Summary
C. elegans er normalt dyrkes på faste agarplader eller i flydende kulturer podet med E. coli. At forebygge bakterielle biprodukter fra confounding toksikologiske og ernæringsmæssige undersøgelser vi udnyttet en aksenisk flydende medium, CeHR, at vokse og synkronisere et stort antal orme for en række efterfølgende anvendelser.
Abstract
I denne protokol, vi præsentere de nødvendige materialer, og proceduren for modificeret C. E legans tilvænning og Reproduktion medier (mCeHR). Derudover trinene for at udsætte og acclimatizing C. elegans dyrket på E. coli Axeniske flydende medier er beskrevet. Endelig downstream eksperimenter, der anvender aksenisk C. elegans illustrerer fordelene ved denne procedure. Evnen til at analysere og afgøre C. Kravet elegans næringsstof blev illustreret ved at dyrke N2 vildtype orme i axeniske flydende medier med varierende hæm koncentrationer. Denne procedure kan gentages med andre næringsstoffer til at bestemme den optimale koncentration for orm vækst og udvikling, eller for at bestemme de toksikologiske virkninger af medicinsk behandling. Virkningerne af varierede hæm koncentrationer på væksten af vildtype orme blev bestemt gennem kvalitative mikroskopisk observation og ved kvantificering than antal orme, der voksede i hver hæm koncentration. Desuden kan virkningen af forskellige koncentrationer af næringsstoffer, der skal analyseres ved anvendelse af orme, der udtrykker fluorescerende sensorer, der reagerer på ændringer i næringsstoffer af interesse. Desuden blev et stort antal orme let fremstilles til generering af transgene C. elegans hjælp mikropartikelbombardement.
Introduction
Jordbunden rundorm, Caenorhabditis elegans, er en kraftig model organisme, der anvendes i en lang række undersøgelser fra genetik til toksikologi. Som et resultat af dens 1 mm størrelse, hurtige generationstid på fire dage, let dyrkning, og store afkom numre, har disse nematoder blevet udnyttet i en række genetiske og farmakologiske skærme 1, 2. Forskere drage fordel af denne orm til at identificere molekyler og veje bevaret i hvirveldyr-systemer. Disse veje omfatter celledød signaler, veje for aldring og stofskifte, og nervesystemet 3-6. Derudover gennemsigtighed C. elegans giver mulighed for generering af transgene linjer ved hjælp af fluorescerende protein reportere, som kan visualiseres direkte at analysere genekspression mønstre og protein lokalisering.
I mange undersøgelser denne nematode dyrkes på en solid agarbaseret overflade ved hjælp nematode medium vækst (NGM) plader eller i liquid kulturer podes med Escherichia coli som en fødekilde 7,8. Disse bakterielle fødekilder kan forvirre biokemiske og toksikologiske undersøgelser med interferens fra bakteriel biprodukter påvirker fortolkningen af resultaterne. For at undgå disse kompoundering virkninger C. elegans kan dyrkes i et axeniske flydende medier, der er blottet for bakterier som en fødekilde. Ved hjælp af dette medie, vi med succes dyrket millioner af meget synkroniserede orme for mange standard C. elegans protokoller herunder microarray analyse af differentielt regulerede gener i C. elegans udsat for forskellige hæm-koncentrationer, og produktionen af transgene orme anvender gen bombardement. Dette medie er kemisk definerede, og modificeret fra en original opskrift formuleret af Dr. Eric Clegg 9. Ved hjælp af denne mCeHR medier, har vi med succes identificeret gener involveret i hæm homeostase, kaldet hæm responsive gener (HRG er) 10, hvilket villehar ikke været muligt i regelmæssige vækstbetingelser, der anvender NGM agarplader podet med E. coli.
I denne protokol beskriver vi proceduren for oprettelse og vedligeholde C. elegans dyrket på E. coli til aksenisk mCeHR og udnytte denne metode til at opnå et stort antal orme til fremstilling af transgene C. elegans linjer ved hjælp af mikropartikelbombardement. Præsenterer vi også undersøgelser, der viser nytten af at bruge axeniske medier til bestemmelse af ernæringsmæssige krav C. elegans hjælp hæm som et eksempel. Disse undersøgelser viser, at ved hjælp af mCeHR medier giver hurtig vækst af et stort antal af C. elegans for mange downstream-applikationer udnyttet af ormen forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Worm Stammer
- Anskaf C. elegans vildtype Bristol N2 stammer fra Caenorhabditis Genetik Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc), og vedligeholde dem på NGM plader podet med E. coli-stamme OP50 7. Bemærk: Transgene orm stammer IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) udnyttet blev genereret som tidligere beskrevet 11. IQ6011 kan rekvireres fra den tilsvarende forfatter.
