Summary
在这个视频文章中，我们描述了诱导细胞蛋白表达的体外合成修饰的mRNA。
Abstract
外源递送的期望的细胞编码合成的信使RNA（mRNA），用于诱导蛋白质合成的具有在再生医学，基础细胞生物学，治疗疾病，和细胞的重编程领域的巨大潜力。在这里，我们描述了一步步的协议，用于生成修改的表达与诱导蛋白表达的减少的免疫激活潜力和增加的稳定性，产生的mRNA的质量控制，细胞的转染mRNA和验证通过流式细胞术。达用的eGFP基因的单一转染后3天，在转染的HEK293细胞中产生绿色荧光蛋白。在这个视频文章中，绿色荧光蛋白的mRNA的合成被描述为一个例子。但是，该过程可以适用于生产其它所需的基因。采用改良的mRNA的合成，细胞可被诱导以瞬时表达所需的蛋白，它们通常不会表达。
Introduction
在细胞中，转录出信使RNA（mRNA）的与mRNA的下面翻译成所需蛋白质确保细胞的正常功能。遗传性或获得性遗传性疾病可导致合成蛋白质的不足，功能失调而引起严重的疾病。因此，一种新的治疗方法来诱导产生缺失或有缺陷的蛋白质是外源递送合成的修饰基因导入细胞，对于所期望的蛋白质编码。因此，细胞触发合成功能蛋白，它们通常不能生产或自然不会需要。使用这种方法，遗传性疾病可以通过引入基因的被纠正，对于有缺陷或缺失的蛋白1码。 mRNA的治疗也可以用于疫苗接种到synthetize蛋白质抗原，其是由肿瘤细胞或病原体表达的。从而，宿主的免疫系统可被激活，有效地消除肿瘤细胞或防止INFEctions 2,3。此外，近年来，基因被成功地用于产生诱导的多能干细胞（iPS细胞）。为了这个目的，成纤维细胞，转染的mRNA诱导重编程的表达因子4-6，并将其与在再生医学中的巨大潜力转化中的iPSC。
先前，使用常规的mRNA的低稳定性和强免疫原性有关。因此，常规的mRNA的临床应用受到限制。然而，胞苷和尿苷的取代5-甲基胞苷和假尿嘧啶mRNA分子通过Kariko和同事内呈现的mRNA分子稳定的生物流体中，并极大地降低了免疫激活7-10，它现在允许修饰mRNA的临床适用性。
使用合成产生的改性的mRNA，所需基因转录物可以暂时在体内 11交付或体外诱导蛋白表达。所引入的基因是由蜂窝翻译机制在生理条件下转化。由于缺乏整合到宿主细胞基因组相比，病毒的基因治疗载体，肿瘤发生的风险，防止12,13。因此，使用改性合成基因疗法将会得到更好的临床认可的未来。
在这里，我们描述了用于生产改性的mRNA（ 图1），转染细胞的mRNA和蛋白表达的转染细胞中的评价的详细协议。
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Protocol
1.增强质粒含有所需的编码DNA序列（CDS）
- 预暖的SOC培养基，其中包括在转化试剂盒，室温并含有100μg/ ml氨苄青霉素至37℃的LB琼脂平板上。平衡的水浴中以42℃。
- 解冻的化学组分E的一个小瓶大肠杆菌在冰上。
- 添加1-5微升质粒（第10至100毫微克）含有CDS成化学成分E.小瓶大肠杆菌 ，轻轻混匀。不要吹打混合细胞。加入质粒后，通过敲击管轻轻拌匀。
- 在冰上孵育混合物30分钟。
- 热休克E.大肠杆菌 30秒在42℃的水浴中不摇动。
- 放置在冰上小瓶2分钟。
- 添加250μl的预热SOC培养基对大肠杆菌大肠杆菌和水平摇晃细菌在300rpm下进行1小时，在37℃的细菌培养箱中培养。
- 散布加入100μl和150μl的从转化混合物在预热的LB琼脂平板上，倒置平板孵育过夜，在37℃。
- 后菌落变得可见，接种从各板单菌落到含有5ml的LB培养基中以100μg/ ml的氨苄青霉素的15毫升的培养管中。过夜孵育它们在37℃下，以300rpm振荡培养，直到培养是在晚对数或固定相。
- 对于长期储存的转化的大肠杆菌的大肠杆菌，移液管将75μl100％的甘油，放入离心管。加入225微升的细菌培养（冷冻股票将包含25％甘油）中，拌匀和离心管储存在-80℃。
- 分离含有使用根据制造商的说明书的质粒纯化试剂盒所需的CDS的质粒。
- 测定使用分光光度计质粒浓度。
- 制备的20微升等分试样，并将其存储在-20℃下延长的时间。
- 注：为了获得用于体外转录（IVT）的，感兴趣的CDS的，这里的eGFP，用PCR扩增的DNA模板。同时，聚T型尾翼120胸腺嘧啶（T），通过使用反向引物使用T 120分机加入到插入物。因此，所产生的mRNA得到聚A尾与IVT之后，定义的长度。
- 制备PCR反应混合物中如表1中详述。
