Summary
C. Элеганс обычно выращивают на твердых пластин агара или в жидких культурах затравку Е. палочка. Для предотвращения бактериальных побочных продуктов от оправдав токсикологические и пищевые исследования, мы использовали в аксенными жидкую среду, CeHR, расти и синхронизировать большое количество червей для целого ряда последующих применений.
Abstract
В этом протоколе, мы представляем необходимые материалы, а также порядок внесения модифицированный C. Электронные legans Привыкание и репродукции СМИ (mCeHR). Кроме того, шаги для выявления и акклиматизации C. Элеганс, выращенные на Е. палочка для аксенными жидких сред описаны. Наконец, ниже по течению эксперименты, которые используют аксенными C. Элеганс иллюстрации преимуществ этой процедуры. Умение анализировать и определять C. потребность организма Элеганс было проиллюстрировано растет N2 червей дикого типа в аксенными жидких сред с различными концентрациями гема. Эта процедура может быть воспроизведена с другими питательными веществами для определения оптимальной концентрации для роста и развития червячной или, для определения токсикологических эффектов лекарственной терапии. Эффекты различных концентраций гема на рост червей дикого типа были определены посредством качественного микроскопического наблюдения и путем количественного тон количество червей, которые росли в каждой концентрации гема. Кроме того, эффект от различных концентраций питательных веществ могут быть проанализированы с использованием червей, которые выражают флуоресцентные датчики, которые реагируют на изменения в питательных интересов. Кроме того, большое количество червей были легко получены для получения трансгенных C. Элеганс с использованием бомбардировки микрочастицами.
Introduction
Нематода почвы, Caenorhabditis Элеганс, является мощным модельным организмом используется в многочисленных исследованиях от генетики к токсикологии. В результате такого размера 1 мм, время быстрой генерации четырех дней, легкости культивирования, и большое количество потомства, эти нематоды были использованы в ряде генетических и фармакологических экранов 1, 2. Исследователи воспользоваться этим червем для идентификации молекул и пути консервативные позвоночных систем. Эти пути включают клеточной гибели сигналы, пути старения и метаболизма и нервную систему 3-6. Кроме того, прозрачность C. Элеганс позволяет для генерации трансгенных линиях с использованием флуоресцентного белка журналистам, которые могут быть непосредственно визуализировать проанализировать паттерны экспрессии генов и локализации белков.
Во многих исследованиях это нематода культивируют на твердой основе агара поверхности с помощью нематод роста среды (NGM) пластины или в лiquid культуры засевают кишечной палочки в качестве источника пищи 7,8. Эти бактериальные источники питания может поставить в тупик биохимические и токсикологических исследований с помехами от бактериальной побочных продуктов, влияющих на интерпретацию результатов. Для того чтобы избежать этих рецептуры эффекты, С. Элеганс можно культивировать в аксенными жидких, лишена бактерий как источника пищи. Использование этого носителя, мы успешно культивировали миллионы высоко синхронизированных червей для многих стандартных С. протоколы Элеганс включая микрочипов анализа дифференциально регулируемых генов в С. Элеганс воздействию различных концентраций гема, и производство трансгенных червей, использующих генную бомбардировку. Это СМИ химического состава и редактировался оригинальной рецептуре, сформулированной доктора Эрика Клегг 9. С помощью этого mCeHR носители, мы успешно идентифицированы гены, участвующие в гема гомеостаза, называют гем реагирующих генов (HRG ы) 10, который будетне удалось в обычных условиях роста, которые используют NGM агаром высевают с Е. палочка.
В этом протоколе описываются порядок введения и поддержания C. Элеганс, выращенные на Е. палочка с аксенными mCeHR и использовать этот метод, чтобы получить большое количество червей для получения трансгенного организма C. Элеганс линий с использованием бомбардировки микрочастицами. Мы также представляем исследования, которые показывают целесообразность использования аксенными СМИ для определения питательную требование С. Элеганс используя гем в качестве примера. Эти исследования показали, что использование mCeHR носитель позволяет для быстрого роста большого количества С. Элеганс для многих последующих применений, используемых червячных исследователей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Worm Штаммы
- Получить C. Элеганс дикого типа штаммов Бристоль N2 от генетики Центра Caenorhabditis (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) и поддерживать их на NGM пластин затравку Е. Штамм OP50 7. Примечание: Трансгенные червь штаммы IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) используется получали, как описано ранее 11. IQ6011 можно запросить из соответствующего автора.
