Summary
C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.
Abstract
이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.
Introduction
토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다.
많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 많은 표준 C에 대한 높은 동기 웜의 수백만을 배양 C.에 차등 규제 유전자의 마이크로 어레이 분석을 포함한 엘레 프로토콜 엘레 다른 헴 농도에 노출, 및 유전자 폭격을 이용한 형질 전환 웜의 제작. 이 매체는 화학적으로 박사 에릭 클레 9 공식화 원래 레시피에서 수정됩니다. 이 mCeHR 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 헴 항상성에 관여하는 유전자를 발견했습니다, 10 (HRG의)와 같은 헴 반응 유전자를 언급하는 것E. 시드 NGM 한천 플레이트를 사용 정규 성장 조건에서 불가능했다 대장균.
이 프로토콜에서 우리는 C.를 도입하고 유지하기위한 절차를 설명 E. 성장 엘레 콜라이 무균 mCeHR 및 트랜스 제닉 C. 제조 웜의 다수를 구하는 방법이 활용 미세 충격을 사용하여 엘레 라인. C.의 영양 소요량을 결정하기위한 무균 매체 사용의 실용성을 보여 우리 또한 본 연구 엘레 예로 헴을 사용. 이러한 연구는 mCeHR 매체를 사용하여 C. 다수의 급속한 성장을 허용한다는 것을 보여 웜 연구자에 의해 사용 많은 다운 스트림 애플리케이션을위한 엘레.
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Protocol
1. 웜 변종
- C. 구하는 엘레은 Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서 브리스톨 N2 균주를 야생형과 NGM 플레이트에 그들을 유지 E. 시드 대장균 균주 OP50 7. 참고 : 유전자 변형 웜은 IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) 이전 11 기술로 활용이 생성 된 종자는. IQ6011는 해당 저자의 요청하실 수 있습니다.
수정 C. 2. 준비 엘레 해비 및 재생 매체 (mCeHR)
12 아래에 설명 된대로 mCeHR 액체 매체를 준비합니다. 이 무균 액체 매체는 벌레가 추가 음식 소스없이 증가 할 수 있습니다. 이러한 층류 후드로 엄격히 멸균 조건을 사용하여 무균 액체 매질 및 무균 벌레의 모든 조작을 수행한다.
- 식료품 점에서 매우 저온 살균 무 지방 우유를 얻습니다. 냉장 프로를 사용덕트 아닌 실온 품. mCeHR 매체 행진에 판 한천 뇌 심장 주입 (BHI)에 우유를 사용하고 무균 상태를 확인하기 위해 30 ° C, 37 ° C에서 3 일 동안 배양하기 전에. -80 ° C에서 50 ㎖ 멸균 튜브 및 저장소에 우유를 이동
- 다음과 같은 구성 요소를 각각 준비하고 순서와 mCeHR 1 L를 준비하기 위해 주어진 양 (표 1A)의 결합 : 2 mM의 콜린 이산 구연산 10 ㎖, 비타민과 성장 인자 믹스 10 ㎖ (표 1B의 레시피 참조) 2.4 MM의 미오 - 이노시톨 10 ㎖, 10 ㎖의 2 mM의 헤민 클로라이드, 탈 이온수 250 ㎖. 0.22 μm의 필터 장치를 통해 흡입하고 필터를 적용합니다.
- 핵산 혼합물을 20 ㎖ (표 1c에 레시피), 미네랄 믹스 100 ㎖ (표 1d에 레시피), 170 ㎎ / ㎖ 락트 알부민 가수 분해물 20 ㎖의 필수 아미노산을 20 ㎖, 비 필수 아미노산 10 ㎖를 추가 산, 450 mM의 KH 2 PO 4 20 ㎖,1.45 M D-글루코스, 1 M HEPES 10 ㎖, 나트륨 염, 250 ㎖의 탈 이온수 50 ㎖.