2. Fremstilling af Modified C. elegans Habitation og Reproduktion Medium (mCeHR)
Forbered mCeHR flydende medier som beskrevet nedenfor 12. Denne aksenisk flydende medier giver orme at vokse uden ekstra fødekilder. Udføre alle manipulationer af axeniske flydende medier og axeniske orme anvender strengt sterile forhold, såsom en laminar flow hætte.
- Opnå ultra pasteuriseret fedtfri mælk fra en købmand. Brug det kølede prokanalen og ikke rumtemperaturen produkt. Før anvendelse i mCeHR medium streak mælken på Brain Heart Infusion (BHI)-agar plader og inkuberes i 3 dage ved 30 ° C og 37 ° C for at kontrollere steriliteten. Overfør mælken til 50 ml sterile rør og opbevares ved -80 ° C
- Forbered hver af følgende komponenter og kombinere i den rækkefølge og beløbene til at forberede 1 L mCeHR (tabel 1A): 10 ml 2 mM cholin diacid citrat, 10 ml vitamin-og vækstfaktor mix (se opskrift i tabel 1B) 10 ml af 2,4 mM myo-inositol, 10 ml 2 mM hemin chlorid, 250 ml deioniseret vand. Sugning og filtreres gennem et 0,22 um filter enhed.
- Der tilsættes 20 ml nukleinsyre mix (opskrift i tabel 1C), 100 ml mineralblanding (opskrift i tabel 1D), 20 ml 170 mg / ml lactalbuminhydrolysat, 20 ml essentielle aminosyrer, 10 ml ikke-essentielle aminosyrer syrer, 20 ml 450 mM KH 2PO 4,50 ml 1,45 M D-glucose, 10 ml 1 M HEPES, natriumsalt, 250 ml deioniseret vand.
- Sugning Filtersteriliser komponenterne. Fjern filteret og tilsæt 1 ml 5 mg / ml kolesterol. Sørg for, at pH-værdien af mediet er ca 6-6,5. Bemærk: Denne opløsning kan opbevares ved -80 ° C i op til et år.
- Tilsæt 20% (v / v) ultra pasteuriseret organisk skummetmælk til mCeHR medium før brug. Brug omhyggeligt steril teknik (for eksempel i en laminær strømning) ved åbning og afmåles mælken. Opbevar ved 4 ° C.
3.. Forbered C. elegans for Kultur i Axeniske mCeHR lage
- Grow orme på ti 60 mm NGM plader indtil der er mange Gravid orme og en minimal mængde OP50 E. coli på pladerne.
- Fjern orme fra hver plade ved skylning med 5 ml M9-puffer (opskrift i tabel 1F) og kombineres i et 50 ml konisk rør.
- Lad orme til settle ved at lade røret stå i 5 til 10 min derefter forsigtigt fjerne supernatant, der indeholder E. coli.
- Gentag trin 3.2 og 3.3 2x at fjerne så meget af de resterende bakterier som muligt før fortsætter proceduren.
- Resuspender orme i 0,1 N NaCl i et volumen, der er et multiplum af tre, for eksempel 1,5 ml, 3 ml eller 6 ml, hvor de enkelte orme kan ses i røret.
- Blege orme ved tilsætning af 5 N NaOH og 5% natriumhypochlorit (blegemiddel) opløsning i et 01:02:06-forhold ormen suspension. For eksempel, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% natriumhypochlorit: 6 ml af ormen suspension. Bland NaOH og blegemiddel før du tilføjer til ormen suspension.
- Vortex løsningen kraftigt, indtil de drægtige orme opløses og kun æg er synlige inden suspensionen (ca. 5 til 10 min). Overvåge processen ved hjælp af et fasekontrast mikroskop med en 10X målsætning.
