die Verfahren unter Verwendung steriler Techniken in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt. Worms sollte täglich überwacht, um das Wachstum überprüft werden.
5. Freiezing und Auftauen Worms für Axenic Medium Kulturen
- Frieren axenischen asynchrone Wurm Kulturen oder synchronisiert L1-Larven in flüssigem Stickstoff. Pellet Würmer bei 800 × g für 5 min, dann in S-Puffer resuspendieren (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146,25 mM NaCl) unter Verwendung von 0,5 ml pro Ampulle. Gleiches Volumen von S-Puffer mit 30% v / v Glycerin zu jedem Fläschchen und übertragen die Würmer bis -80 ° C, bevor langfristige Lagerung in flüssigem N 2. Einfrieren etwa 1 x 10 &sup6; Würmer pro ml in jeder Flasche.
- Auftauen Würmer durch Inkubation der Röhrchen bei 37 ° C für ca. 2 min, bis fast die gesamte Eis geschmolzen ist. In einer Steril, übertragen Sie die Würmer in einen sterilen Kolben mit mCeHR und legen sie bei 20 ° C
6. Bestimmen Sie die Wirkung von Hämin Konzentration auf Wachstum und Reproduktion mCeHR
- Verwenden axenischen mCeHR Medien Nährstoff abhängige Wachstum von C. Assay elegans. Zur Bestimmung der Wirkung of Hämin Konzentration auf Wurm Wachstum und Entwicklung, verwenden synchronisiert axenischen N2 Würmer oder andere Stämme von Interesse. Synchronisieren L1-Larven, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Am folgenden Tag, Pellet-und L1-Larven zählen synchronisiert und mit Wasser auf ein Wurm pro ul axenischen Medien. Machen Sie 10 mM Häminchlorid in 0,3 M NH 4 OH und auf pH 8 mit konzentrierter HCl.
- In 800 ul mCeHR Medien zu einem 24-Well-Platte. Mit 100 Würmer in jede Vertiefung in 100 ul Medium. Hinzufügen Häminchlorid zu jeder Vertiefung in Konzentrationen im Bereich von 0 &mgr; M, 1,5 &mgr; M bis 1,000 &mgr; M in dreifacher Ausführung. Sicherzustellen, dass alle Vertiefungen die gleiche Konzentration von 0,3 M NH 4 OH. Vorsichtig resuspendiert die Würmer vor dem Pipettieren, um sicherzustellen, dass 100 L1-Larven werden in jede Vertiefung gegeben.
- Untersuchen Sie die Würmer täglich, und beachten Sie das Wachstum in jeder Konzentration in jede Vertiefung. Zähle die Anzahl der Würmer nach 9 Tagen Inkubation und zeichnen die Anzahl der Würmer / ml, die jedem HämKonzentration (Abbildung 1).
7. Wirkung von Hämin Konzentration auf Häm-Sensor Worms
- Inkubieren synchronisiert L1 Häm Sensor Würmer (Phrg-1 :: gfp) in mCeHR enthaltend 4 &mgr; M, 8 &mgr; M, 10 &mgr; M und 20 &mgr; M Hämin.
- Bild die Würmer mittels Fluoreszenz der konfokalen Mikroskopie, 48 Stunden nach der Inkubation (Abbildung 2).
8. Verwendung mCeHR transgene C. generieren elegans Mit Mikropartikelbeschuss
Hinweis: Das Verfahren zur Erstellung und Durchführung von Mikropartikelbeschuss mit unc-119 (ed3) Würmer in mCeHR gewachsen ist in Abbildung 3 13 skizziert.
- Worm Vorbereitung
- Übertragen etwa 1 x 10 6 asynchronen unc-119 (ED3) Würmer in 90 ml mCeHR Medien in einer 175 cm 2-Kolben eine Woche vor der Bombardierung. Lassen Sie die Würmer bei 20 ° C o wachsenna Schüttelplattform bei ~ 70 min (Abbildung 3-1).
Hinweis: Eine Woche später, sollte der Wurm Dichte deutlich größer mit vielen Erwachsenen trächtige Würmer sein. Etwa 3 × 10 7 Würmer für Mikroteilchenbeschuß erforderlich. - Gefühlt JM109 E. coli ausgesät 10 cm NGM-Platten auf Eis.