2. Подготовка модифицированной С. Элеганс жилья и воспроизводство Средний (mCeHR)
Подготовка жидких сред mCeHR, как описано ниже 12. Это стерильный жидкие среды позволяет черви расти без каких-либо дополнительных источников питания. Выполняйте все манипуляции аксенными жидких сред и аксенными червей, использующих строго стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.
- Получить ультра пастеризованное обезжиренное молоко от продуктового магазина. Используйте охлажденный профиканал, а не в комнате температура продукта. Перед использованием в mCeHR среды, полоса молоко на Brain Heart Infusion (BHI) агар пластин и выдержать в течение 3-х дней при температуре 30 ° С и 37 ° С, чтобы проверить на стерильность. Перенести молоко до 50 мл в стерильные пробирки и хранят при температуре -80 ° C
- Подготовка каждого из следующих компонентов и объединить в порядке и размерах, приведенных подготовить 1 л mCeHR (Таблица 1A): 10 мл 2 мМ холина дикислотного цитрата, 10 мл витамина и фактора роста смеси (см. рецепт в таблице 1В), 10 мл 2,4 мМ мио-инозита, 10 мл 2 мМ хлорида гемин, 250 мл деионизированной воды. Применение всасывание и фильтруют через блок фильтра 0,22 мкм.
- Добавить 20 мл смеси нуклеиновых кислот (рецепт в таблице 1С), 100 мл минеральной смеси (рецепт в таблице 1D), 20 мл 170 мг / мл лактальбумин гидролизат, 20 мл незаменимых аминокислот, 10 мл неэссенциальных кислоты, 20 мл 450 мм KH 2 PO 4,50 мл 1,45 М D-глюкозы, 10 мл 1 М HEPES, соль натрия, 250 мл деионизированной воды.
- Применение всасывания для фильтрации стерилизации компонентов. Снимите фильтр и добавить 1 мл 5 мг / мл холестерина. Убедитесь, что рН СМИ составляет около 6-6,5. Примечание: Это решение может храниться при температуре -80 ° С в течение до одного года.
- Добавить 20% (объем / объем) ультра пастеризованное органический обезжиренного молока к среде mCeHR перед использованием. Используйте скрупулезно стерильной техники (например в ламинаре) при открытии и аликвоты молоко. Храните носители при 4 ° С.
3. Подготовьте C. Элеганс по культуре в аксенными mCeHR жидкой среде
- Расти червей на десять 60 мм NGM пластин, пока не много беременные червей и минимальное количество OP50 Е. палочка на пластинах.
- Удалить червей от каждой пластины промывкой 5 мл M9 буфера (рецепт в таблице 1F), и объединить в 50 мл коническую трубку.
- Разрешить червей в сЭттле, оставив трубку стоять в течение от 5 до 10 мин, затем тщательно удалите супернатант, содержащий E. палочка.
- Повторите шаги 3.2 и 3.3 2x, чтобы удалить как можно больше остаточных бактерий, насколько это возможно, прежде чем продолжить процедуру.
- Ресуспендируют червей в 0,1 N NaCl в объеме, который является кратным трем, например 1,5 мл, 3 мл или 6 мл, в которой отдельные червей можно увидеть в трубке.
- Bleach червей добавлением 5 N NaOH и 5% гипохлорита натрия (отбеливатель) решение в соотношении 1:02:06 на червя подвески. Например, 1 мл 5 N NaOH: 2 мл 5% гипохлорита натрия: 6 мл червячного суспензии. Перед добавлением в червя подвески Смешайте NaOH и отбеливатель.
- Vortex раствор энергично, пока беременной червей не растворяются и только яйца могут видеть в суспензии (приблизительно от 5 до 10 мин). Контролировать процесс использования контрастного микроскопа фаз с целью 10X.
- После того, как черви полностью растворяется, сразу осажденияяйца при 800 мкг в течение 45 секунд при 4 ° С. Удалить супернатант и промыть осадок дважды с 10 мл стерильной воды путем центрифугирования осадок при 800 х г в течение 45 сек при 4 ° С.