- Efter ormene har fuldstændig opløst straks pelletereæg ved 800 xg i 45 sekunder ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og skyl pellet to gange med 10 ml sterilt vand ved centrifugering pelleten ved 800 xg i 45 sekunder ved 4 ° C.
- Efter blegning, overføre ægget pellet overføres til et 25 cm2 vævskultur-kolbe indeholdende 10 ml af mCeHR medier suppleret med 100 ug / ml tetracyclin. Udfør denne procedure ved hjælp af sterile teknikker. Hvis det ønskes, tilsættes yderligere antibiotika, herunder 250 ug / ml nalidixinsyre for at forhindre bakteriel vækst i axeniske flydende kulturer.
- Inkubér flydende kulturer ved 20 ° C på en rysteinkubator ved cirka 70 rpm.
- Kontroller orme dagligt at notere den fase af udviklingen og væksten.
Bemærk: Orme vil i første omgang vokser langsomt og kræver 7 til 10 dage til at blive gravide. Men som ormene vænne sig til det flydende medium generation tiden vil falde til ca 4 dage for vildtype (N2) orme. - Efter orme har developed til gravide fase i flydende medier, overføre ormen kultur til et konisk rør, og pelletere orme ved 800 xg i 5 minutter ved 4 ° C under anvendelse af en svingende spand rotor.
- Fjern supernatanten og forsigtigt resuspender ormen pellet i et lige volumen af 0,1 M NaCl. For eksempel ved at bruge 10 ml 0,1 M NaCl for orme dyrket i 10 ml mCeHR. Lad orme til at nøjes med 5 min på is.
- Udføre blegning procedure som beskrevet ovenfor i trin 3,5-3,8 og lade orme at vokse i en anden generation i axeniske flydende medier. Hvis det er nødvendigt, tilføje antibiotika igen for at hæmme bakterievækst.
- Igen tillader orme at blive gravide derefter pelletere og resuspender orme i 0,1 M NaCl som beskrevet i trin 3.12 og 3.13, derefter bleges igen som beskrevet i trin fra 3,5 til 3,8, for at fremstille en synkroniseret population. Grow L1 larve orme i flydende medier uden antibiotika fra nu af.
4.. Synkronisering Worms fra LiquidKultur
- Pellet og opblande orme i 0,1 M NaCl som beskrevet ovenfor i trin 3.12 og 3.13. Blegemiddel som beskrevet ovenfor i trin fra 3,5 til 3,8.
- Resuspender ægget pellet i 10 ml M9-puffer og tillade larver udklækkes O / N ved 20 ° C på et roterende rystebord. Bemærk: Æggene klækkes i L1 larver, men vil ikke udvikle sig yderligere, synkronisering orme på L1 scenen.
- For at fastholde og subkultur orme, pellet L1 larver ved 800 xg i 5 min, og derefter resuspenderes larverne i 10 ml mCeHR og overførsel til et 25 cm 2 kolbe. Lad orme at vokse ved 20 ° C på en roterende platform. Opretholde en maksimal tæthed på 3.000 orme / ml / cm 2 for at sikre tilstrækkelig ernæring for orme.
Bemærk: På dette stadie, antibiotika ikke forpligtet til at opretholde axeniske vilkår, når de procedurer, der udføres ved hjælp af sterile teknikker i en laminar flow hætte. Bør kontrolleres dagligt Worms at overvåge vækst.
5.. Freepift og optøning Worms for Axeniske Medium Cultures
- Frys axeniske asynkrone orm kulturer eller synkroniseret L1 larver i flydende nitrogen. Pellet orme ved 800 xg i 5 minutter, derefter resuspenderes i S-puffer (6,45 mM KHPO 4 43.55 mM KHPO 4 146.25 mM NaCl) ved anvendelse af 0,5 ml til hvert hætteglas. Tilsættes en lige mængde af S-puffer med 30% v / v glycerol til hvert hætteglas og overføre orme til -80 ° C før langtidsopbevaring i flydende N2. Frys ca 1 x 10 6 orme pr ml i hvert hætteglas.
- Tø orme ved at inkubere hætteglas ved 37 ° C i cirka 2 min, indtil næsten al isen er smeltet. I en laminar flow hætte, overføre orme til en steril kolbe indeholdende mCeHR og placere dem ved 20 ° C.
