Summary
C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.
Abstract
In questo protocollo, presentiamo i materiali necessari, e la procedura per fare C modificati. Legans e assuefazione e della Riproduzione media (mCeHR). Inoltre, la procedura per l'esposizione e acclimatazione C. elegans cresciuti su E. coli a axeniche mezzi liquidi sono descritti. Infine, gli esperimenti a valle che utilizzano axenic C. elegans illustrano i benefici di questa procedura. La capacità di analizzare e determinare C. fabbisogno nutritivo elegans è stato illustrato da una crescente N2 wild type vermi in mezzi liquidi axeniche con concentrazioni variabili eme. Questa procedura può essere replicata con altri nutrienti per determinare la concentrazione ottimale per la crescita e lo sviluppo verme o, per determinare gli effetti tossicologici dei trattamenti farmacologici. Gli effetti di varie concentrazioni eme sulla crescita di tipo selvaggio vermi sono stati determinati mediante osservazione microscopica qualitativa e quantificazione tegli numero di worm che crescevano in ciascuna concentrazione eme. Inoltre, l'effetto di varie concentrazioni di nutrienti può essere saggiata utilizzando vermi che esprimono sensori fluorescenti che rispondono alle variazioni del nutriente di interesse. Inoltre, un gran numero di vermi erano facilmente prodotti per la generazione di transgenici C. elegans utilizzando microparticelle bombardamento.
Introduction
Il nematode del suolo, Caenorhabditis elegans, è un potente organismo modello utilizzato in numerosi studi dalla genetica alla tossicologia. Come risultato della sua dimensione 1 mm tempo di generazione rapida di quattro giorni facilità di coltivazione, e un gran numero di progenie, questi nematodi sono stati utilizzati in un numero di schermi genetici e farmacologici 1, 2. Ricercatori approfittare di questo worm per identificare molecole e percorsi conservati nei sistemi di vertebrati. Questi percorsi sono segnali di morte cellulare, percorsi di invecchiamento e del metabolismo, e il sistema nervoso 3-6. Inoltre, la trasparenza di C. elegans consente la generazione di linee transgeniche utilizzando reporter proteine fluorescenti, che possono essere visualizzati direttamente per analizzare i modelli di espressione genica e localizzazione delle proteine.
In molti studi questo nematode è coltivato su una superficie a base di agar-solido utilizzando nematode mezzo di crescita (NGM) piastre o in lculture iquid seminati con Escherichia coli come fonte di cibo 7,8. Queste fonti di cibo batteriche possono confondere studi biochimici e tossicologici con interferenza da batteri sottoprodotti che influenzano l'interpretazione dei risultati. Per evitare questi effetti compounding, C. elegans possono essere coltivate in un mezzo liquido axeniche che è privo di batteri come fonte di cibo. Usando questo supporto, abbiamo coltivato con successo milioni di vermi altamente sincronizzati per molti di serie C. protocolli elegans, compresa l'analisi microarray di geni differenzialmente regolati in C. elegans esposto a diverse concentrazioni eme, e produzione di vermi transgenici utilizzando gene bombardamento. Questo supporto è chimicamente definita e modificata da una ricetta originale formulata dal Dr. Eric Clegg 9. Usando questo supporto mCeHR, abbiamo identificato con successo geni coinvolti nella eme omeostasi, riferiti ai geni come eme responsivi (HRG s) 10, che avrebbenon sarebbe stato possibile in condizioni di crescita regolari che utilizzano piastre di agar NGM seminato con E. coli.
In questo protocollo si descrive la procedura per l'introduzione e il mantenimento C. elegans cresciuti su E. coli per la axenic mCeHR e utilizzare questo metodo per ottenere un gran numero di vermi per produrre transgenico C. Linee elegans utilizzando microparticelle bombardamento. Abbiamo presenti anche studi che dimostrano l'utilità di utilizzare supporti axeniche per la determinazione del fabbisogno nutrizionale di C. elegans utilizzando eme come esempio. Questi studi mostrano che utilizzando mCeHR supporti consente la rapida crescita di un gran numero di C. elegans per molte applicazioni a valle utilizzate dai ricercatori worm.
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Protocol
1. Ceppi Worm
- Ottenere C. elegans tipo selvatico ceppi Bristol N2 dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e li mantengono su piastre NGM seminato con E. coli ceppo OP50 7. Nota: verme transgenico ceppi IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizzati sono stati generati come descritto in precedenza 11. IQ6011 può essere richiesto all'autore corrispondente.