- После отбеливания, передавать яйцо осадок в колбу с тканевой культурой 25 см 2, содержащую 10 мл mCeHR среде с 100 мкг / мл тетрациклина. Выполните эту процедуру, используя стерильные методы. При желании добавить дополнительные антибиотики, в том числе 250 мкг / мл налидиксовой кислоты, чтобы предотвратить бактериальный рост в стерильный жидких культур.
- Инкубируйте суспензионных культур при 20 ° С на качалке инкубаторе при примерно 70 оборотов в минуту.
- Проверьте червей ежедневно отметить стадию развития и темпы роста.
Примечание: черви первоначально растут медленно и требуют от 7 до 10 дней, чтобы стать беременной. Однако, как черви акклиматизироваться к жидкой среде время генерации снизится до приблизительно 4 дней для дикого типа (N2) червей. - После того, как черви развивприпрыжку к беременной стадии в жидких средах, передача червь культуры в коническую пробирку и осаждения червей при 800 х г в течение 5 мин при 4 ° С с использованием ротора Бакет.
- Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют осадок в червь равным объемом 0,1 М NaCl. Например, можно использовать 10 мл 0,1 М NaCl червей культивировали в 10 мл mCeHR. Разрешить черви урегулировать в течение 5 мин на льду.
- Выполните процедуру отбеливания, как описано выше с шагом 3.5-3.8, и позволяют черви расти в течение второго поколения в аксенными жидких средах. При необходимости добавить антибиотик снова подавлять рост бактерий.
- Опять позволяют черви стать беременной затем осаждения и ресуспендируйте червей в 0,1 М NaCl как описано в шагах 3,12 и 3,13, то отбелить снова, как описано в шагах 3.5-3.8, для получения синхронизированного населения. Расти L1 личинок червей в жидких средах без антибиотиков с этого момента.
4. Синхронизация Черви от жидкостиКультура
- Гранулы и ресуспендируют червей в 0,1 М NaCl, как описано выше с шагом 3,12 и 3,13. Отбеливатель, как описано выше в пунктах 3.5-3.8.
- Ресуспендируют яйцо осадок в 10 мл M9 буфера и позволяют личинки вылупляются O / N при 20 ° С на вращающейся платформе шейкере. Примечание: Яйца вылупляются L1 личинок, но не будет развиваться дальше, синхронизации червей на стадии L1.
- Для поддержания и субкультура черви, осадок L1 личинки при 800 мкг в течение 5 мин, затем ресуспендируют личинок в 10 мл mCeHR и перевода к 25 см 2 колбы. Разрешить черви расти при 20 ° С на вращающейся платформе. Поддерживайте максимальную плотность 3000 червей / мл / см 2, чтобы обеспечить адекватное питание для червей.
Примечание: На данном этапе, антибиотики не требуются для поддержания аксенными условия, когда процедуры проводятся с использованием стерильных методов в ламинаре. Черви нужно проверять ежедневно контролировать рост.
5. БесплатныйЗин и оттаивания Черви для аксенными среднего культур
- Замораживание аксенными асинхронных культур червь или синхронизированного L1 личинок в жидком азоте. Гранул червей при 800 х г в течение 5 мин, затем ресуспендируют в буфере S (6,45 мМ KHPO 4, 43,55 мМ KHPO 4, 146,25 мМ NaCl) с использованием 0,5 мл в каждую пробирку. Добавить равный объем S буфере с 30% об / об глицерине в каждый флакон и передавать червей до -80 ° C до длительного хранения в жидком N 2. Заморозить примерно 1 х 10 6 червей на мл в каждом флаконе.
- Разморозить червей путем инкубации пробирки при 37 ° С в течение примерно 2 мин, пока почти весь лед не растает. В ламинаре, передать червей в стерильную колбу, содержащую mCeHR и разместить их при 20 ° С.
6. Определения действия гемина концентрация на рост и размножение в mCeHR
- Используйте аксенными СМИ mCeHR для анализа питательных веществ в зависимости рост C. Элеганс. Чтобы определить эффект п.Концентрация гемин е на рост червя и развитие, использование синхронизированы аксенными червей N2 или другие штаммы интерес. Синхронизация L1 личинок, как описано выше в разделе 4.