- Übertragen Sie die axenischen Würmer, zwei 50 ml konische Röhrchen zentrifugiert und die Würmer bei 800 g für 2 min. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Würmer in jedem Röhrchen in 50 ml M9-Puffer (Fig. 3-2).
- Ermöglichen die erwachsenen Würmer durch die Schwerkraft für 10 bis 15 min auf Eis zu pelletieren.
Hinweis: Die 2 ml Pellet sollte jetzt> 90% erwachsenen Würmer. Diese 2 ml Pellet sollte etwa 5 x 10 &sup6; Würmer und reicht für eine Mikropartikelbeschuss. - Bestreichen Sie die gesamte Oberfläche des Kühl JM109 ausgesät NGM Platte mit der 2 ml Pellet von Würmern. Lassen Sie die vollständig absorbiert werden Flüssigkeit verlassen dann die Plattefür 30 min auf Eis, bevor Sie fortfahren (Abbildung 3-3).
- Übertragen etwa 1 x 10 6 asynchronen unc-119 (ED3) Würmer in 90 ml mCeHR Medien in einer 175 cm 2-Kolben eine Woche vor der Bombardierung. Lassen Sie die Würmer bei 20 ° C o wachsenna Schüttelplattform bei ~ 70 min (Abbildung 3-1).
- Herstellung von Goldpartikeln
- Wiegen Sie 30 mg Goldpartikel in einem silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. 1 ml 70% Ethanol und das Röhrchen vortexen für 5 min.
- Ermöglichen die Röhre für 15 Minuten sitzen, dann Zentrifugieren bei 6.000 × g für 10 s, um die Goldpartikel zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze durch vorsichtiges Berühren der Spitze an der Seite der Röhre gegenüber den Goldpartikeln.
- Waschen Sie die Goldpartikel mit 1 ml steriles Wasser, Wirbel für 1 min und kurz zentrifugieren bei 6.000 g für 10 Sekunden. Wiederholen der Waschschritt zweimal, dann Resuspendieren der Goldpartikel in 0,5 ml sterilem 50% Glycerin.
Hinweis: Die Endkonzentration der Goldpartikel werden 60 mg / ml und es kann für 1 bis 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden
- Bereiten Sie die DNA-Gold-Partikel-Mix
- Mähdrescher 10 &mgr; g der gewünschten Plasmid-DNA mit 10 und# 956; g des unc-119 Rettungs Plasmid in einem silikonisierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 50 ul DI-Wasser und 100 ul gut resuspendiert Goldpartikellösung dann Wirbel für 1 min.
- In 150 ul 2,5 M CaCl 2 und verwirbeln die Lösung erneut für 1 min. Zu dieser Lösung wurden mit 60 ul 0,1 M Spermidin und Wirbel für 3 bis 5 min.
- Pulszentrifugieren Lösung bei 6.000 g für 10 sec, den Überstand und 300 ul 70% Ethanol. Vortex gut für 1 min, Puls-Zentrifuge bei 6.000 xg, den Überstand und resuspendieren in 170 ul von 100% Ethanol. Kräftig vortexen die Lösung für 5 bis 10 min Puls dann Zentrifuge und den Überstand entfernen.
- Bombardierung (Abbildung 3-3)
Hinweis: Dieses Protokoll wird mit der in der Tabelle der Materialien / Ausrüstung angegebene Partikelliefersystem durchgeführt. Folgen Sie den Anweisungen für die Partikelliefer Instrument zur Verfügung.- <li> Legen Sie ein Blatt Seidenpapier in einen 15 cm Teller. Mit einer Pinzette, tauchen sieben Makrocarrier einzeln in 100% Ethanol und legen sie auf das Gewebe zu trocknen.
- Gründlich biolistischer Kammer, Macrocarrier Halter und Zieltafel mit 70% Ethanol reinigen. Reinigen und Autoklavieren die Bildschirme vor jedem Anhalten Bombardement Verfahren.
- Laden Sie die macrocarrriers in die Halterung mit einer Pinzette und drücken in die Halterung mit der Sitz Tool.
- Gleichmäßig verteilt 20 ul der DNA-beschichteten Goldpartikel in der Mitte jedes Macrocarrier und die Lösung dann vollständig trocknen.
- Reinigen Sie die beiden Teile des Druckteiler mit Ethanol und montieren mit Ethanol gereinigt Berstscheiben. Schrauben Sie die Druckteiler montiert und Berstscheiben in der Bombardierung Kammer.