6.. Bestemme virkningen af Hæmin Koncentration om Vækst og Reproduktion i mCeHR
- Brug axeniske mCeHR medier til assay næringsstof afhængige vækst af C. elegans. For at bestemme virkningen of hæmin koncentration om orm vækst og udvikling, anvendelse synkroniseret axeniske N2 orme eller andre stammer af interesse. Synkroniser L1 larver som beskrevet ovenfor i afsnit 4.
- På den følgende dag, piller og tælle synkroniseret L1 larver og fortyndes til 1 orm pr pi axeniske medier. Lav 10 mM hemin chlorid i 0,3 M NH4 OH og justeres til pH 8 med koncentreret HCI.
- Tilføj 800 pi mCeHR medier til en 24-brønds plade. Tilsæt 100 orme til hver brønd i 100 pi medie. Tilføj hemin chlorid til hver brønd i koncentrationer i området fra 0 pM, 1,5 pM til 1,000 pM i tre eksemplarer. Sørg for, at alle brønde indeholder samme koncentration på 0,3 M NH4OH. Forsigtigt resuspenderet orme inden pipettering at sikre, at 100 L1 larver tilsættes til hver brønd.
- Undersøg orme dagligt og bemærk væksten i hver koncentration i hver brønd. Tæl antallet af orme efter 9 dages inkubering og plotte antallet af orme / ml svarende til hver hæmkoncentration (figur 1).
7.. Virkning af Hæmin Koncentration på Heme Sensor Worms
- Inkuber synkroniserede L1 hæm sensor orme (Phrg-1 :: GFP) i mCeHR indeholdende 4 pM, 8 uM, 10 uM og 20 uM hæmin.
- Billede ormene anvender fluorescens konfokal mikroskopi, 48 timer efter inkubation (figur 2).
8.. Udnytte mCeHR at generere transgene C. elegans Brug mikropartikelbombardement
Bemærk: Proceduren for at skabe og udføre mikropartikelbombardement hjælp UNC-119 (ed3) orme dyrket i mCeHR er skitseret i figur 3 13.
- Worm Forberedelse
- Overfør ca 1 x 10 6 asynkrone UNC-119 (ed3) orme i 90 ml mCeHR medier i en 175 cm2 kolbe en uge før bombardementet. Lad orme at vokse ved 20 ° C ona ryster platform på ~ 70 rpm (Figur 3-1).
Bemærk: En uge senere, bør ormen tæthed være væsentligt større med mange voksne gravide orme. Ca. 3 x 10 7 orme vil være behov for mikropartikelbombardement. - Chill JM109 E. coli podedes 10 cm NGM plader på is.
- Overfør axeniske orme til to 50 ml koniske rør og centrifugeres ormene ved 800 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og resuspender orme i hvert rør i 50 ml M9-puffer (Figur 3-2).
- Lad de voksne orme at pelletere ved tyngdekraft i 10 til 15 minutter på is.
Bemærk: 2 ml pellet skal nu indeholder> 90% voksne orme. Denne 2 ml pellet skal have cirka 5 x 10 6 orme og er tilstrækkelige for en mikropartikelbombardement. - Coat hele overfladen af den afkølede JM109 podet NGM plade med 2 ml pellet af orme. Lad væsken blive helt absorberet derefter forlade pladen30 minutter på is, før du fortsætter (Figur 3-3).
- Overfør ca 1 x 10 6 asynkrone UNC-119 (ed3) orme i 90 ml mCeHR medier i en 175 cm2 kolbe en uge før bombardementet. Lad orme at vokse ved 20 ° C ona ryster platform på ~ 70 rpm (Figur 3-1).
- Fremstilling af guldpartikler
- 30 mg guldpartikler afvejes i et silikonebehandlet mikrocentrifugerør. Tilsæt 1 ml 70% ethanol og vortex røret i 5 min.
- Lad røret til at sidde i 15 minutter, centrifugeres ved 6000 x g i 10 sek for at pelletere guldpartikler. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids ved forsigtigt at røre spidsen til den side af røret modsat guldpartiklerne.
- Vask guldpartikler med 1 ml sterilt vand, vortex i 1 min og kortvarigt centrifugeres røret ved 6.000 x g i 10 sek. Gentag vasketrinet to gange og derefter resuspenderes guldpartikler i 0,5 ml steril 50% glycerol.