2. Preparazione di Modified C. elegans Habitation e riproduzione Medium (mCeHR)
Preparare mCeHR mezzi liquidi come descritto di seguito 12. Questo supporto liquido axenic permette ai vermi di crescere senza fonti di cibo supplementari. Eseguire tutte le manipolazioni di mezzi liquidi axeniche e worm axeniche utilizzando condizioni rigorosamente sterile come una cappa a flusso laminare.
- Ottenere il latte pastorizzato ultra senza grassi da un negozio di alimentari. Utilizzare il pro refrigeratodotto e non il prodotto temperatura ambiente. Prima di utilizzare in mCeHR mezzo, striscia il latte sul Brain Heart Infusion (BHI) piastre di agar ed incubare per 3 giorni a 30 ° C e 37 ° C per verificare la sterilità. Trasferire il latte a 50 ml provette sterili e conservare a -80 ° C
- Preparare ciascuno dei seguenti componenti e combinare nell'ordine e importi indicati per preparare 1 L di mCeHR (Tabella 1A): 10 ml di 2 mM colina diacido citrato, 10 ml di vitamina e fattore di crescita mix (vedi ricetta in Tabella 1B), 10 ml di 2,4 mM myo-inositolo, 10 ml di 2 mM cloruro emina, 250 ml di acqua deionizzata. Applicare l'aspirazione e il filtro attraverso un gruppo filtro 0,22 micron.
- Aggiungere 20 ml di miscela di acido nucleico (ricetta nella Tabella 1C), 100 ml di miscela di minerali (ricetta nella Tabella 1D), 20 ml di 170 mg / ml lattoalbumina idrolizzato, 20 ml di aminoacidi essenziali, 10 ml di aminoacidi non essenziali acidi, 20 ml di 450 mM KH 2 PO 4,50 ml di 1,45 M D-glucosio, 10 ml di 1 M HEPES, sale di sodio, 250 ml di acqua deionizzata.
- Applicare aspirazione per filtrare sterilizzare i componenti. Rimuovere il filtro e aggiungere 1 ml di 5 mg / ml di colesterolo. Assicurarsi che il pH della media è di circa 6-6,5. Nota: questa soluzione può essere conservata a -80 ° C fino ad un anno.
- Aggiungere 20% (v / v) ultra pastorizzato latte scremato organico al mezzo mCeHR prima dell'uso. Usare una tecnica scrupolosamente sterile (ad esempio in una cappa a flusso laminare) all'apertura e si dispensa il latte. Conservare il supporto a 4 ° C.
3. Preparare C. elegans per la Cultura in axeniche mCeHR Liquid Media
- Crescere vermi dieci 60 millimetri piastre NGM finché ci sono molti vermi gravide e una quantità minima di OP50 E. coli sulle piastre.
- Rimuovere le viti senza fine da ciascuna piastra da risciacquo con 5 ml di tampone M9 (ricetta in Tabella 1F), e combinare in una provetta conica da 50 ml.
- Lasciare i vermi a settle lasciando il tubo riposare per 5 a 10 minuti poi rimuovere con attenzione il surnatante contenente la E. coli.
- Ripetere i punti 3.2 e 3.3 2x per rimuovere la maggior quantità di batteri residui più possibile prima di continuare la procedura.
- Risospendere i vermi in 0,1 N di NaCl in un volume che è un multiplo di tre, per esempio 1,5 ml, 3 ml o 6 ml in cui i singoli vermi può essere visto nel tubo.
- Candeggiare i vermi aggiungendo NaOH 5 N e 5% soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) in un rapporto di 01:02:06 alla sospensione verme. Per esempio, 1 ml di NaOH 5 N: 2 ml 5% di ipoclorito di sodio: 6 ml della sospensione verme. Mescolare il NaOH e candeggina prima di aggiungere alla sospensione verme.
- Vortex la soluzione energicamente fino vermi gravide vengono sciolti e solo uova sono visibili all'interno della sospensione (circa 5 a 10 min). Monitorare il processo utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X.
- Dopo che i vermi hanno completamente sciolto, pellet immediatamente l'uova a 800 xg per 45 secondi a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con 10 ml di acqua sterile per centrifugazione il pellet a 800 xg per 45 sec a 4 ° C.