- 구성 요소를 살균 필터링 흡입을 적용합니다. 필터를 제거하고 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤의 1 ML을 추가합니다. 미디어의 pH는 약 6-6.5 있는지 확인합니다. 참고 :이 솔루션은 최대 1 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 사용하기 전에 mCeHR 매체에 20 % (V / V) 매우 저온 살균 유기 탈지 우유를 추가합니다. 우유를 열고 분취 때 (층류 후드 예를 들면) 양심적으로 멸균 기술을 사용합니다. 4 ℃에서 미디어를 저장
3. C.에게 준비 무균 mCeHR 액체 배지에서 문화 엘레
- 많은 임신하는 웜과 OP50 E. 최소한의 양이 될 때까지 열 60mm NGM 플레이트에 벌레를 성장 접시에 대장균.
- M9 버퍼 (표 1 층에있는 레시피) 5 ㎖로 세척하여 각 판에서 벌레를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 결합한다.
- s의 벌레를 허용ettle 5 ~ 10 분 동안 서 튜브를 남겨 조심스럽게 E.를 포함 뜨는을 제거 대장균.
- 반복 절차를 계속 진행하기 전에 가능한 잔여 박테리아의 많은을 제거하기 위해 3.2 및 3.3 배 단계를 반복합니다.
- 세의 배수 부피 0.1 N 염화나트륨있는 웜에 resuspend 예컨대 1.5 ㎖, 3 ㎖ 또는 10 ㎖를되는 개별 웜 튜브에서 볼 수있다.
- 5 N NaOH를 5 % 차아 염소산 나트륨 웜 현탁액 1시 2분 6초 비율 (표백) 용액을 첨가함으로써 웜 표백. 예를 들어, 1 ml의 5 N NaOH를 2 ml의 5 % 차아 염소산 나트륨 : 웜 현탁액 6 ㎖. 웜 현탁액에 추가하기 전에 수산화 나트륨과 표백제를 혼합.
- 소용돌이 솔루션을 적극적으로 임신하는 웜이 용해 될 때까지 만 계란 서스펜션 (약 5 ~ 10 분) 내에서 볼 수 있습니다. 10X 대물 렌즈와 위상차 현미경을 사용하여 프로세스를 모니터링.
- 벌레가 완전히 용해 된 후, 즉시 펠렛계란 45 초 동안 800 XG에 4 ° C에서 뜨는을 제거하고 4 ℃에서 45 초 동안 800 XG에서 펠렛을 원심 분리하여 멸균 물 10 ㎖로 두 번 펠릿을 씻어
- 표백 후, 100 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 보충 mCeHR 미디어 10 ㎖를 포함하는 25cm 2 조직 문화 플라스크에 계란 펠렛을 전송합니다. 무균 기술을 사용하여이 절차를 수행합니다. 원하는 경우, 무균 액체 배양에서 박테리아의 성장을 방지하기 위해, 250 ㎍ / ㎖의 날 리딕 산 등 추가적인 항균제를 추가한다.
- 약 70 rpm으로 진탕 배양기에서 20 ° C에서 액체 문화를 품다.
- 개발 단계 및 성장 속도에 유의 매일 벌레를 확인합니다.
참고 : 웜은 처음에 천천히 성장하고 임신하는가 7 10 일이다이 필요합니다. 벌레가 액체 매질에 순응 그러나, 생성 시간은 야생형 (N2) 웜 약로부터 4 일 감소합니다. - 벌레는 deve을이 후원뿔 튜브에 웜 문화를 전송하고 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ° C에서 5 분 800 XG에 벌레를 펠렛, 액체 매체에서 임신하는 단계로 loped.
- 뜨는을 제거하고 부드럽게 0.1 M의 NaCl의 동일한 볼륨 웜 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, mCeHR 10 ㎖에서 배양 벌레를 0.1 M의 NaCl 10 ㎖를 사용합니다. 벌레가 얼음에 5 분 동안 정착 할 수 있습니다.
- 3.5-3.8 단계에서 전술 한 바와 같이 표백 절차를 수행하고, 웜 무균 액체 매질에 2 대째 성장하는 것을 허용한다. 필요한 경우, 세균의 성장을 억제하기 위해 다시 항생제를 추가합니다.
- 다시 동기화 인구를 생산하는 단계 3.5-3.8에 설명 된대로 다시 표백 단계 3.12 및 3.13에 설명 된대로 다음 0.1 M의 NaCl에 벌레를 펠렛 및 재현 탁 웜은 임신이 될 수 있습니다. 지금부터 항생제없이 액체 매체의 L1 애벌레 벌레를 성장.