Bemærk: Den endelige koncentration af guldpartikler vil være 60 mg / ml, og det kan opbevares i 1 til 2 måneder ved 4 ° C.
- Forbered DNA-guld partikel mix
- Kombiner 10 ug af det ønskede plasmid-DNA med 10 &# 956 g af UNC-119 redning plasmid i en silikoniseret 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der tilsættes 50 pi af DI-vand og 100 pi godt resuspenderet guldpartikel opløsning derefter vortex i 1 min.
- Tilføj 150 pi 2,5 M CaCl2 og vortex løsningen igen i 1 min. Til denne opløsning tilsættes 60 ul 0,1 M spermidin og vortex i 3 til 5 minutter.
- Pulscentrifugering løsningen ved 6.000 xg i 10 sek, supernatanten fjernes, og der tilsættes 300 pi 70% ethanol. Vortex godt for 1 min, puls centrifuge ved 6.000 xg, supernatanten fjernes, og resuspender i 170 pi 100% ethanol. Vortexes kraftigt opløsningen i 5 til 10 minutter, derefter Pulscentrifugering og fjern supernatanten.
- Bombardement (Figur 3-3)
Bemærk: Denne protokol udføres med levering af partikler, som er specificeret i tabellen i Materials / udstyr. Følg instruktionerne for levering af partikler instrument til rådighed.- <li> Placer et ark silkepapir i en 15 cm plade. Ved hjælp af en pincet, dyppe syv macrocarriers individuelt i 100% ethanol og lægge dem på vævet til tørre.
- Rengør biolistiske kammer, makrobæreren holder, og target plade med 70% ethanol. Rens og autoklavere stoppe skærme inden hver bombardement procedure.
- Læg de macrocarrriers i holderen med en pincet og tryk i holderen ved hjælp af siddepladser værktøj.
- Jævnt fordelt 20 ul DNA belagte guldpartikler i midten af hver makrobæreren og derefter lad opløsningen tørre helt.
- Rengør de to dele af trykdeleren med ethanol og samle med ethanol rengøres ruptur diske. Skru den samlede trykdeleren og ruptur diske i bombardementet kammeret.
- Saml en autoklaveret standsning skærmen med makrobæreren holder og placer apparatet på hylden metal kræves, og lås på plads.
- Sæt den samlede macrocarrier apparatur i biolistiske kammer i den tildelte slot under trykdeleren og flugte med trykdeleren.
- Tape den åbne NGM plade med ormene på hylden målplade og lukke døren af kammeret.
- At bombardere orme justere trykket til, der skulle bryde brud diske. Tænd for vakuum til 28 inches Hg tryk, tryk derefter på brand-knappen, indtil diskene briste.
- Slip vakuum og fjern NGM plade fra apparatet. Vask orme fra pladen og videredistribuere i tyve 10 cm NGM plader podet med JM109 E. coli (figur 3-4).
- Lad orme at vokse i 10 til 14 dage ved 25 ° C og sulte pladerne. Worms reddet fra UNC-119 defekt vil have normal bevægelse og kan identificeres på dette tidspunkt. Pick mindst 10 "vildtype" orme fra separate plader for yderligere analyser, da disse repræsenterer uafhængige transgene linjer (Figure 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrkning C. elegans i axeniske flydende medium hjælpemidler i fastlæggelsen af næringsstoffer, der kræves af orme, uden indblanding fra sekundære metabolitter produceret af E. coli. Vildtype N2 orme akklimatisere til mCeHR medier inden for tre generationer og vise vækst sammenlignelig for orme dyrket på NGM bakterielle plader. Faktisk er disse orme bliver gravide indenfor 4 dage sammenlignet med 3,5 dage for orme dyrkes på OP50 bakterier.