- Dopo lo sbiancamento, trasferire il pellet uovo ad un tessuto beuta da 25 cm 2 di coltura contenente 10 ml di media mCeHR integrato con 100 pg / ml di tetraciclina. Effettuare questa procedura utilizzando tecniche sterili. Se lo si desidera, aggiungere ulteriori antibiotici, di cui 250 mg / ml di acido nalidixico, per prevenire la crescita batterica nelle colture liquide axeniche.
- Incubare le colture liquide a 20 ° C in un incubatore agitazione a circa 70 rpm.
- Controllare i vermi ogni giorno per notare la fase di sviluppo e il tasso di crescita.
Nota: Worms inizialmente crescere lentamente e richiedono 7 a 10 giorni per diventare gravida. Tuttavia, come i vermi acclimatarsi al mezzo liquido il tempo di generazione diminuisce di circa 4 giorni per tipo selvatico (N2) vermi. - Dopo i vermi hanno svipato alla fase gravido in mezzi liquidi, trasferire la cultura verme in una provetta conica e agglomerare le vermi a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un rotore oscillante.
- Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet verme in un volume uguale di 0,1 M NaCl. Ad esempio, utilizzare 10 ml di 0,1 M NaCl per i vermi coltivate in 10 ml di mCeHR. Lasciare i vermi di stabilirsi per 5 minuti in ghiaccio.
- Effettuare la procedura di sbiancamento come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8, e permettere ai vermi di crescere per una seconda generazione nei mezzi liquidi axeniche. Se necessario, aggiungere di nuovo l'antibiotico per inibire la crescita batterica.
- Anche in questo caso consentono ai vermi di diventare gravida poi pellet e risospendere i vermi in 0.1 M NaCl come descritto nei punti 3.12 e 3.13, poi candeggiare nuovo come descritto nei passaggi 3,5-3,8, per produrre una popolazione sincronizzato. Crescere i vermi larve L1 in mezzi liquidi senza antibiotici da ora in poi.
4. Sincronizzazione Worms da LiquidCultura
- Pellet e risospendere i vermi a 0,1 M NaCl come sopra descritto nei passaggi 3.12 e 3.13. Bleach come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8.
- Risospendere il pellet uovo in 10 ml di tampone M9 e permettere alle larve di schiudono O / N a 20 ° C su una piattaforma agitatore rotante. Nota: Le uova si schiudono in larve L1, ma non si svilupperanno ulteriormente, sincronizzando i vermi nella fase L1.
- Per mantenere e vermi sottocultura, pellet L1 larve a 800 xg per 5 minuti, poi risospendere le larve in 10 ml di mCeHR e il trasferimento ad un pallone 25 centimetri 2. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C su una piattaforma rotante. Mantenere una densità massima di 3.000 ml / worm / cm 2 per assicurare una nutrizione adeguata per i vermi.
Nota: In questa fase, gli antibiotici non sono tenuti a mantenere condizioni axeniche quando le procedure siano effettuate con tecniche sterili in una cappa a flusso laminare. Worms devono essere controllate quotidianamente per monitorare la crescita.
5. Liberozing e scongelamento Worms per colture axeniche medie
- Congelare le culture verme asincroni axeniche o sincronizzato larve L1 in azoto liquido. Worm pellet a 800 xg per 5 minuti poi risospendere in tampone di S (6,45 KHPO mm 4, 43.55 KHPO mm 4, 146,25 mM NaCl) con 0,5 ml per ogni flacone. Aggiungere un volume uguale di tampone S con il 30% v / v glicerolo ad ogni flacone e trasferire i vermi a -80 ° C prima della conservazione a lungo termine in N 2 liquido. Congelare circa 1 x 10 6 vermi per ml in ogni fiala.
- Scongelare vermi incubando le fiale a 37 ° C per circa 2 min fino a quasi tutto il ghiaccio è fuso. In una cappa a flusso laminare, trasferire i vermi in un pallone sterile contenente mCeHR e metterli a 20 ° C.
6. Determinare l'effetto di Hemin concentrazione sulla crescita e la riproduzione in mCeHR
- Utilizzare supporti mCeHR axeniche per saggiare la crescita dipende nutrienti di C. elegans. Per determinare l'effetto of emina concentrazione sulla crescita senza fine e lo sviluppo, l'uso sincronizzato vermi N2 axeniche o di altri ceppi di interesse. Sincronizzare L1 larve come descritto sopra nella sezione 4.