액체에서 4. 동기화 웜문화
- 펠렛 및 단계 3.12 및 3.13에서 상술 한 바와 같이 0.1 M의 NaCl에있는 벌레를 재현 탁. 단계 3.5-3.8에서 상술 한 바와 같이 블리치.
- M9 버퍼 10 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 유충이 회전 플랫폼 통에 20 ° C에서 O / N을 부화 할 수 있습니다. 참고 : 계란 L1 애벌레로 부화하지만, 추가로 개발하지 않을 것이다, L1 단계에서 벌레를 동기화.
- 유지 및 배양 웜, 5 분 800 XG에 펠릿 L1 유충, 다음 10 mCeHR ml의 25cm 2 플라스크로 전송의 유충을 재현 탁합니다. 벌레가 회전 플랫폼에서 20 ° C로 증가 할 수 있습니다. 벌레에 충분한 영양을 보장하기 위해 3000 웜 / ㎖ / ㎠의 최대 밀도를 유지한다.
주의 :이 단계에서, 항생 물질이 절차는 층류 후드에서 무균 기술을 사용하여 수행 될 때 무균 상태를 유지하기 위해 요구되지 않는다. 웜은 성장을 모니터링하기 위해 매일 점검해야한다.
5. 무료무균 중간 문화에 대한 쌩쌩 및 해동 웜
- 무균 비동기 웜 문화 또는 액체 질소에 동기화 L1 유충을 동결. 5 분 800 XG에 펠렛 웜은 각각의 병에 대한 0.5 ㎖를 사용하여 S 버퍼 (6.45 mM의 KHPO 4, 43.55 mM의 KHPO 4, 146.25 mM의 염화나트륨)을 재현 탁. 각각의 병에 30 % V / V 글리세롤과 S 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 및 액체 N 2의 장기 보관하기 전에 -80 ° C로 웜을 전송합니다. 각각의 병에 ML 당 약 1 × 10 6 벌레를 동결.
- 거의 모든 얼음이 녹을 때까지 약 2 분 동안 37 ° C에서 튜브를 배양하여 벌레를 해동. 층류 후드에서 mCeHR을 포함하는 멸균 플라스크에 웜을 전송하고 20 ℃에서 그들을 배치
6. mCeHR의 성장과 재생에 헤민 농도의 효과를 결정
- C.의 영양소에 의존 성장을 검정 무균 mCeHR 미디어를 사용 엘레. 효과 (을)를 확인하려면벌레의 성장과 발전에 F 헤민 농도는 무균 N2 웜 또는 관심의 다른 변종을 동기화 사용합니다. 4 장에서 상술 한 바와 같이 L1 애벌레를 동기화합니다.
- 다음 날, 펠릿 및 동기화 L1 애벌레를 계산하고 무균 미디어 μL 당 1 웜에 희석에. 0.3 M NH 4 OH 10 ㎜ 헤민 염화을 확인하고 진한 염산을 사용하여 pH를 8로 조정합니다.
- 24 웰 플레이트에 mCeHR 매체 800 μl를 추가합니다. 미디어의 100 ㎕를 각 웰에 100 벌레를 추가합니다. 0 μM에서 1.5 μM 세중 1,000 μM까지의 농도로 각 웰에 헤민 염화을 추가합니다. 모든 우물이 0.3 M NH 4 OH의 동일한 농도가 포함되어 있는지 확인합니다. 조심스럽게 100 L1 유충이 각 웰에 첨가되는 것을 보장하기 위해 피펫 팅 전에 벌레를 재현 탁.
- 매일 벌레를 검사하고 각 웰의 각 농도의 성장을 확인합니다. 배양 9 일 후에 벌레의 수를 계산하고 각 헴에 해당하는 웜 / ㎖의 수를 음모농도 (그림 1).
헴 센서 웜에 헤민 농도의 7. 효과
- 4를 포함 mCeHR에 동기화 L1 헴 센서 웜 (Phrg-1 :: GFP)을 품다 μM, 13 μM, 10 μM, 20 μM 헤민.