- На следующий день, гранул и рассчитывать синхронизированный L1 личинок и разбавляют до 1 червя за мкл аксенными СМИ. Сделать 10 мМ хлорида гемина в 0,3 М NH 4 OH и доведения рН до 8, используя концентрированную HCl.
- Добавить 800 мкл mCeHR массовой информации в 24-луночный планшет. Добавить 100 червей в каждую лунку в 100 мкл среды. Добавл ют Hemin в каждую лунку в концентрации от 0 мкМ, 1,5 мкМ до 1000 мкМ в трех экземплярах. Убедитесь, что все скважины содержат ту же концентрацию 0,3 М NH 4 OH. Осторожно ресуспендировали червей перед отбором, чтобы гарантировать, что 100 L1 личинки добавляли в каждую лунку.
- Ежедневно Изучите червей и обратите внимание на рост в каждой концентрации в каждую лунку. Подсчитайте количество червей после 9 дней инкубации и построить ряд червей / мл, соответствующих каждому гемаконцентрация (рис. 1).
7. Влияние гемина Концентрация на гем-зонд Worms
- Выдержите синхронизированные L1 червей датчиков гема (Phrg-1 :: GFP) в mCeHR содержащие 4 мкм, 8 мкм, 10 мкм и 20 мкм гемин.
- Image черви, использующие флуоресценции конфокальной микроскопии, 48 ч после инкубации (рис. 2).
8. Используя mCeHR для создания трансгенных C. Элеганс Использование бомбардировки микрочастицами
Примечание: порядок формирования и проведения бомбардировки микрочастицами с использованием UNC-119 (ED3) червей, выращенных в mCeHR изложена на рисунке 3 13.
- Червь Подготовка
- Трансфер приблизительно 1 х 10 6 асинхронные UNC-119 (ed3) червей в 90 мл mCeHR СМИ в 175 см 2 колбу за неделю до бомбардировки. Разрешить черви расти при 20 ° С опа встряхивая платформы на ~ 70 оборотов в минуту (рис. 3-1).
Примечание: Через неделю, плотность червь должен быть значительно больше, со многими взрослыми беременных червей. Примерно 3 х 10 7 черви будут необходимы для бомбардировки микрочастицами. - Холод JM-109 Е. палочка высевают 10 см NGM пластины на льду.
- Перенесите аксенными червей к двум 50 мл конические пробирки и центрифуги червей при 800 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют червей в каждую пробирку в 50 мл M9 буфера (рис. 3-2).
- Разрешить взрослых червей для осаждения под действием силы тяжести от 10 до 15 мин на льду.
Примечание: Сейчас 2 мл гранул должен содержать> 90% взрослых червей. Это 2 мл осадок должен иметь примерно 5 х 10 6 червей и достаточно для одной бомбардировки микрочастицами. - Покройте всю поверхность охлажденной JM109 высевают NGM пластины с 2 мл гранул червей. Дайте жидкости полностью поглощены затем оставить пластинув течение 30 мин на льду, прежде чем приступить (рис. 3-3).
- Трансфер приблизительно 1 х 10 6 асинхронные UNC-119 (ed3) червей в 90 мл mCeHR СМИ в 175 см 2 колбу за неделю до бомбардировки. Разрешить черви расти при 20 ° С опа встряхивая платформы на ~ 70 оборотов в минуту (рис. 3-1).
- Получение частиц золота
- Взвесить 30 мг частиц золота в силиконом трубки микроцентрифужных. Добавить 1 мл 70% этанола и вихревые трубки в течение 5 мин.
- Разрешить трубка сидеть в течение 15 мин, затем центрифуге при 6000 мкг в течение 10 сек для осаждения частиц золота. Удалить супернатант с помощью пипетки осторожно касаясь кончиком на стороне, противоположной трубки с частицами золота.
- Вымойте частицы золота с 1 мл стерильной воды, вихря в течение 1 мин и кратко центрифуги трубки при 6000 мкг в течение 10 сек. Повторите стадии промывки дважды, затем ресуспендируют частицы золота в 0,5 мл стерильного 50% глицерина.