- Il giorno successivo, pellet e contare sincronizzato larve L1 e portare ad 1 verme per ogni ml di mezzi axeniche. Effettuare 10 mM cloruro emina in 0,3 M NH 4 OH e regolare a pH 8 mediante HCl concentrato.
- Aggiungere 800 microlitri di media mCeHR ad una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 vermi per ciascun pozzetto in 100 microlitri di media. Aggiungere cloruro di emina a ciascun pozzetto in concentrazioni comprese tra 0 mM, 1,5 mM a 1.000 pM in triplice copia. Assicurarsi che tutti i pozzetti contengono la stessa concentrazione di 0,3 M NH 4 OH. Risospeso delicatamente i worm prima il pipettaggio per garantire che il 100 L1 larve sono aggiunti a ciascun pozzetto.
- Esaminare i vermi ogni giorno e notare la crescita di ciascuna concentrazione in ciascun pozzetto. Contare il numero di vermi dopo 9 giorni di incubazione e tracciare il numero di worm / ml corrispondenti a ciascuna emeconcentrazione (Figura 1).
7. Effetto della Hemin concentrazione su eme Worms sensori
- Incubare sincronizzati L1 vermi sensore eme (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR contenente 4 micron, 8 micron, 10 micron e 20 micron emina.
- Immagine worm utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza, 48 ore dopo incubazione (Figura 2).
8. Utilizzando mCeHR per generare transgenici C. elegans Utilizzo di microparticelle Bombardamento
Nota: la procedura per la generazione e la realizzazione di microparticelle bombardamento con vermi coltivate in mCeHR unc-119 (ED3) è illustrato nella figura 3 13.
- Worm Preparazione
- Trasferire circa 1 x 10 6 asincroni unc-119 (ED3 vermi) in 90 ml di mezzi mCeHR in A 175 cm 2 matraccio una settimana prima del bombardamento. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C ona piattaforma di agitazione a ~ 70 rpm (Figura 3-1).
Nota: Una settimana più tardi, la densità verme dovrebbe essere significativamente maggiore con molti adulti vermi gravide. Circa 3 x 10 7 vermi saranno necessari per microparticelle bombardamento. - Freddo JM109 E. coli testa di serie 10 piatti cm NGM sul ghiaccio.
- Trasferire i vermi axeniche a due tubi da 50 ml coniche e centrifugare i vermi a 800 xg per 2 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le viti senza fine in ciascun tubo in 50 ml di tampone M9 (Figura 3-2).
- Lasciare i vermi adulti a pellet per gravità per 10-15 minuti sul ghiaccio.
Nota: Il pellet 2 ml deve contenere ora> 90% vermi adulti. Questo pellet 2 ml dovrebbe avere circa 5 x 10 6 vermi ed è sufficiente per un bombardamento microparticelle. - Rivestire l'intera superficie del refrigerata JM109 seminato piastra NGM con il pellet 2 ml di vermi. Che il liquido sia completamente assorbito poi lasciare la piastraper 30 min in ghiaccio prima di proseguire (Figura 3-3).
- Trasferire circa 1 x 10 6 asincroni unc-119 (ED3 vermi) in 90 ml di mezzi mCeHR in A 175 cm 2 matraccio una settimana prima del bombardamento. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C ona piattaforma di agitazione a ~ 70 rpm (Figura 3-1).
- Preparazione di particelle d'oro
- Pesare 30 mg di particelle d'oro in una provetta siliconato. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% e agitare la provetta per 5 min.
- Lasciare che il tubo a sedere per 15 minuti, poi centrifugare a 6.000 xg per 10 secondi per far sedimentare le particelle d'oro. Rimuovere il surnatante utilizzando un puntale cautamente la punta verso il lato opposto del tubo di particelle d'oro.
- Lavare le particelle d'oro con 1 ml di acqua sterile, vortex per 1 min e centrifugare brevemente la provetta a 6.000 xg per 10 sec. Ripetere la fase di lavaggio due volte, poi risospendere le particelle d'oro in 0,5 ml di soluzione sterile 50% glicerolo.
Nota: La concentrazione finale delle particelle d'oro sarà di 60 mg / ml e può essere conservato per 1-2 mesi a 4 ° C.