- 형광 공 초점 현미경, 48 시간 포스트 배양 (그림 2)를 사용하여 이미지 웜.
8. 형질 전환 C.를 생성 할 mCeHR 활용 엘레 미세 사격을 사용하여
참고 : 그림 3 (13)에 설명되어 생성 및 UNC-119 (ED3) mCeHR에서 자란 벌레를 사용하여 미세 충격을 수행하기위한 절차를.
- 웜 준비
- 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어.
참고 : 일주일 후, 벌레 밀도가 많은 성인 임신하는 벌레와 상당히 커야합니다. 약 3 × 10 7 웜은 미세 충격에 필요합니다. - 칠 JM109 E. 대장균 얼음에 10cm의 NGM 플레이트 시드.
- 두 50 ML 원뿔 튜브에 무균 웜을 전송하고 2 분 동안 800 XG에서 벌레를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 M9 버퍼 (그림 3-2) 50 ㎖에 각 관 벌레를 재현 탁.
- 어른 벌레가 얼음에 10 ~ 15 분 동안 중력에 의해 펠릿 할 수 있습니다.
참고 : 2 ㎖ 펠릿은 지금> 90 %의 성인 벌레를 포함해야합니다. 이 2 ㎖ 펠릿은 약 5 × 10 6 웜이 하나의 미세 충격에 충분해야합니다. - 코트는 냉장 JM109의 전체 표면은 웜의 2 ㎖ 펠릿과 NGM 플레이트를 시드. 완전히 흡수 될 수있는 액체가 다음 판을 남길 수 있습니다(그림 3-3)를 진행하기 전에 얼음에 30 분.
- 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어.
- 금 입자의 제조
- 실리콘 처리 microcentrifuge 관에 금 입자의 30 밀리그램 무게. 1 ㎖의 70 % 에탄올을 추가하고 5 분 동안 튜브를 소용돌이.
- 관은 금 입자를 펠렛 10 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리 한 후, 15 분 동안 앉아 수 있습니다. 주의 깊게 금 입자에 튜브 반대의 측면에 끝을 터치하여 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
- 1 분 동안 멸균 물 1 ㎖, 소용돌이와 금 입자를 세척하고 짧게 10 초 동안 6,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 다음 멸균 50 % 글리세롤 0.5 ㎖에 금 입자를 재현 탁, 두 번 세척 단계를 반복합니다.
참고 : 금 입자의 최종 농도는 60 ㎎ / ㎖이있을 것이고, 4 ℃에서 1~2개월 저장할 수 있습니다
- DNA - 금 입자 믹스를 준비합니다
- 10 &으로 원하는 플라스미드 DNA의 10 μg을 결합# 956; 실리콘 처리 1.5 ML microcentrifuge 관에서 UNC-119 구조 플라스미드의 g. DI 물 50 μL 잘 재현 탁 금 입자 용액 1 분 후 소용돌이의 100 μl를 추가합니다.
- 2.5 M 염화칼슘 150 μl를 추가하고 1 분 동안 솔루션을 다시 소용돌이. 이 용액에 3 ~ 5 분 동안 0.1 M 스퍼 미딘과 소용돌이의 60 μl를 추가합니다.
- 펄스는 10 초 동안 6,000 XG에서 솔루션을 원심 분리, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 아니라 1 분 동안 6,000 XG에 펄스 원심 분리기는, 100 % 에탄올 170 μL에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 적극적으로 5 ~ 10 분 후 원심 분리기를 펄스와 뜨는을 제거하기위한 솔루션을 소용돌이.
- 사격 (그림 3-3)
주 :이 프로토콜은 자재 / 장비의 표에 지정된 입자 전달 시스템으로 수행된다. 사용할 수있는 입자 전달 기기에 대한 지침을 따르십시오.- <리> 15cm 접시에 조직의 용지를 넣습니다. 핀셋을 사용하여, 각각 100 % 에탄올에 일곱 macrocarriers을 찍어 건조 조직에 그들을 배치.
- 철저하게 70 % 에탄올로 biolistic 실, 마크로 캐리어 홀더 및 대상 플레이트를 청소합니다. 깨끗하고 각각의 폭격 절차 이전에 정지 화면을 압력솥.