Примечание: Конечная концентрация частиц золота будет 60 мг / мл и его можно хранить в течение от 1 до 2 месяцев при 4 ° С.
- Подготовьте смесь ДНК-частиц золота
- Смешайте 10 мкг целевого плазмидной ДНК с 10 &# 956; г UNC-119 спасательных плазмиды в силиконизированную 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Добавить 50 мкл дистиллированной воды и 100 мкл хорошо ресуспендированного решения частиц золота, то вихревой в течение 1 мин.
- Добавить 150 мкл 2,5 М CaCl 2 и вихрь решение снова в течение 1 мин. К этому раствору добавить 60 мкл 0,1 М спермидин и вихря от 3 до 5 мин.
- Импульсный центрифугировать раствор при 6000 х г в течение 10 сек, удалить супернатант и добавить 300 мкл 70% этанола. Vortex хорошо в течение 1 мин, пульс центрифуге при 6000 мкг в, удалите супернатант и ресуспендируют в 170 мкл 100% этанола. Энергично вихрь решение для 5 до 10 минут, затем импульс центрифуги и удалите супернатант.
- Бомбардировка (рис. 3-3)
Примечание: Этот протокол осуществляется с системой доставки частиц, указанных в таблице материаловедения / Оборудование. Следуйте инструкциям для доставки частиц инструмента доступны.- <литий> Поместите лист папиросной бумаги в 15 см пластины. С помощью пинцета, опустите семь macrocarriers индивидуально в 100%-ном этаноле и положите их на ткани для просушки.
- Тщательно очистите Biolistic камеру, macrocarrier держатель и мишень с 70% этанола. Чистый и автоклав моменты остановки экраны перед каждой процедурой бомбардировки.
- Загрузите macrocarrriers в держатель с помощью пинцета и нажмите в держатель с помощью инструмента уголок.
- Равномерно 20 мкл частиц золота ДНК покрытием в центре каждого macrocarrier а затем дайте раствору высохнуть.
- Очистка две части делителя давления с этанолом и собирают с этанолом очищены разрыва дисков. Винт делитель собранный давления и разрывных мембран в бомбардировке камеры.
- Соберите автоклавного экран остановки с держателем macrocarrier и поместите аппарат на металлической полкой необходимой и зафиксировать.
- Вставьте собранный МВУОocarrier аппарат в биолистической камеры в отведенное слот ниже делителя давления и согласовать с делителя давления.
- Лента открытый NGM пластины с червями на мишень пластины полке и закройте дверцу камеры.
- Для бомбардировать червей, отрегулировать давление в том, что необходимо сломать разрывных мембран. Включите вакуума до 28 дюймов ртутного столба, а затем нажмите кнопку огня, пока диски не разрыв.
- Отпустите вакуум и снимите NGM пластины из аппарата. Вымойте червей от пластины и распространять через двадцать 10 см NGM пластин посеянных с JM109 Е. палочка (рис. 3-4).
- Разрешить черви расти в течение 10 до 14 дней при 25 ° С и голодать тарелки. Черви спасенные от дефекта UNC-119 будет иметь нормальное движение и может быть идентифицирован в это время. Выберите по крайней мере 10 "дикого типа" червей из отдельных пластин для дальнейшего анализа, поскольку они представляют собой независимые трансгенных линий (Figurэ 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культивирование C. Элеганс в аксенными жидкой среды помогает в определении питательных веществ, которые необходимы червями, без вмешательства со стороны вторичных метаболитов, продуцируемых Е. палочка. Дикого типа N2 червей акклиматизироваться к mCeHR информации в течение трех поколений и показать рост, сопоставимый с червями, выращенными на NGM бактериальных пластин. В самом деле, эти черви стать беременной в течение 4 дней по сравнению с 3,5 дней для червей, выращенных на OP50 бактерий.