- Preparare la miscela di particelle di DNA-oro
- Combinare 10 pg di DNA plasmidico desiderato con 10 &# 956; g del unc-119 di salvataggio plasmide in un siliconato 1,5 ml provetta. Aggiungere 50 ml di acqua deionizzata e 100 ml di ben risospeso soluzione di particelle d'oro poi vortex per 1 min.
- Aggiungere 150 ml di 2,5 M CaCl 2 e agitare nuovamente la soluzione per 1 min. A questa soluzione, aggiungere 60 ml di 0,1 M spermidina e vortex per 3-5 min.
- Pulse centrifugare la soluzione a 6.000 xg per 10 secondi, rimuovere il surnatante e aggiungere 300 ml di etanolo al 70%. Vortex bene per 1 min, impulso centrifugare a 6000 xg, rimuovere il supernatante e risospendere in 170 ml di etanolo al 100%. Vigorosamente agitare la soluzione per 5-10 minuti poi pulsano centrifugare e rimuovere il surnatante.
- Bombardamento (Figura 3-3)
Nota: Questo protocollo è eseguita con il sistema di erogazione di particelle specificato nella tabella dei materiali / Attrezzatura. Seguire le istruzioni per lo strumento consegna particella disponibili.- <li> Inserire un foglio di carta velina in un piatto di 15 centimetri. Usando le pinzette, immergere sette macrocarriers singolarmente in 100% di etanolo e stenderli sul tessuto ad asciugare.
- Pulire accuratamente la camera di biolistic, titolare macrocarrier e piastra bersaglio con etanolo al 70%. Pulire e sterilizzare gli schermi di arresto prima di ogni procedura di bombardamento.
- Caricare i macrocarrriers nel supporto utilizzando pinzette e premere nel supporto utilizzando lo strumento dei posti a sedere.
- Distribuire uniformemente 20 ml del DNA rivestiti particelle d'oro nel centro di ogni macrocarrier e poi lasciare che la soluzione si asciughi completamente.
- Pulire le due parti del divisore pressione con etanolo e assemblare con etanolo puliti dischi di rottura. Avvitare il divisore a pressione montate e dischi di rottura nella camera di bombardamento.
- Montare uno schermo arresto autoclave con il titolare macrocarrier e posizionare l'apparecchio al scaffale di metallo richiesto e bloccare in posizione.
- Inserire il MACR assemblataocarrier apparecchio nella camera biolistic nello slot assegnato sotto del divisore pressione e allinearsi con il divisore pressione.
- Nastro il piatto NGM aperto con i vermi sul ripiano piastra bersaglio e chiudere la porta della camera.
- Per bombardare worm, regolare la pressione a quella necessaria per rompere i dischi di rottura. Accendere il vuoto a 28 pollici di pressione Hg, quindi premere il pulsante di fuoco fino a quando i dischi di rottura.
- Rilasciare il vuoto e rimuovere la piastra NGM dall'apparecchio. Lavare i vermi dalla piastra e ridistribuire in venti 10 piatti cm NGM seminato con JM109 E. coli (Figura 3-4).
- Lasciare i vermi di crescere per 10 a 14 giorni a 25 ° C e morire di fame i piatti. Worms salvati dal difetto unc-119 avranno il movimento normale e possono essere identificate in questo momento. Scegli almeno 10 "di tipo selvatico" vermi da lastre separate per ulteriori analisi in quanto questi rappresentano linee transgeniche indipendenti (Figure 3-5).
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Representative Results
Coltura C. elegans in axeniche aiuti mezzo liquido nella determinazione di sostanze nutritive che sono richiesti dai vermi, senza interferenze da parte di metaboliti secondari prodotti da E. coli. Worm di tipo selvatico N2 acclimatare i media mCeHR entro tre generazioni e mostrano una crescita paragonabile a vermi cresciuti su piastre NGM batteriche. Infatti, questi vermi diventano gravide entro 4 giorni, rispetto a 3,5 giorni per i vermi coltivati sui batteri OP50.