- 좌석 도구를 사용하여 홀더에 핀셋과 프레스를 사용하여 홀더에 macrocarrriers를 넣습니다.
- 균등하게 각 마크로 캐리어의 중심에있는 DNA 코팅 된 금 입자의 20 μl를 확산하고 용액이 완전히 건조 할 수 있습니다.
- 에탄올 압력 분배의 두 부분을 청소하고 에탄올 청소 파열 디스크를 조립합니다. 사격 실에 조립 된 압력 분배기 및 파열 디스크를 고정합니다.
- 마크로 캐리어 홀더 멸균 정지 화면을 조립하고 금속 필요한 선반과 장소에 잠금에 장치를 배치합니다.
- 조립 MACR를 삽입ocarrier 압력 분배기 아래에 할당 된 슬롯에 biolistic 실에 장치 및 압력주기에 맞 춥니 다.
- 표적 판 선반 위에 벌레와 오픈 NGM 플레이트를 테이프와 실의 문을 닫습니다.
- , 웜 도배 파열 디스크를 파괴하는 데 필요한 그에게 압력을 조정합니다. , 수은 압력 28 인치에 진공을 켭니다 디스크가 파열 될 때까지 화재 버튼을 누릅니다.
- 진공을 해제하고 장치에서 NGM 플레이트를 제거합니다. 접시에서 벌레를 씻어 JM109 E. 시드 스물 10cm의 NGM 플레이트에 다시 배포 대장균 (그림 3-4).
- 벌레가 25 ° C에 최대 10 내지 14 일 동안 성장하고 판을 굶어 수 있습니다. UNC-119의 결함에서 구출 웜은 보통 운동을하고이 시간에 식별 할 수 있습니다. 이러한 독립적 인 유전자 변형 라인 (Figur를 대표로 추가 분석을 위해 별도의 플레이트에서 적어도 10 "야생형"벌레를 선택전자 3-5).
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Representative Results
C.를 배양 E.에 의해 생산 차 대사 산물의 간섭없이, 웜에 필요한 영양소의 결정에 무균 액체 배지 에이즈 엘레 대장균. 야생형 N2 웜은 세 세대 내 mCeHR 미디어에 순응하고 NGM 박테리아 접시에서 자란 벌레에 비해 성장을 보여줍니다. 사실, 이러한 웜은 OP50 박테리아 성장 웜 3.5 일에 비해 4 일 안에 임신하는이된다.
mCeHR 사용의 한 가지 이점은이 웜 (14)의 정확한 영양 요구를 조사 연구에서 관찰되었다. 그림 1 웜은 mCeHR 1 ㎜까지, 헴의 양을 증가 보충 성장했다. 이러한 웜의 관측 벌레가 L4 유충 단계로 개발하지만 mCeHR 아홉 일 후에 임신하는 단계로 발전 할 수 없습니다와 함께, 4 μM 아래 헴 농도에서 성장에 현저한 지연을 보여 주었다. 10 μM, 20의 농도에서56, M 헴은 웜 4 일 임신하는 단계로 개발하고 자손의 많은 수를 생산하고 있습니다. 벌레가 20 μM 헴을 포함 mCeHR에서 재배 때 자손의 최대 수는 보였다. 웜은 100 μM, 500 μM 헴에서 자손을 개발하고 생산하기 위해 계속했다. 그러나, 유생 자손의 수는 현저하게 20 μM 헴의 최적 헴 농도에서 성장 된 웜에 비해 감소 하였다. 800 μM에서 이상 헴 농도는 이러한 헴 농도가 벌레에 독성이 있다고 지적 L3 유충 단계에서 성장을 방해, 병약 한 웜의 결과.
헴 최적 농도 및 C.의 헴 박탈 및 헴 독성의 효과를 결정하는 이외에 elegans의 성장은, 헴 리포터 균주 간접적 작은 농도 범위 내에 웜 헴 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. IQ6011 웜은 헴 응답 전사 기자를 표현하는 유전자 변형 웜, P HRG-1 그림 2에서 보듯이 응답, 헴 (가) 구비 조건에서 반전됩니다. GFP 발현은 20 μM 헴에서 억압되고 헴의 농도 증가는 감소한다. 헴 농도의 증가 변화는 정확하게 mCeHR 미디어의 유전자 응답 식으로 상관 관계가 될 수있다.