Одно из преимуществ использования mCeHR был замечен в исследованиях, которые изучали точные требования питательных веществ этих червей 14. На рисунке 1 червей выращивались в mCeHR дополнен с увеличением количества гема, до 1 мм. Наблюдения этих червей показал явное задержку роста в концентрациях гема ниже 4 мкм, с червей развивающихся в личиночной стадии L4, но не в состоянии перейти на беременной сцену после девяти дней в mCeHR. При концентрации 10 мкМ и 2056; М гема черви развиваться беременной этапе 4 дней и производить большое количество потомства. Максимальное количество потомства было видно, когда черви были выращены в mCeHR содержащий 20 мкм гем. Черви продолжал разрабатывать и производить потомство в 100 мкМ и 500 мкМ гема. Тем не менее, количество личинок потомства значительно уменьшилось по сравнению с червей, выращенных при оптимальной концентрации гема 20 мкМ гема. Концентрации Гем при температуре не ниже 800 мкм привело чахлыми, болезненный червей в личиночной стадии L3, в котором указывалось, что эти концентрации гема были токсичными для червей.
В дополнение к определению оптимальной концентрации гема и эффект гема лишений и гема токсичности на С. Рост Элеганс, штаммы гем репортер может быть использована для косвенно оценить состояние гема червя в меньшем диапазоне концентраций. IQ6011 червь трансгенной червь, который выражает гем отзывчивый транскрипции репортера, Р HRG-1 рисунке 2. Выражение GFP подавляется при 20 мкМ гема и возрастает по мере концентрации гема уменьшается. Инкрементальные изменения концентрации гема может быть точно коррелирует с ответом и экспрессии генов в mCeHR СМИ.
В дополнение к возможности тщательно контролировать концентрацию питательных веществ, предоставляемых червя, mCeHR аксенический СМИ позволяет эффективно роста большого количества синхронизированных червей. Эта функция может быть использована для бомбардировки микрочастицами (рис. 3). С помощью этой процедуры по крайней мере одну интегрированную линию были разработаны с каждой бомбардировки микрочастицами, проведенной (табл. 2).
Рисунок 1. С. Элеганс гем кривой роста. Worms выращивали в диапазоне концентраций гема от 0 мкМ до 1000 мкМ в mCeHR в течение 9 дней. Количество червей в каждой концентрации подсчитывали и нанесены. В 1,5 мкм гем концентрации черви были L4 и не в состоянии дальше развивать. В 800 мкм гема черви были чахлые на L2-L3 стадиях и показал эффекты гема токсичности.
Рисунок 2. Отклик датчика гема (Phrg-1 :: GFP) штамм в различных концентрациях гема в mCeHR. Синхронное трансгенных C. Элеганс выражения HRG-1 :: GFP были выращены в mCeHR среде с 4, 8, 10 или 20 мкМ гема в течение 48 часов. Изображения были приняты с Zeiss LSM 710 confocaл микроскоп. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Схема бомбардировки микрочастицами в С. Элеганс помощью UNC-119 червей, выращенных в mCeHR. (1) Примерно 3 х 10 7 UNC-119 (ed3) червей выращивают в 90 мл mCeHR СМИ. (2) Gravids давали осесть на льду в течение 10-15 мин в 50 мл конические пробирки. (3) 2 мл осадок примерно 5 х 10 6 беременных червей было распространено равномерно на качестве без затравки NGM пластины. Черви были засыпаны 12 мкг плазмиды интересов и 6 мкг UNC-119 спасательных плазмиды комплекс с золотыми частицами. (4) Тон бомбардировал черви были разделены на двадцать 10 см пластинах посеянных с Е. Штамм JM-109. (5) После 2-х недель инкубации при 25 ° С, пластины с червями дикого типа были отобраны для анализа трансгенной силы экспрессии и ставок сегрегации.