Un vantaggio di utilizzare mCeHR è stato osservato negli studi che hanno esaminato il fabbisogno nutritivo esatto di questi vermi 14. In Figura 1 vermi sono state coltivate in mCeHR integrate con quantità crescenti di eme, fino a 1 mM. Le osservazioni di questi vermi hanno mostrato un ritardo distinto in crescita a concentrazioni eme sotto i 4 micron, con i vermi di sviluppo per la fase larvale L4, ma in grado di passare alla fase gravida dopo nove giorni di mCeHR. A concentrazioni di 10 pM e 2056; M eme i vermi sviluppano allo stadio gravido in 4 giorni e produrre gran numero di progenie. Un numero massimo di progenie è stata osservata quando i vermi sono state coltivate in mCeHR contenente 20 micron eme. Worms continuato a sviluppare e produrre una progenie a 100 micron e 500 micron eme. Tuttavia, il numero di progenie larvale significativamente diminuita rispetto a vermi coltivate alla concentrazione eme ottimale di 20 pM eme. Le concentrazioni eme pari o superiori a 800 micron comportato rachitici, worm malati allo stadio larvale L3, che ha indicato che queste concentrazioni eme sono tossici per i vermi.
Oltre a determinare la concentrazione ottimale eme e l'effetto di eme privazione e tossicità eme su C. crescita elegans, ceppi eme giornalista potrebbe essere utilizzato per valutare indirettamente lo stato eme del verme entro un intervallo di concentrazione più piccolo. Il worm IQ6011 è un worm transgenico che esprime una eme reattivo giornalista trascrizionale, P HRG-1 Figura 2. Espressione GFP è represso a 20 pM eme e aumenta all'aumentare della concentrazione eme è diminuita. I cambiamenti incrementali nella concentrazione eme possono essere correlati con precisione con la risposta genica e nei media mCeHR.
Oltre ad essere in grado di controllare accuratamente le concentrazioni di nutrienti forniti al verme, mCeHR supporti axenic consente la crescita efficiente di un gran numero di vermi sincronizzati. Questa caratteristica può essere sfruttata per microparticelle bombardamento (Figura 3). Utilizzando questa procedura almeno una linea integrato sono stati sviluppati da ogni bombardamento microparticelle effettuate (Tabella 2).
Figura 1. C. elegans curva di crescita eme. Worms sono state coltivate in un intervallo di concentrazioni eme da 0 pM a 1.000 micron di mCeHR per 9 giorni. Il numero di vermi in ogni concentrazione è stato contato e tracciati. A 1,5 micron eme concentrazioni vermi erano L4 e in grado di sviluppare ulteriormente. A 800 micron eme i vermi sono stati stentata nelle fasi L2-L3 e gli effetti di tossicità eme mostrato.
Figura 2. Risposta del sensore eme (Phrg-1 :: GFP) ceppo a diverse concentrazioni eme in mCeHR. Sincronizzato transgenici C. elegans esprimendo HRG-1 :: GFP sono state coltivate in mezzi mCeHR integrato con 4, 8, 10, o 20 micron eme per 48 ore. Le immagini sono state scattate con una Zeiss LSM 710 confocal microscopio. Barra della scala è di 100 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Schema di microparticelle bombardamento in C. elegans con unc-119 vermi coltivate in mCeHR. (1) Circa 3 x 10 7 unc-119 (ED3) vermi sono coltivate in 90 ml mCeHR media. (2) Gravids sono stati autorizzati a stabilirsi su ghiaccio per 10-15 minuti in 50 ml provette coniche. (3) Un pellet 2 ml di circa 5 x 10 6 vermi gravide è stata sparsa uniformemente su una piastra NGM seminata. I vermi sono stati bombardati con 12 microgrammi di plasmide di interesse e 6 mg di unc-119 plasmide salvataggio complessata a particelle d'oro. (4) Tha bombardato i vermi sono stati suddivisi su venti 10 centimetri piastre seminate con la E. coli JM109 ceppo. (5) Dopo 2 settimane di incubazione a 25 ° C, sono stati selezionati piastre con wild type vermi per l'analisi di espressione del transgene forza e tassi di segregazione.