정중 웜에 제공 영양소 농도를 제어 할 수있는 것에 더하여, 무균 mCeHR 미디어 동기화 웜 다수의 효율적인 성장을 허용한다. 이 기능은 미세 충격 (그림 3)을 위해 이용 될 수있다. 적어도 하나의 통합 된 라인이 절차를 사용하는 것이 수행의 모든 미세 충격 (표 2)에서 개발되었다.
그림 1. C. 엘레 헴 성장 곡선은. 웜 9 개의 일 mCeHR 1000 μM 0 μM에서 헴 농도의 범위에서 성장했다. 각 농도의 웜의 수는 계산하고 그려졌다. 1.5 μM에서 헴 농도 웜은 L4 더욱 발전 할 수 없습니다. 800 μM 헴에서 벌레가 L2-L3 단계에서 성장을 방해하고 헴 독성의 효과를 보였다.
mCeHR 다른 헴 농도 헴 센서의 그림 2. 응답 (Phrg-1 :: GFP) 변형. 동기화 된 형질 전환 C. 엘레 표현 HRG-1 :: GFP는 mCeHR의 4 보충 미디어, 8, 10, 또는 48 시간 동안 20 μM 헴에서 성장했다. 이미지는 자이스 혈구 LSM 710 confoca로 촬영 한L 현미경. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. C.에 미세 충격의 개략도 엘레 mCeHR 성장 UNC-119 웜을 사용. (1) 약 3 × 10 7 UNC-119 (ED3) 웜은 90 ㎖의 mCeHR 미디어에서 재배된다. (2) Gravids 50 ML 원뿔 튜브에 10 ~ 15 분 동안 얼음에 정착 할 수 있었다. (3) 약 5 × 10 6 임신하는 웜의 2 ㎖의 펠릿 시드되고 NGM 판에 균일하게 확산되었다. 웜은 금 입자 복합체를 UNC-119 구조 플라스미드의 12 그 플라스미드 ㎍의 6 μg 폭격했다. (4) T그는 벌레가 E. 시드 스물 10cm 플레이트에 분리 된 폭격 대장균 균주 JM109. (5), 25 ° C에서 2 주 동안 배양 한 후, 야생형 벌레와 접시는 유전자 발현 강도와 분리 비율의 분석을 위해 선택되었다.
| 표 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| 무균 기법 및 1 L (0.22 μM) 진공 필터 장치를 사용하여, 기재된 순서 원액과 물의 다음 볼륨을 고를. | |
| 콜린 이산 구연산 | 10 ㎖ |
| 비타민과 성장 인자를 혼합 | 10 ㎖ |
| 미오 - 이노시톨 | 10 ㎖ |
| 헤민 염화 | 10 ㎖ |
| 탈 이온수 | 250 ㎖의 |
| 핵산 믹스 | 20 ㎖ |
| 미네랄 믹스 | 100 ML |
| 락트 알부민 가수 분해물 | 20 ㎖ |
| 필수 아미노산 믹스 | 20 ㎖ |
| 비 필수 아미노산 믹스 | 10 ㎖ |
| KH 2 PO 4 | 20 ㎖ |
| D-글루코오스 | 50 ㎖ |
| HEPES, 나트륨 염 | 10 ㎖ |
| 탈 이온수 | 250 ㎖의 |
| 볼륨이 시점에서 800 ㎖의 것입니다 추가 한 후 진공에서 필터 장치를 제거 | |
| 콜레스테롤 | 1 ㎖ |
| 울트라 저온 살균 탈지 우유 | 200 ㎖의 |
| 표 1B | |
| 비타민과 성장 인자를 혼합, 100 ㎖ | |
| 해결 방법 1 : 물 부가 기능의 60 mL에 : | |
| N-아세틸-α-D-글루코사민 | 0.15 g |
| DL-알라닌 | 0.15 g |
| 니코틴 아미드 | 0.075 g |
| D-pantethine | 0.0375 g |
| DL-판토텐산, 헤미 칼슘 염 | 0.075 g |
| 엽산 | 0.075 g |
| 피리 독사 2HCL | 0.0375 g |
| 피리독신 염산 | 0.075 g |
| 플라 빈 모노 뉴클레오티드, 나트륨 염 | 0.075 g |
| 티아민 염산염 | 0.075 g |