| Таблица 1А | |
| CeHR, 1 л | |
| Использование стерильных и 1 л (0,22 мкм) блок вакуум-фильтра, фильтра следующие объемы растворов и воды в порядке, описанном. | |
| Холин дикислота цитрат | 10 мл |
| Витамин и фактор роста смесь | 10 мл |
| мио-инозитол | 10 мл |
| Хлорид Хемин | 10 мл |
| Вода деионизированная | 250 мл |
| Смесь нуклеиновых кислот | 20 мл |
| Минеральная Mix | 100 мл |
| Лактальбумин гидролизат | 20 мл |
| Незаменимая аминокислота Mix | 20 мл |
| Номера для незаменимая аминокислота Mix | 10 мл |
| KH 2 PO 4 | 20 мл |
| D-Глюкоза | 50 мл |
| HEPES, натриевая соль | 10 мл |
| Вода деионизированная | 250 мл |
| Объем будет 800 мл в этот момент Снять блок фильтра из вакуума затем добавить: | |
| Холестерин | 1 мл |
| Ультра-пастеризованное обезжиренное молоко | 200 мл |
| Таблица 1B | |
| Витамин и фактор роста смесь, 100 мл | |
| Решение 1: К 60 мл воды объявления: | |
| N-ацетил-α-D-глюкозамин | 0,15 г |
| DL-аланин | 0,15 г |
| Никотинамид | 0,075 г |
| Д-пантетин | 0,0375 г |
| DL-пантотеновая кислота, кальциевая соль геми | 0,075 г |
| Фолиевая кислота | 0,075 г |
| Пиридоксамин 2HCl | 0,0375 г |
| Пиридоксин HCl | 0,075 г |
| Флавинмононуклеотид, натриевая соль | 0,075 г |
| Тиамин гидрохлорид | 0,075 г |
| Решение 2: Подготовьте следующие химические вещества в 5 мл 1 н КОН: | |
| парааминобензойная кислота | 0,075 г |
| D-биотин | 0,0375 г |
| Цианокобаламин (В12) | 0,0375 г |
| Фолиевой кислотой, соли кальция | 0,0375 г |
| Никотиновая кислота | 0,075 г |
| Пиридоксаль 5-фосфат | 0,0375 г |
| Раствор 3: 0,0375 г (±) α-L-липоевой кислоты, окисленной форме в 1 мл этанола | |
| Комбинат решения 1, 2, и 3, и довести конечный объем до 100 мл. Хранить в темноте при 4 ° С или заморозить аликвот при -20 ° С. Сделать небольшие объемы запасов для этой смеси так он быстро использовать. | |
| Таблица 1С | |
| Смесь нуклеиновой кислоты, 100 мл | |
| К 60 мл воды объявления: | |
| Аденозин 5'-монофосфат, натриевая соль | 1,74 г |
| Цитидин 5'-фосфат | 1,84 г |
| Гуанозин 2 '- и 3'-монофосфата | 1,82 г |
| ИЛИ | |
| Гуанозин 5'-фосфат | 2,04 г |
| Уридин 5'-фосфат динатриевой соли | 1,84 г |
| Тимин (добавить в прошлом) | 0,63 г |
| Принесите решение до 100 мл и хранить в темноте при 4 ° С или заморозить аликвоты при -20 ° С. Сделать небольшие объемы запасов для этой смеси так он быстро использовать. | |
| Минеральная Mix, 1 л | |
| MgCl 2 • 6H 2 O | 4,1 г |
| Цитрат натрия | 2,9 г |
| Цитрат калия моногидрат | 4,9 г |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0,07 г |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0,2 г |
| ZnCl 2 | 0,1 г |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O | 0,6 г |
| CaCl 2 • 2H 2 O (всегда добавлять в прошлом) | 0,2 г |
| Сделать небольшие объемы запасов для этой смеси так он быстро использовать. | |
| Другие компоненты | |
| KH 2 PO 4 | 450 мм |
| Холин цитрат ди-кислоты | 2 мм |
| мио-инозитол | 2,4 мм |
| D-Глюкоза | 1,45 М |
| Хлорид Хемин | 2 мМ в 0,1 N NaOH рН 8,0 |
| HEPES, натриевая соль | 1 М раствор |
| Холестерин | 5 мг / мл в этаноле |
| Лактальбумин Ферментативный гидролизат | 170 мг / мл |
| Таблица 1F | |
| M9 буфера, 1 л | |
| KH 2 PO 4 | 3 г |
| Na 2 HPO 4 | 6 г |
| NaCl | 5 г |
| H 2 O | 1 л |
| Автоклав 30 мин | |
| 1 М MgSO 4 (стерильные) | 1 мл |
Таблица 1 Рецепты. Для компонентов mCeHR и mCeHR.
| Бомбардировка | Линии с дикого типа спасения | Линии с спасения / трансгена | Стабильные линии |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Средний | 4.8 | 3.2 | 1 |
Таблица 2. AveraGE количество трансгенных C. Элеганс создан с помощью бомбардировки микрочастицами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы представляем модифицированную аксенными жидких сред mCeHR, который позволяет для быстрого C. поколение Элеганс с производством большого количества червей. Этот носитель показывает ряд преимуществ, как черви выращиваются без загрязнения E. палочка или бактериальные побочные продукты и может быть использована в питании и токсикологических исследований. Использование Е. палочка или другие бактерии в таких исследований имеет ряд недостатков. Например, рост бактерий может изменить в различных условиях и бактерии могут метаболизировать молекулы, которые, подвергаемые исследованию, смешивая интерпретацию результатов. Таким образом, развитие определенной среде для выполнения этих исследований является большим преимуществом.