- Bauen Sie eine autoklaviert Anhalten Bildschirm mit der Macrocarrier Halter und legen Sie das Gerät auf den Metallboden erforderlich und einrasten.
- Legen Sie die zusammengebauten macrocarrier Vorrichtung in den biolistischer Kammer in der vorgesehenen Schlitz unterhalb des Druckteiler und richten Sie mit der Druckteiler.
- Kleben Sie die offenen NGM-Platte mit den Würmern auf der Zielplatte Regal und schließen Sie die Tür der Kammer.
- Um Würmer zu bombardieren, den Druck auf, was benötigt, um die Berstscheiben brechen. Schalten Sie die Vakuum bis 28 Zoll Hg Druck, und drücken Sie den Feuerknopf, bis die Scheiben bersten.
- Lassen Sie die Vakuum und entfernen Sie die NGM-Platte aus dem Gerät. Waschen Sie die Würmer von der Platte und verteilen in zwanzig 10 cm NGM-Platten mit JM109 E. ausgesät coli (Abbildung 3-4).
- Ermöglichen die Würmer über 10 bis 14 Tage bei 25 ° C wachsen und verhungern die Platten. Worms aus dem unc-119 Defekt gerettet werden normale Bewegung haben und in dieser Zeit identifiziert werden. Wählen Sie mindestens 10 "Wildtyp" Würmer aus getrennten Platten für die weitere Analyse wie diese stellen unabhängigen transgenen Linien (FigurE 3-5).
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Representative Results
Kultivierung C. elegans in flüssigem Medium axenic Hilfsmittel bei der Bestimmung von Nährstoffen, die von Würmern erforderlich sind, ohne Störung durch von E. sekundäre Stoffwechselprodukte coli. Wildtyp N2 Würmer zu akklimatisieren mCeHR Medien innerhalb von drei Generationen und zeigen Wachstum vergleichbar Würmer auf NGM Bakterienplatten gewachsen. In der Tat, diese Würmer geworden schwangeren innerhalb von 4 Tagen im Vergleich zu 3,5 Tage für Würmer auf OP50 Bakterien gewachsen.
Ein Vorteil der Verwendung mCeHR wurde in Studien, die den genauen Nährstoffbedarf dieser Würmer untersuchten 14 gesehen. In Fig. 1 wurden Würmer in mCeHR gezüchtet, mit steigenden Mengen von Häm, bis zu 1 mm. Beobachtungen dieser Würmer zeigten eine deutliche Verzögerung bei Wachstum bei Häm-Konzentrationen unter 4 um, mit Würmern zu entwickeln, um den L4 Larvenstadium, aber nicht mit dem schwangeren Stufe nach neun Tagen in mCeHR Fortschritt. Bei Konzentrationen von 10 &mgr; M und 2056, M Häm die Würmer zu entwickeln, um der schwangeren Stufe 4 Tage und produzieren große Zahl von Nachkommen. Eine maximale Anzahl von Nachkommen wurde gesehen, wenn Würmer wurden in mCeHR gewachsen mit 20 uM Häm. Worms weiter auf 100 um und 500 um Häm entwickeln und produzieren Nachkommen. Jedoch ist die Anzahl der Larven Nachkommen signifikant im Vergleich zu Würmern bei der optimalen Häm-Konzentration von 20 &mgr; M Häm gewachsen gesunken. Häm-Konzentrationen bei oder über 800 uM ergab verkümmerten, kränklich Würmer an der L3-Larvenstadium, die ergab, dass diese Häm-Konzentrationen waren toxisch für die Würmer.
Neben der Bestimmung der optimalen Häm-Konzentration und der Wirkung von Häm und Häm Entzug Toxizität auf C. elegans Wachstum könnte Häm-Reporter-Stämme verwendet werden, um in einem kleineren Konzentrationsbereich indirekt beurteilen die Häm-Status des Wurms. Die IQ6011 Wurm ist ein Wurm, der eine transgene Häm reagierende Transkriptions Reporter drückt, P-1 hrg Fig. 2 zu sehen. Wird GFP-Expression bei 20 &mgr; M Häm drückt und steigt, wenn die Häm-Konzentration verringert wird. Die inkrementelle Änderungen in Häm-Konzentration genau mit Gen-Antwort und Ausdruck in mCeHR Medien korreliert werden.