En fordel ved at bruge mCeHR blev set i studier, der undersøgte den nøjagtige krav næringsstof af disse orme 14. I figur 1 orme blev dyrket i mCeHR suppleret med stigende mængder af hæm, op til 1 mm. Observationer af disse orme viste en tydelig forsinkelse i vækst hæm koncentrationer under 4 mM, med orm udvikler til L4 larvestadiet men ude af stand til at gå videre til den gravide etape efter ni dage i mCeHR. Ved koncentrationer på 10 pM og 2056. M hæm orme udvikle sig til den gravide etape i 4 dage og producere store antal afkom. Et maksimalt antal afkom blev set, når orme blev dyrket i mCeHR indeholdende 20 uM hæm. Worms fortsatte med at udvikle og producere afkom på 100 m og 500 pM hæm. Imidlertid er antallet af larvestadiet afkom faldet betydeligt i sammenligning med orme dyrket ved den optimale hæm koncentration på 20 uM hæm. Hæm-koncentrationer på eller over 800 uM resulterede i forkrøblede, sygelig orme på L3 larvestadiet, hvilket indikerede, at disse hæm-koncentrationer giftigt for orme.
Ud over at fastslå den optimale hæm koncentrationen og effekten af hæm afsavn og hæm toksicitet på C. elegans vækst, kan hæm reporter stammer anvendes til indirekte at vurdere hæm status ormen inden for et mindre koncentrationsområde. Den IQ6011 orm er en transgen orm, der udtrykker en hæm lydhør transkriptionel reporter P HRG-1 figur 2. GFP-ekspression er undertrykt ved 20 uM hæm og øger det heme koncentrationen nedsættes. De gradvise ændringer i hæm koncentration kan præcist korreleret med gen-respons og udtryk i mCeHR medier.
Ud over at være i stand til omhyggeligt at kontrollere næringsstofkoncentrationer leveret til ormen, mCeHR aksenisk medier giver mulighed for effektiv vækst af et stort antal synkroniserede orme. Denne funktion kan udnyttes til mikropartikelbombardement (Figur 3). Ved hjælp af denne procedure mindst én integreret linje er blevet udviklet fra alle mikropartikelbombardement foretaget (tabel 2).
Figur 1. C. elegans hæm vækstkurve. Worms blev dyrket i en række hæm koncentrationer fra 0 pM til 1,000 pM i mCeHR til 9 dage. Antallet af orme i hver koncentration blev talt og plottes. På 1,5 pm hæm koncentrationer orme var L4 og ude af stand til at videreudvikle. Ved 800 uM hæm ormene blev hæmmet på L2-L3 etaper og viste effekter af heme toksicitet.
Figur 2.. Reaktion af hæm sensor (Phrg-1 :: GFP) stamme til forskellige hæm koncentrationer i mCeHR. Synkroniseret transgene C. elegans udtrykker HRG-1 :: GFP blev dyrket i mCeHR medium suppleret med 4, 8, 10 eller 20 uM hæm i 48 timer. Billeder blev taget med et Zeiss LSM 710 confocal mikroskop. Målestokken er 100 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Skematisk af mikropartikelbombardement i C. elegans bruge UNC-119 orme dyrket i mCeHR. (1) Ca. 3 x 10 7 UNC-119 (ed3) orme dyrkes i 90 ml mCeHR medier. (2) drægtige fik lov til at slå sig ned på is i 10-15 min i 50 ml koniske rør. (3) 2 ml pellet på cirka 5 x 10 6 drægtige orme blev spredt jævnt på en unseeded NGM plade. Ormene blev bombarderet med 12 ug plasmid af interesse og 6 ug UNC-119 redning plasmid kompleks med guld partikler. (4) Than bombarderet orme var delt på tyve 10 cm plader podet med E. coli-stamme JM109. (5) Efter 2 uger inkubation ved 25 ° C blev plader med vildtype orme udvalgt til analyse af transgenekspression styrke og adskillelse satser.