| 해결 방법 2 : 5 ㎖ 1 N KOH에 다음과 같은 화학 물질을 준비한다 : | |
| P-아미노 벤조산 | 0.075 g |
| D-비오틴 | 0.0375 g |
| 시아 노 코발라민 (B12) | 0.0375 g |
| 엽산, 칼슘 염 | 0.0375 g |
| 니코틴산 | 0.075 g |
| 피리 독살 -5 - 인산염 | 0.0375 g |
| 해결 방법 3 : 0.0375 g (±) α-L-리포산, 1 ㎖의 에탄올 산화 형태 : | |
| 용액 1, 2, 3을 결합하고 100 ㎖로 최종 부피를 가져온다. 4 ° C에서 어둠에 보관 또는 -20 ° C에서 분주 동결 그것은 신속하게 사용되도록이 혼합을위한 주식의 작은 볼륨을 확인합니다. | |
| 표 1C | |
| 핵산 믹스, 100 ㎖ | |
| 물 부가 기능의 60 ml로 : | |
| 아데노신 5'-모노 포스페이트, 나트륨 염 | 1.74 g |
| 시티 딘 5 '- 인산 | 1.84 g |
| 구아노 신 2 '- 3'- 인산염 | 1.82 g |
| OR | |
| 구아노 신 5'-인산 | 2.04 g |
| 우리 딘 5'-포스페이트, 나트륨 염 | 1.84 g |
| 티민 (마지막 추가) | 0.63 g |
| 4 ° C에서 어둠 속에서 100 ㎖의 저장소에 솔루션을 가져 오기 또는 -20 ° C에서 분주 동결 그것은 신속하게 사용되도록이 혼합을위한 주식의 작은 볼륨을 확인합니다. | |
| 미네랄 믹스, 1 L | |
| MgCl2를 2 • 6H 2 O | 4.1 g |
| 구연산 나트륨 | 2.9 g |
| 구연산 칼륨 수화물 | 4.9 g |
| 의 CuCl 2 • 2H 2 O | 0.07 g |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0.2 g |
| ZnCl 2 | 0.1 g |
| 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O | 0.6 g |
| 염화칼슘 2 • 2H 2 O (항상 마지막 추가) | 0.2 g |
| 그것은 신속하게 사용되도록이 혼합을위한 주식의 작은 볼륨을 확인합니다. | |
| 기타 구성 요소 | |
| KH 2 PO 4 | 450 밀리미터 |
| 콜린 디 산 구연산 | 2 ㎜ |
| 미오 - 이노시톨 | 2.4 mM의 |
| D-글루코오스 | 1.45 M |
| 헤민 염화 | 0.1 N NaOH를 pH를 8.0에서 2 ㎜ |
| HEPES, 나트륨 염 | 1 M 원액 |
| 콜레스테롤 | 에탄올 5 ㎎ / ㎖ |
| 락트 알부민 효소 적 가수 분해물 | 170 ㎎ / ㎖ |
| 표 1 층 | |
| M9 버퍼, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3g |
| 나 2 HPO 4 | 6g |
| 염화나트륨 | 5g |
| H 2 O | 1 L |
| 오토 클레이브 30 분 | |
| 1 M 망초 (멸균) | 1 ㎖ |
표 1. 조리법 mCeHR 및 mCeHR의 구성 요소.
| 충격 | 야생형 구조와 라인 | 구조 / 유전자와 선 | 안정적인 라인 |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| 평균 | 4.8 | 3.2 | 1 |
표 2. AVERA유전자 변형 C.의 GE 번호 엘레 미립자 포격을 사용하여 생성.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 성장은 다양한 조건 하에서 변경 및 박테리아 결과의 해석을 혼동, 정량되는 분자를 대사 할 수있다. 따라서, 이러한 연구를 수행 할 수있는 정의 된 매체의 개발은 매우 유리하다.