Zusätzlich zu der Möglichkeit, sorgfältig zu steuern, Nährstoffkonzentrationen auf die Schnecke vorgesehen ist, ermöglicht die effiziente Entwicklung von einer Vielzahl von synchronisierten Würmer mCeHR axenischen Medien. Diese Funktion kann für Mikropartikelbeschuss (Abbildung 3) ausgenutzt werden. Mit diesem Verfahren mindestens eine integrierte Linie wurden aus jedem Mikropartikelbeschuss durchgeführt (Tabelle 2) entwickelt.
1. C elegans Häm Wachstumskurve. Würmer wurden in einem Bereich von Häm-Konzentration von 0 &mgr; M bis 1,000 &mgr; M in mCeHR 9 Tage lang gezüchtet. Die Anzahl der Würmer in jeder Konzentration wurden gezählt und aufgezeichnet. Bei 1,5 uM Häm-Konzentrationen waren Würmer L4 und unfähig, weiter zu entwickeln. Bei 800 uM Häm wurden die Würmer bei L2-L3 Stufen verkümmert und zeigte Wirkung von Häm Toxizität.
Abbildung 2. Reaktion von Häm-Sensor (Phrg-1 :: GFP)-Stamm, verschiedene Häm-Konzentrationen in mCeHR. Synchronisierte transgenen C. elegans exprimiert HRG-1 :: GFP wurden in mCeHR Medien, ergänzt mit 4, 8, 10 oder 20 &mgr; M Häm für 48 Stunden gezüchtet. Die Bilder wurden mit einem Zeiss LSM 710 confoca genommenl Mikroskop. Maßstab ist 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Schematische Darstellung der Mikropartikelbeschuss in C. elegans mit unc-119 Würmer in mCeHR gewachsen. (1) ca. 3 x 10 7 unc-119 (ed3) Würmer werden in 90 ml mCeHR Medien gewachsen. (2) Gravids wurden auf Eis für 10-15 min in 50 ml konische Röhrchen zu begleichen. (3) Eine 2 ml Pellet von ca. 5 x 10 6 trächtige Würmer gleichmäßig auf eine ungesetzte NGM Platte verteilt. Die Würmer wurden mit 12 ug Plasmid von Interesse und 6 ug unc-119 Rettungs Plasmid-Komplex mit Goldpartikeln beschossen. (4) Ter bombardiert Würmer wurden auf zwanzig 10 cm Platten mit dem E. ausgesät aufgeteilt coli-Stamm JM109. (5) Nach 2 Wochen Inkubation bei 25 ° C, wurden die Platten mit Wildtyp-Würmer für die Analyse der Transgen-Expression Stärke und Segregation Raten ausgewählt.
| Tabelle 1A | |
| CEHR, 1 L | |
| Mit einer sterilen Technik und einem 1 L (0,22 um) Vakuum-Filtereinheit, filtern Sie die folgenden Volumina der Stammlösungen und Wasser in der beschriebenen Reihenfolge. | |
| Cholin Disäure Citrat | 10 ml |
| Vitamin-und Wachstumsfaktor-Mischung | 10 ml |
| myo-Inositol | 10 ml |
| Häminchlorid | 10 ml |
| VE-Wasser | 250 ml |
| Nukleinsäure-Mix | 20 ml |
| Mineral-Mix | 100 ml |
| Lactalbumin-Hydrolysat | 20 ml |
| Essentielle Aminosäure Mix | 20 ml |
| Nicht-essentielle Aminosäure-Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-Glucose | 50 ml |
| HEPES, Natriumsalz | 10 ml |
| VE-Wasser | 250 ml |
| Volume 800 ml wird an dieser Stelle Entfernen Sie Filtereinheit von Vakuum dann hinzu: | |
| Cholesterin | 1 ml |
| Ultra pasteurisierte Magermilch | 200 ml |
| Tabelle 1B | |
| Vitamin-und Wachstumsfaktor-Mischung, 100 ml | |
| Lösung 1: Zu 60 ml Wasser hinzufügen: | |
| N-Acetyl-α-D-glucosamin | 0,15 g |
| DL-Alanin | 0,15 g |
| Nicotinamid | 0,075 g |
| D-Pantethin | 0,0375 g |
| DL-Pantothensäure, Hemicalciumsalz | 0,075 g |
| Folsäure | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCl | 0,0375 g |
| Pyridoxin HCl | 0,075 g |
