Die Züchtung Caenorhabditis elegans In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

Zusammenfassung

C. elegans ist in der Regel auf festen Agarplatten oder in Flüssigkulturen ausgesät mit E. coli. Um bakterielle Nebenprodukte aus Verwechslung toxikologischen und Ernährungsstudien zu verhindern, verwendeten wir eine axenischen flüssigen Medium, CEHR, um für eine Reihe von nachgelagerten Anwendungen wachsen und synchronisieren Sie eine große Anzahl von Würmern.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll stellen wir die benötigten Materialien und das Verfahren zur Herstellung von modifizierten C. E legans Gewöhnung und Wiedergabemedien (mCeHR). Darüber hinaus sind die Schritte zum Belichten Akklimatisierung und C. elegans auf E. gewachsen coli, um flüssige Medien axenischen beschrieben. Schließlich abwärts Experimente, die axenischen C nutzen elegans veranschaulichen die Vorteile dieses Verfahrens. Die Fähigkeit, zu analysieren und festzustellen, C. elegans Nährstoffbedarf wurde durch den Anbau von N2 Wildtyp-Würmer in axenischen flüssigen Medien mit unterschiedlichen Häm-Konzentrationen dargestellt. Dieses Verfahren kann mit anderen Nährstoffen repliziert werden, um die optimale Konzentration für Schnecken Wachstum und Entwicklung zu bestimmen, oder, um die toxikologischen Wirkungen von medizinischen Behandlungen zu bestimmen. Die Auswirkungen von verschiedenen Häm-Konzentrationen auf das Wachstum von Wildtyp-Würmer wurden durch qualitative mikroskopische Beobachtung und Quantifizierung von t bestimmter Anzahl der Würmer, die in jedem Häm-Konzentration wuchs. Zusätzlich kann die Wirkung von verschiedenen Nährstoffkonzentrationen durch Verwendung Würmer, Fluoreszenzsensoren, die auf Änderungen in den Nährstoff von Interesse reagieren auszudrücken getestet werden. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Würmern leicht zur Erzeugung von transgenen C. elegans mittels Mikropartikelbeschuss erzeugt.

Einleitung

Der Boden Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus in zahlreichen Studien von der Genetik zur Toxikologie verwendet. Als Ergebnis der 1 mm Größe, Generationszeit von vier Tagen Kultivierung einfache schnelle und große Zahlen Nachkommen haben diese Nematoden in einer Reihe von pharmakologischen und genetischen Bildschirme ^{1, 2} verwendet wurden. Forscher nutzen diese Wurm-Moleküle und Signalwege in Wirbelsysteme erhalten zu identifizieren. Diese Wege sind Zelltod-Signale, Wege des Alterns und der Stoffwechsel und das Nervensystem ^6.3. Zusätzlich wird die Transparenz der C elegans können für die E....

Protokoll

1. Worm Stämme

1. Erhalten C. elegans Wildtyp N2 Bristol-Sorten von Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) und halten sie auf NGM-Platten ausgesät mit E. coli-Stamm OP50 ^7. Hinweis: Transgene Wurm Stämme IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) verwendet wurden, wie zuvor beschrieben, erzeugt ^11. IQ6011 können aus dem entsprechenden Autor angefordert werden.

2. Herstellung des modifizierten C elegans Wohn-und Reproduktion Medium (mCeHR)

Bereiten mCeHR flüssigen Medien wie unten ¹² beschrieben. D....

Ergebnisse

Kultivierung C. elegans in flüssigem Medium axenic Hilfsmittel bei der Bestimmung von Nährstoffen, die von Würmern erforderlich sind, ohne Störung durch von E. sekundäre Stoffwechselprodukte coli. Wildtyp N2 Würmer zu akklimatisieren mCeHR Medien innerhalb von drei Generationen und zeigen Wachstum vergleichbar Würmer auf NGM Bakterienplatten gewachsen. In der Tat, diese Würmer geworden schwangeren innerhalb von 4 Tagen im Vergleich zu 3,5 Tage für Würmer auf OP50 Bakterien gewachsen.

Diskussion

In diesem Protokoll präsentieren wir eine modifizierte axenischen flüssigen Medien, die für eine schnelle mCeHR C erlaubt elegans Generation mit der Produktion einer großen Anzahl von Würmern. Dieses Bild zeigt mehrere Vorteile, wie die Würmer ohne Kontamination E. gewachsen coli oder bakteriellen Nebenprodukten und in Ernährungs-und toxikologischen Untersuchungen genutzt werden. Die Verwendung von E. coli oder anderen Bakterien in solchen Studien hat mehrere Nachteile. Zum B.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MgCl2• 6H2O	Sigma	M-2393
Natriumcitrat	Sigma	S-4641
Kaliumcitrat Monohydrat	Sigma	P-1722
CuCl2• 2H2O	Fisher	C455-500
MnCl2• 4H2O	Fisher	M87-100
ZnCl2	Sigma	Z-0152
Fe(NH4)2(SO4)2• 6H2O	Sigma	F-1018
CaCl2• 2H2	O Fisher	C70-500
Adenosin 5-monophosphat, Natriumsalz	Sigma	A-1752
Cytidin 5-phosphat	Sigma	C-1006
Guanosin 2' - und 3' -monophosphat	Sigma	G-8002
Uridin 5-phosphat, Dinatriumsalz	Sigma	U-6375
Thymin	Sigma	T0376
N-Acetylglucosamin	Sigma	A3286
DL-Alanin	Fisher	S25648
p-Aminobenzoesäure	Sigma	A-9878
Biotin	Sigma	B-4639
Cyanocobalamin (B-12)	Sigma	V-2876
Folinat (Ca)	Sigma	F-7878
Niacin	Sigma	N-0761
Niacinamid	Sigma	N-3376
Pantethein	Sigma	P-2125
Pantothenat (Ca)	Sigma	P-6292
Pteroylglutaminsäure (Folsäure)	ACRCS	21663-0100
Pyridoxal 5'-phosphat	Sigma	P-3657
Pyridoxamin 2HCl	Sigma	P-9158
Pyridoxin HCl	Sigma	P-6280
Riboflavin 5-PO4(Na)	Sigma	R-7774
Thiamin HCl	Sigma	T-1270
DL-6,8-Thioctsäure	Sigma	T-1395
KH2PO4	Sigma	P-5379
Cholindisäurecitrat	Sigma	C-2004
myo-Inositol	Sigma	I-5125
D-Glukose	Sigma	G-7520
Lactalbumin enzymatisches Hydrolysat	Sigma	L-9010
Gehirn Herz Infusion	BD	211065
Häminchlorid	Frontier Scientific	H651-9
HEPES, Natriumsalz	Sigma	H-3784
Cholesterin	J.T. Baker	F676-05
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren	Invitrogen	11140-076
MEM Aminosäuren Lösung	Invitrogen	11130-051
Nalidixinsäure Natriumsalz	Sigma	N4382
Tetracyclinhydrochlorid	MP Biomedicals	2194542
Biolistic Delivery System	BioRad	165-2257
Goldpartikel (Au-Pulver)	Ferro Electronic Material Systems	6420 2504, JZP01010KM
oder
Gold Particles 1,0 μ m	BioRad	Tel.: 165-2263