비록 C. 엘레는 이전의 연구 (15), C.에서 자란 벌레 액체 매체에서 재배 된 엘레 유지 보수 매체 (CeMM) 우리가 obse 무엇 달리 세대 16 배에 현저한 지연을 보여mCeHR 매체 RVE. 우리의 주요 목표는 C.를 이용했다 헴과 금속 물질 대사에 특정 강조와 함께 영양 항상성을 연구하는 엘레. 이 염두에두고, mCeHR 우리의 그룹에 의해 생성 된 수정은이 목표를 달성 직접 웜에 헴 항상성을 유지하고 궁극적으로 척추 동물 모델 시스템 (17, 18)에 필요한 유전자의 숫자의 식별되었다. 공식화 mCeHR-1 미디어는 Panagrellus의 redivivus, Oscheius의 myriophila 및 C 등 다른 선충 종에 이용 될 수있다 remanei. 또한 낮은 금속 제제 mCeHR-2와 mCeHR-3는 중금속 독성 및 요구 사항 (12)을 조사 연구에 이용 될 수있다.
이전 적응에, N2 웜 mCeHR 미디어에 약 7-10일의 이상 생성 시간을 나타낸다. 벌레는 계대 배양으로,이 생성 시간은 OP5 성장 웜과 동일한 4 일,로 감소0 박테리아. 그러나, 생성 시간은 그럴듯 때문에 수유, 운동, 또는 특정 영양 요구 사항 결함의 특정 돌연변이 웜이 더 길어질 수 있습니다.
무균 액체 용지를 사용하는 경우는 까다로운 무균 기술이 이용되는 것이 중요합니다. 일반적으로, 항생제의 사용은 최소화되고 웜 배지에 순응하고 잔류 세균이 제거 될 때 결국 탈락. 항생제는 처음에는 웜 문화를 압도 할 수있는 잔류 세균의 번식을 방지 설립 때 문화가 무균를 보장하기 위해 필요합니다. 표백의 두 개의 연속 라운드 후, 항생제는 마스크 층류 캐비닛에 이러한 기술을 사용하여. axenically 웜 성장에 필수적인별로 무균 기술, 저자는 axenically 벌레를 성장 할 수 있었다 항생제의 지속적인 사용과 문화에서 생략 오염없이. 클럽 메드의 추가로, 적절한 보관아이오와 및 구성 요소 웜 유지 관리 및 성장을 위해 필수적이다. 벌레는 성장 속도에 대한 확인 및 필수 영양소가 고갈로 영속 형성으로 이어질 수있는 군집을 방지하기 위해 계대 배양해야한다. 이 벌레의 밀도가 3000 웜 / ㎖ / cm 2를 초과하지 않도록 보장함으로써 방지 될 수있다. C. 성장에 새로운 연구원 엘레 axenically 매일 벌레를 확인하고 매주 벌레를 계산하여이 기능을 수행 할 수 있습니다.
C. elegans의 연구팀은 유전자 발현과 단백질 지방화의 시각화를 허용 찬란 - 태그 마커를 발현하는 유전자 변형 벌레를 생성하여 투명 속성을 활용할 수 있습니다. 형질 전환 주입 19를 사용하여 생성과 염색체 외 배열과 높은 유전자 발현의 문제를 피할 낮은 복사 통합 체의 생성을 허용 활용 biolistic 폭격는 지적했다. 사용하여 생성하는 형질 전환 이전에, 하나의 단점C.의 미세 충격 엘레 절차 (20)에 필요한 UNC-119 (ED3) 웜의 큰 숫자를 생성하는 계란 접시 준비에 대한 요구했다. 각각의 변환은 필요 벌레의 수를 20 계란 접시를 요구했다. 무균 mCeHR 액체 배양을 사용하면보다 효율적으로 성장 이후에 폭격에 대한 더 많은 벌레를 할 수 있습니다. 또한 폭격은 UNC-119 (ED3) 웜 (21)의 사용을 피하는 약물 선택과 함께 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이익의 충돌이없는 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
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