| Flavinmononucleotid, Natriumsalz | 0,075 g |
| Thiamin-Hydrochlorid | 0,075 g |
| Lösung 2: Bereiten Sie die folgenden Chemikalien in 5 ml 1 N KOH: | |
| p-Aminobenzoesäure | 0,075 g |
| D-Biotin | 0,0375 g |
| Cyanocobalamin (B12) | 0,0375 g |
| Folinsäure, Calciumsalz | 0,0375 g |
| Nicotinsäure | 0,075 g |
| Pyridoxal-5-phosphat | 0,0375 g |
| Lösung 3: 0,0375 g (±)-L-α-Liponsäure, oxidierte Form in 1 ml Ethanol: | |
| Kombinieren Lösungen 1, 2 und 3 zu bringen und das Endvolumen auf 100 ml. Shop im Dunkeln bei 4 ° C oder einfrieren Aliquots bei -20 ° C. Machen Sie kleine Vorratsmengen für diese Mischung so schnell verwendet. | |
| Tabelle 1C | |
| Nukleinsäure-Mischung, 100 ml | |
| Zu 60 ml Wasser hinzufügen: | |
| Adenosin-5'-Monophosphat-, Natriumsalz | 1,74 g |
| Cytidin 5 "-Phosphat- | 1,84 g |
| Guanosin-2 '- und 3'-Monophosphat | 1,82 g |
| ODER | |
| Guanosin-5'-phosphat | 2,04 g |
| Uridin-5'-phosphat Dinatriumsalz | 1,84 g |
| Thymin (Add letzte) | 0,63 g |
| Bringen Lösung auf 100 ml und speichern im Dunkeln bei 4 ° C oder einfrieren Aliquots bei -20 ° C. Machen Sie kleine Vorratsmengen für diese Mischung so schnell verwendet. | |
| Mineral-Mischung, 1 L | |
| MgCl 2 • 6H 2 O | 4,1 g |
| Natrium-Citrat | 2,9 g |
| Kalium-Citrat-Monohydrat | 4,9 g |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl 2 | 0,1 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O | 0,6 g |
| CaCl 2 • 2H 2 O (immer hinzufügen, letzte) | 0,2 g |
| Machen Sie kleine Vorratsmengen für diese Mischung so schnell verwendet. | |
| Weitere Komponenten | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Cholin-Di-Säure-Citrat | 2 mM |
| myo-Inositol | 2,4 mM |
| D-Glucose | 1,45 M |
| Häminchlorid | 2 mM in 0,1 N NaOH, pH 8,0, |
| HEPES, Natriumsalz | 1 M Stammlösung |
| Cholesterin | 5 mg / ml in Ethanol |
| Lactalbumin enzymatischen Hydrolysat | 170 mg / ml |
| Tabelle 1F | |
| M9-Puffer, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H 2 O | 1 L |
| Autoklav 30 min | |
| 1 M MgSO4 (steril) | 1 ml |
Tabelle 1 Rezepte. Für Komponenten von mCeHR und mCeHR.
| Beschuss | Linien mit Wildtyp-Rettungs | Linien mit Rettungs / Transgen | Stabile Linien |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Durchschnitt | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tabelle 2. Average Anzahl von transgenen C. elegans, die unter Verwendung Mikropartikelbeschuss.
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Discussion
In diesem Protokoll präsentieren wir eine modifizierte axenischen flüssigen Medien, die für eine schnelle mCeHR C erlaubt elegans Generation mit der Produktion einer großen Anzahl von Würmern. Dieses Bild zeigt mehrere Vorteile, wie die Würmer ohne Kontamination E. gewachsen coli oder bakteriellen Nebenprodukten und in Ernährungs-und toxikologischen Untersuchungen genutzt werden. Die Verwendung von E. coli oder anderen Bakterien in solchen Studien hat mehrere Nachteile. Zum Beispiel kann das Wachstum der Bakterien unter verschiedenen Bedingungen zu ändern und die Bakterien können Moleküle, die untersucht werden verstoffwechseln, verwechseln die Interpretation der Ergebnisse. Daher ist die Entwicklung eines definierten Mediums, um diese Tests durch sehr vorteilhaft.