| Tabella 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| Usando una tecnica sterile e 1 L (0,22 micron) unità filtro vuoto, filtrare i seguenti volumi di soluzione madre e acqua nell'ordine descritto. | |
| Colina diacido citrato | 10 ml |
| Vitamina e fattore di crescita mix | 10 ml |
| mio-inositolo | 10 ml |
| Cloruro Hemin | 10 ml |
| Acqua deionizzata | 250 ml |
| Mix acido nucleico | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| Lattoalbumina idrolizzato | 20 ml |
| Essential Amino Acid Mix | 20 ml |
| Non essenziali Amino Acid Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-glucosio | 50 ml |
| HEPES, sale sodico | 10 ml |
| Acqua deionizzata | 250 ml |
| Volume sarà di 800 ml, a questo punto Rimuovere il gruppo filtro dal vuoto poi aggiungere: | |
| Colesterolo | 1 ml |
| Latte scremato ultra-pastorizzato | 200 ml |
| Tabella 1B | |
| Vitamina e fattore di crescita mix, 100 ml | |
| Soluzione 1: A 60 ml di acqua aggiungere: | |
| N-acetil-α-D-glucosamina | 0,15 g |
| DL-alanina | 0,15 g |
| Nicotinamide | 0.075 g |
| D-pantethine | 0,0375 g |
| Acido DL-pantotenico, emi sale di calcio | 0.075 g |
| L'acido folico | 0.075 g |
| Piridossammina 2HCl | 0,0375 g |
| Piridossina HCl | 0.075 g |
| Flavin mononucleotide, sale di sodio | 0.075 g |
| Cloridrato di tiamina | 0.075 g |
| Soluzione 2: Preparare le seguenti sostanze chimiche in 5 ml 1 N KOH: | |
| acido p-aminobenzoico | 0.075 g |
| D-biotina | 0,0375 g |
| Cianocobalamina (B12) | 0,0375 g |
| Acido folinico, sale di calcio | 0,0375 g |
| L'acido nicotinico | 0.075 g |
| Pyridoxal 5-fosfato | 0,0375 g |
| Soluzione 3: 0,0375 g (±) α-L-lipoico, forma ossidata in 1 ml di etanolo: | |
| Combinare soluzioni 1, 2, e 3 e portare il volume finale a 100 ml. Conservare al buio a 4 ° C o congelare aliquote a -20 ° C. Fare piccoli volumi di stock per questo mix così è utilizzato rapidamente. | |
| Tabella 1C | |
| Mix acido nucleico, 100 ml | |
| Per 60 ml di acqua aggiungere: | |
| L'adenosina 5 '-monofosfato, sale di sodio | 1.74 g |
| Citidina 5 '-fosfato | 1.84 g |
| Guanosina 2 '- e 3'-monofosfato | 1.82 g |
| OR | |
| Guanosine 5 '-fosfato | 2.04 g |
| Uridina 5 '-fosfato, sale disodico | 1.84 g |
| Timina (aggiungere l'ultima) | 0.63 g |
| Portare la soluzione a 100 ml e conservare al buio a 4 ° C o congelare aliquote a -20 ° C. Fare piccoli volumi di stock per questo mix così è utilizzato rapidamente. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl 2 • 6H 2 O | 4.1 g |
| Citrato di sodio | 2.9 g |
| Citrato di potassio monoidrato | 4.9 g |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0.07 g |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl 2 | 0,1 g |
| Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O | 0,6 g |
| CaCl 2 • 2H 2 O (voglio sempre l'ultima) | 0,2 g |
| Fare piccoli volumi di stock per questo mix così è utilizzato rapidamente. | |
| Altri componenti | |
| KH 2 PO 4 | 450 mm |
| Colina citrato di acido | 2 mM |
| mio-inositolo | 2,4 mm |
| D-glucosio | 1.45 M |
| Cloruro Hemin | 2 mM in 0,1 N NaOH pH 8,0 |
| HEPES, sale sodico | 1 M soluzione stock |
| Colesterolo | 5 mg / ml in etanolo |
| Lattoalbumina enzimatica idrolizzato | 170 mg / ml |
| Tabella 1F | |
| M9 Buffer, 1 L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H 2 O | 1 L |
| Autoclave 30 min | |
| 1 M MgSO 4 (sterile) | 1 ml |
Tabella 1. Ricette per i componenti di mCeHR e mCeHR.
| Bombardamento | Le linee con wild type salvataggio | Le linee con salvataggio / transgene | Linee stabili |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Media | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tabella 2. AveraNumero ge di transgenici C. elegans generato con microparticelle bombardamento.
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Discussion
In questo protocollo vi presentiamo un axenic mCeHR mezzi liquidi modificato che consente una rapida C. generazione elegans con produzione di un gran numero di vermi. Questo supporto mostra diversi vantaggi come i vermi sono coltivate senza contaminare E. coli o sottoprodotti batterici e possono essere sfruttati in studi nutrizionali e tossicologici. L'uso di E. coli o altri batteri in detti studi ha diversi inconvenienti. Ad esempio, la crescita dei batteri può cambiare in varie condizioni e batteri può metabolizzare molecole che vengono dosati, confondere l'interpretazione dei risultati. Pertanto, lo sviluppo di un mezzo definito per eseguire questi studi è estremamente vantaggiosa.