Хотя С. Элеганс были выращены в жидких средах в предыдущих исследованиях 15, червей, выращенных в С. Элеганс поддерживающая среда (CEMM) показывают четкую задержку времени поколения 16, в отличие от того, что мы OBSERvE в mCeHR среды. Наша цель в том, чтобы использовать C. Элеганс для изучения питательных гомеостаза с особым упором на гема и металлической метаболизма. Имея это в виду, mCeHR и модификации, порожденные нашей группе достижения этой цели и непосредственно привели к выявлению ряда генов, необходимых для поддержания гема гомеостаза в черве и в конечном счете в позвоночных модельных систем 17, 18. Реформулированный mCeHR-1 массовой информации могут также быть использованы для других видов нематод, включая Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila и C. remanei. Кроме того низкие формулировки металлические mCeHR-2 и mCeHR-3 могут быть использованы в исследованиях, рассматривающих отравление тяжелыми металлами и требования 12.
До акклиматизации, N2 черви обладают более длительное время генерирования приблизительно 7 до 10 дней в mCeHR массовой информации. Как черви пересевают, на этот раз генерации падает до 4 дней, подобный тому, червей, выращенных на ОП50 бактерии. Тем не менее, время генерации может быть больше для некоторых мутантных червей, правдоподобно из-за дефектов в питании, движении, или конкретных потребностей в питании.
При использовании аксенными жидких сред очень важно, чтобы привередливые стерильные методы используются. Как правило, использование антибиотиков сводится к минимуму и в конечном счете устранены как черви акклиматизироваться к среде и остаточные бактерии устранены. Антибиотики первоначально требуется для того, чтобы культуры являются аксенический когда установлено, как это предотвращает рост остаточных бактерий, которые могут сокрушить червь культуры. После двух последовательных циклов отбеливания, антибиотики опущены из культур как постоянного использования антибиотиков только маскирует плохие асептики, которые необходимы для выращивания червей axenically. Используя эти методы в шкафу с ламинарным потоком, авторы смогли вырастить червей axenically без загрязнения. Кроме того, надлежащее хранение медИ.А. и компоненты имеет важное значение для поддержания червя и роста. Черви должны быть проверены на скорости роста и пересев, чтобы предотвратить давку, что может привести к образованию DauER как основных питательных веществ истощаются. Это можно предотвратить путем обеспечения того, плотность червей не превышает 3000 червей / мл / см 2. Исследователи, которые являются новыми для выращивания C. Элеганс axenically можете добиться этого путем ежедневно проверять червей и подсчета червей в неделю.
C. Элеганс исследователи воспользоваться его прозрачных свойств путем создания трансгенных червей выражая дневно-тегом маркеры, которые позволяют для визуализации экспрессии генов и локализации белков. Используя биолистическую бомбардировка разрешено для генерации низких интегрантов копирования, которые избегали вопросов внехромосомных массивов и выражения повышенной генной отметил с трансгены создан с помощью инъекции 19. Ранее один недостаток генерирующих трансгенных помощьюмикрочастицы бомбардировка С. Элеганс было требование для приготовления яйцо пластины, чтобы генерировать большое количество UNC-119 (ed3) червей, необходимых для процедуры 20. Каждое преобразование требуется 20 яиц пластины для числа червей необходимых. Использование аксенными жидкой культуры mCeHR позволяет более эффективно роста и впоследствии больше червей для бомбардировок. Кроме того, бомбардировки может быть использован в сочетании с выбором наркотиков, чтобы избежать использования UNC-119 (ed3) червей 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующие между собой финансовые интересы или конфликт интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными Институтами HealthGrants DK85035 и DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