Obwohl C. elegans haben in flüssigen Medien in früheren Studien 15, Würmer in der C kultiviert angebaut elegans Erhaltungsmedium (CeMM) zeigen eine deutliche Verzögerung in der Generation 16-mal, anders als das, was wir Observe in mCeHR Medium. Unser Hauptziel war es, C. nutzen elegans Nährstoff Homöostase mit besonderem Akzent auf die Häm-und Metallstoffwechsel zu untersuchen. In diesem Sinne, mCeHR und Modifikationen von unserer Gruppe erzeugt dieses Ziel zu erreichen, und ist direkt mit der Identifizierung einer Reihe von Genen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase Häm in der Schnecke und letztendlich in Wirbeltiermodellsysteme 17, 18 geführt erforderlich. Umformuliert mCeHR-1-Medien können auch für andere Nematodenarten einschließlich Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila und C ausgenutzt werden remanei. Neben niedrigen Metall Formulierungen mCeHR-2-und-3 kann mCeHR in Studien, Schwermetallvergiftung und Anforderungen 12 genutzt werden.
Vor der Eingewöhnungs N2 Würmer weisen eine längere Generationszeit von etwa 7 bis 10 Tage in mCeHR Medien. Wie die Würmer subkultiviert werden, nimmt dieser Erzeugungszeit bis 4 Tage, ähnlich der Schnecken auf OP5 gezüchtet0 Bakterien. Allerdings kann die Generationszeit mehr für bestimmte mutierte Würmer sein, plausibel, weil der Fehler in der Fütterung, Bewegung oder besondere ernährungsphysiologische Bedürfnisse.
Bei der Verwendung von keimfreien flüssigen Medien ist es wichtig, dass anspruchsvolle sterile Techniken verwendet werden. Üblicherweise wird die Verwendung von Antibiotika minimiert und schließlich eliminiert die Würmer akklimatisieren dem Medium und die restlichen Bakterien eliminiert. Antibiotika werden zunächst erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kulturen sind, wenn axenischen etabliert, denn sie verhindert das Wachstum von Bakterien, die die Rest Wurm Kulturen überwältigen können. Nach zwei aufeinanderfolgenden Runden der Bleich werden Antibiotika aus den Kulturen die kontinuierliche Verwendung von Antibiotika verzichtet nur Masken Armen aseptischen Techniken, die für wachsende Würmer axenisch. Unter Verwendung dieser Techniken in einer Sterilbank sind die Autoren konnten die Würmer wachsen axenisch ohne Kontamination. Zusätzlich ordnungsgemäße Lagerung der med.ia und Komponenten ist für Wurm Wartung und Wachstum. Die Würmer sollte die Wachstumsrate überprüft und subkultiviert, um die Verdrängung, die Dauer Bildung führen kann als essentielle Nährstoffe erschöpft sind zu vermeiden. Dies kann durch Sicherstellung, daß die Dichte ist 3,000 Würmer Würmer / ml / cm 2 nicht übersteigt, verhindert werden. Forscher, die neue wachsende C sind elegans kann axenisch dies zu erreichen, indem die Würmer täglich und die Würmer zählen wöchentlich.
C. elegans Forscher nutzen Sie die transparenten Eigenschaften durch transgene Würmer ausdrücken fluoreszenzmarkierten Markern, die für die Visualisierung der Genexpression und Proteinlokalisierung ermöglichen. Mit Hilfe biolistischer Bombardierung für Generation von Low Integranten, die die Fragen der extra-Arrays und erhöhte Genexpression vermieden erlaubt stellte mit Transgenen im Spritzguss 19 erzeugt. Zuvor ein Nachteil der Erzeugung von Transgenen mitMikropartikelbeschuss von C. elegans war die Anforderung für Eierplatte Vorbereitung, um die große Anzahl von unc-119 (ed3) Würmer für das Verfahren notwendigen 20 zu generieren. Jede Transformation erforderlich Ei Platten 20 für die Anzahl der Würmer benötigt. Mit axenischen mCeHR Flüssigkultur ermöglicht eine effizientere Wachstum und in der Folge mehr Würmer für Bombardierungen. Zusätzlich können Bombardements in Verbindung mit Medikamentenauswahl verwendet werden, um zu vermeiden, mit unc-119 (ed3) 21 Würmer.
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Disclosures
Die Autoren erklären, gibt es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of HealthGrants DK85035 und DK074797 (IH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
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