| Tabel 1A | |
| CeHR, 1 L | |
| Brug steril teknik og en 1 L (0,22 mm) vakuum filterenhed, filtrere følgende mængder stamopløsninger og vand i den rækkefølge, der er beskrevet. | |
| Cholin diacid citrat | 10 ml |
| Vitamin-og vækstfaktor-mix | 10 ml |
| myo-inositol | 10 ml |
| Hæmin chlorid | 10 ml |
| Demineraliseret vand | 250 ml |
| Nukleinsyre mix | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| Lactalbuminhydrolysat | 20 ml |
| Essential Amino Acid Mix | 20 ml |
| Ikke-essentielle aminosyre Mix | 10 ml |
| KH 2 PO4 | 20 ml |
| D-glucose | 50 ml |
| HEPES, natriumsalt | 10 ml |
| Demineraliseret vand | 250 ml |
| Volumen vil være 800 ml på dette punkt Fjern filteranlæg fra vakuum derefter tilføje: | |
| Kolesterol | 1 ml |
| Ultra-pasteuriseret skummetmælk | 200 ml |
| Tabel 1B | |
| Vitamin-og vækstfaktor mix, 100 ml | |
| Løsning 1: Til 60 ml vand tilsættes: | |
| N-acetyl-α-D-glucosamin | 0,15 g |
| DL-alanin | 0,15 g |
| Nicotinamid | 0,075 g |
| D-pantethin | 0,0375 g |
| DL-pantothensyre hemicalciumsalt | 0,075 g |
| Folinsyre | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCI | 0,0375 g |
| Pyridoxin HCl | 0,075 g |
| Flavinmononucleotid, natriumsalt | 0,075 g |
| Thiaminhydrochlorid | 0,075 g |
| Løsning 2: Forbered følgende kemikalier i 5 ml 1 N KOH: | |
| p-aminobenzoesyre | 0,075 g |
| D-biotin | 0,0375 g |
| Cyanocobalamin (B12) | 0,0375 g |
| Folinsyre, calciumsalt | 0,0375 g |
| Nicotinsyre | 0,075 g |
| Pyridoxal-5-phosphat | 0,0375 g |
| Løsning 3: 0,0375 g (±) α-L-liponsyre, oxiderede form i 1 ml ethanol: | |
| Kombiner opløsninger 1, 2, og 3, og bringe det endelige volumen til 100 ml. Opbevares i mørke ved 4 ° C eller nedfryses ved -20 ° C. Lav små mængder af bestande, for denne blanding, så det bliver brugt hurtigt. | |
| Tabel 1C | |
| Nukleinsyre mix, 100 ml | |
| Til 60 ml vand tilsættes: | |
| Adenosin 5'-monophosphat, natriumsalt | 1,74 g |
| Cytidine 5'-phosphat | 1,84 g |
| Guanosin 2 '- og 3'-monophosphat | 1,82 g |
| OR | |
| Guanosin 5'-phosphat | 2,04 g |
| Uridin 5'-phosphat-dinatriumsalt | 1,84 g |
| Thymin (tilføj sidst) | 0,63 g |
| Bring løsning til 100 ml og butik i mørke ved 4 ° C eller nedfryses ved -20 ° C. Lav små mængder af bestande, for denne blanding, så det bliver brugt hurtigt. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl2 • 6H 2 O | 4,1 g |
| Natriumcitrat | 2,9 g |
| Kaliumcitrat monohydrat | 4,9 g |
| CuCl2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCI2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl2 | 0,1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O | 0,6 g |
| CaCl2 • 2H 2 O (altid tilføje sidste) | 0,2 g |
| Lav små mængder af bestande, for denne blanding, så det bliver brugt hurtigt. | |
| Andre komponenter | |
| KH 2 PO4 | 450 mM |
| Cholin di-syre-citrat | 2 mM |
| myo-inositol | 2.4 mM |
| D-glucose | 1,45 M |
| Hæmin chlorid | 2 mM i 0,1 N NaOH, pH 8,0 |
| HEPES, natriumsalt | 1 M stamopløsning |
| Kolesterol | 5 mg / ml i ethanol |
| Lactalbumin enzymatisk hydrolysat | 170 mg / ml |
| Tabel 1F | |
| M9 Buffer, 1 L | |
| KH 2 PO4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H2O | 1 L |
| Autoklave 30 min | |
| 1 M MgSO4 (sterilt) | 1 ml |
Tabel 1.. Opskrifter til komponenter af mCeHR og mCeHR.
| Bombardement | Linier med vildtype redning | Linier med redning / transgen | Stabile linjer |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8. | 5. | 0 | |
| 3 | 4. | 4. | 2 |
| 4. | 5. | 2 | 1 |
| 5. | 5. | 3 | 1 |
| Gennemsnitlig | 4.8 | 3.2 | 1 |
Tabel 2. Average antallet af transgene C. elegans genereres ved hjælp af mikropartikelbombardement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol præsenterer vi en modificeret aksenisk flydende medier mCeHR der giver mulighed for hurtig C. elegans generation med produktion af et stort antal orme. Dette medie viser flere fordele som orme dyrkes uden at forurene E. coli eller bakterielle biprodukter og det kan udnyttes i ernæringsmæssige og toksikologiske undersøgelser. Anvendelsen af E. coli eller andre bakterier i sådanne undersøgelser har flere ulemper. For eksempel kan væksten af bakterierne ændre under forskellige betingelser og bakterier kan metabolisere molekyler, der bliver analyseret, confounding fortolkningen af resultaterne. Derfor er udviklingen af et defineret medium til at udføre disse undersøgelser, er meget fordelagtig.