Sebbene C. elegans sono stati coltivati in terreni liquidi in studi precedenti 15, worm coltivate in C. elegans terreno di mantenimento (CEMM) mostrano un ritardo distinta in tempi di generazione 16, a differenza di quello che abbiamo observe in mCeHR mezzo. Il nostro obiettivo principale era quello di sfruttare C. elegans per studiare l'omeostasi dei nutrienti con particolare enfasi sulla eme e il metabolismo dei metalli. Con questo in mente, mCeHR e modifiche generati dal nostro gruppo realizzare questo obiettivo e ha direttamente portato all'identificazione di un certo numero di geni necessari per mantenere l'omeostasi eme nel verme e infine in sistemi modello vertebrati 17, 18. Riformulati mCeHR-1 media possono anche essere sfruttate per altre specie di nematodi, tra cui Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila, e C. remanei. Inoltre formulazioni metallici a bassa mCeHR-2 e mCeHR-3 possono essere sfruttati in studi che hanno esaminato la tossicità dei metalli pesanti e requisiti 12.
Prima di acclimatazione, worm N2 presentano un tempo di generazione più lungo di circa 7-10 giorni in mCeHR media. Come i vermi sono subcoltura, questa volta generazione diminuisce a 4 giorni, simile a quella di vermi cresciuti su OP50 batteri. Tuttavia, il tempo di generazione può essere più lungo di alcuni vermi mutanti, plausibilmente a causa di difetti di alimentazione, movimento, o specifiche esigenze nutrizionali.
Quando si utilizzano supporti liquidi axeniche è fondamentale che le tecniche sterili esigenti sono utilizzati. Solitamente, l'uso di antibiotici è ridotto al minimo e alla fine eliminato come i vermi acclimatarsi al mezzo ei batteri residui sono eliminati. Gli antibiotici sono inizialmente tenuti a garantire che le culture sono axenic quando stabilito in quanto impedisce la crescita di batteri residui che possono travolgere le colture a vite senza fine. Dopo due cicli successivi di sbiancamento, gli antibiotici sono omessi dalle culture come continuo uso di antibiotici solo maschere poveri tecniche asettiche che sono essenziali per la crescita di vermi in condizioni asettiche. Usando queste tecniche in una cappa a flusso laminare, gli autori sono stati in grado di crescere i vermi in condizioni asettiche senza contaminazioni. Inoltre, la corretta conservazione del media e componenti è essenziale per verme mantenimento e la crescita. I vermi devono essere controllati per il tasso di crescita e subcultura per evitare l'affollamento, che può portare alla formazione di dauer come nutrienti essenziali sono esaurite. Ciò può essere evitato lasciando che la densità di vermi non superi 3.000 vermi / ml / cm 2. I ricercatori che sono nuovi per crescere C. elegans in condizioni asettiche può raggiungere questo controllando i vermi ogni giorno e contando i vermi settimanale.
C. elegans ricercatori sfruttano le sue proprietà trasparenti, generando vermi transgenici che esprimono i marcatori fluorescenti-taggato che consentono la visualizzazione di espressione genica e localizzazione delle proteine. Utilizzando bombardamento biolistic permesso per la generazione di integrants bassi di copia evitati i problemi di array extracromosomici e l'espressione genica elevata ha preso atto con transgenici generati utilizzando l'iniezione 19. In precedenza, uno svantaggio di transgenici di produzione che utilizzanomicroparticelle bombardamento di C. elegans era il requisito per la preparazione piatto uovo per generare il gran numero di unc-119 (ED3) vermi necessari per il regime 20. Ogni trasformazione richiesto 20 piatti a base di uova per il numero di vermi necessari. Utilizzando axenic coltura liquida mCeHR permette una crescita più efficiente e, successivamente, più vermi per bombardamenti. Inoltre, i bombardamenti possono essere utilizzati in combinazione con la selezione della droga per evitare di usare unc-119 (Ed3) vermi 21.
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Disclosures
Gli autori dichiarano non ci sono interessi economici in competizione o conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
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