Skønt C. elegans er blevet dyrket i flydende medier i tidligere undersøgelser 15, orme, der dyrkes i C. elegans vedligeholdelse medium (CeMM) viser en tydelig forsinkelse i generation gange 16, i modsætning til hvad vi observe i mCeHR medium. Vores vigtigste mål var at udnytte C. elegans til at studere næringsstof homeostase med særlig vægt på hæm og metal stofskifte. Med dette i tankerne, mCeHR og modifikationer genereret af vores gruppe nå dette mål, og har direkte ført til identifikation af en række gener, der er nødvendige for at opretholde hæm homeostase i ormen og i sidste ende i hvirveldyr modelsystemer 17, 18. Reformuleret mCeHR-1-medier kan også udnyttes til andre nematodeart herunder Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila og C. remanei. Desuden metal formuleringer lave mCeHR-2 og mCeHR-3 kan udnyttes i studier undersøger tungmetalforgiftning og krav 12.
Forud for akklimatisering, N2 orme udviser en længere generationstid på ca 7 til 10 dage i mCeHR medier. Som orme subdyrkes, denne generation gang falder til 4 dage, der svarer til det orme dyrkes på OP50 bakterier. Dog kan generation være længere for visse mutant orm, plausibelt på grund af fejl i fodring, bevægelse, eller særlige ernæringsmæssige behov.
Ved anvendelse af axeniske flydende medier er det afgørende, at kræsne sterile teknikker udnyttes. Normalt er anvendelse af antibiotika minimeres, og til sidst fjernes som ormene akklimatisere til mediet og de resterende bakterier er elimineret. Antibiotika er i første omgang forpligtet til at sikre, at de kulturer er aksenisk når etableret, da det forhindrer vækst af resterende bakterier, der kan overvælde ormen kulturer. Efter to på hinanden følgende runder af blegning, antibiotika udeladt fra kulturer som stadige brug af antibiotika kun masker dårlige aseptiske teknikker, der er afgørende for voksende orme axenisk. Hjælp af disse teknikker i et lagdelt stinkskab har forfatterne været i stand til at vokse orme axenisk uden forurening. Derudover forsvarlig opbevaring af MEDIA og komponenter er afgørende for orm vedligeholdelse og vækst. Ormene skal kontrolleres for væksten og subdyrkes at forhindre fortrængning, hvilket kan føre til dauer dannelse som essentielle næringsstoffer er udtømte. Dette kan forhindres ved at sikre, at tætheden af orme ikke overstiger 3.000 orme / ml / cm2. Forskere, der er nye til voksende C. elegans axenisk kan opnå dette ved at kontrollere orme dagligt og tælle orme ugentligt.
C. elegans forskere drage fordel af sin gennemsigtige egenskaber ved at generere transgene orme udtrykker fluorescens-mærkede markører, der giver mulighed for visualisering af genekspression og protein lokalisering. Ved hjælp af biolistisk bombardement tilladt for generering af lave kopi integranter der undgået spørgsmål om ekstrakromosomale arrays og forhøjet genekspression noterede med transgene genereres ved hjælp af injektion 19.. Tidligere ene ulempe at generere transgene hjælpmikropartikelbombardement C. elegans var kravet til fremstilling æg plade til at generere det store antal unc-119 (ed3) orme, der er nødvendige for den procedure 20. Hver transformation krævede 20 æg plader for antallet af orme nødvendige. Brug aksenisk mCeHR flydende kultur mulighed for mere effektiv vækst og efterfølgende flere orm til bombardementer. Derudover kan bombardementer anvendes i forbindelse med lægemiddel-selektion for at undgå at bruge UNC-119 (ED3) orme 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer findes der ingen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of HealthGrants DK85035 og DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