- 调匀反应混合物。注：PCR产物可以在4-5，IVT反应中使用。以增加DNA模板量为IVT，PCR混合物的总体积可以增加。几个PCR试管各自含有100微升的PCR混合物可用于获得足够的产率的PCR产物。
- 将PCR管中的热循环仪和用PCR循环方案（ 表2）中运行的PCR。
- 清理P使用根据制造商的说明书和洗脱，用20微升不含核酸酶的水将DNA中的PCR纯化试剂盒CR反应。
- 测量用分光光度计中的DNA的浓度。注：检测DNA浓度是约300微克/毫升。因此，预期的总量应为〜6微克。的DNA的其它蛋白质的量可以根据CDS的长度不同时，用于PCR的退火温度的引物，以及循环数质粒的量。
- 冷冻在-20℃下将DNA很长一段时间，或者直接将其用于IVT。
3.控制步骤：PCR产物的质量
- 检查PCR产物经DNA凝胶电泳的质量。
- 混合琼脂糖所需量与在烧瓶1×TBE。为1％的琼脂糖凝胶中，添加0.5克琼脂糖至50ml 1×TBE的。
- 微波直到琼脂糖溶解。不要让它沸腾。确保琼脂糖完全在溶液中。
- 添加5μl的核酸凝胶染料至50ml琼脂糖凝胶。
- 倒胶至琼脂糖凝胶中，设置了梳理，并等待大约1小时，直到凝胶固化。
- 取出梳子，并将凝胶中的凝胶托盘。
- 混合的80-10,000 bp的DNA梯2微升（200毫微克）与200纳克的PCR产物的每一个与2μl的6×加样缓冲液中的12微升的总体积。
- 谨慎地装载DNA样品放入琼脂糖凝胶的孔中。
- 使用1×TBE为电泳缓冲液，运行在100伏的琼脂糖凝胶1小时。
- 可视化的成像系统（ 图2）上的DNA条带。
4. 体外转录（IVT）
- 注：在PCR后，将质粒插入物扩增和聚T形尾序被添加。在IVT中，遗传信息转录的DNA的RNA。所产生的mRNA转录物被用于产生在细胞中的蛋白质。
- 清洁工作区和移液器与核糖核酸酶ðecontamination解决方案。利用PCR洁净和无菌双过滤器枪头，并经常更换手套，以减少污染与RNA酶反应的混合。
- 准备在NTP /帽类似物的混合物，如表3所述。
- 涡旋调匀的NTP /帽模拟混合后短暂离心。
- 组装IVT反应混合物，如表4所述。
- 轻轻上下吹打调匀的IVT反应混合物。然后离心PCR管短暂地在管的底部，收集混合物。
- 在37℃下进行3小时的恒温。
注：最佳孵育时间取决于刀片和定模板的转录效率的长度。对于短插入物（<500 nt）的，较长的温育时间可以是有利的。的时间 - 过程实验可以做到的，以确定最佳孵育时间为最大的产率。因此，设立IVT反应，对于为例即，对1，2，3，4，6小时，并温育过夜，并测定mRNA的量。 在体外转录为代的eGFP基因的动力学显示在图3。 - 要删除的模板DNA，加入1微升的DNA酶（2 U /μL）到IVT反应混合物中，搅拌均匀，孵育15分钟，在37℃。
- 纯化使用根据生产厂家的说明书一RNA纯化试剂盒的反应混合物中。从所述旋转柱的膜用40微升不含核酸酶的水洗脱修饰的mRNA的两倍。注：检测RNA浓度是大约1500微克/毫升。因此，预期的总量应为〜120微克。合成的mRNA的其它蛋白质的量可以不同，取决于CDS的长度和PCR产物的用于IVT的量。
5.治疗纯化的mRNA与南极磷酸酶
- 注：生成的mRNA与磷酸酶处理，除去5'三磷酸盐，其可以通过RIG-I识别并导致免疫激活。另外，磷酸酶处理防止再环化中的自连接反应。
- 加入9微升10倍南极磷酸酶反应缓冲液79微升纯化的mRNA的解决方案。随后，加入2微升南极磷酸酶（5 U /μL），轻轻混匀。孵育在37℃下将反应混合物搅拌30分钟。
- 纯化使用根据生产厂家的说明书一RNA纯化试剂盒的反应混合物中。从旋转柱膜用50μl无核酸酶的水洗脱修饰的mRNA的两倍。
- 测量用分光光度计改性mRNA的浓度。检查吸收在260nm / 280nm的比值（A 260 / A 280）为≥1.8的260比/ A 230是2.0，这表明纯度。
注：预期总收率应该是大约90微克，这是sufficie新台币约36基因转染。 - 通过加入不含核酸酶的水调整的mRNA至100毫微克/微升的浓度。
- 分装修饰的mRNA成所需的转染，并储存于-80℃下单次使用的等分试样。避免反复冻融循环。正确制备和储存的mRNA稳定多年。在工作过程中，始终保持修饰的mRNA在冰上。
6.控制步骤：合成修饰mRNA的质量
- 查改性mRNA的RNA电泳凝胶的质量。
- 混合琼脂糖所需量与在烧瓶1×TBE。为1％的琼脂糖凝胶中，添加0.5克琼脂糖至50ml 1×TBE的。
- 微波直到琼脂糖溶解。不要让它沸腾。确保琼脂糖完全在溶液中。
- 添加5μl的核酸凝胶染料至50ml琼脂糖凝胶。
- 倒胶成琼脂糖凝胶中，设置了梳理，并等待大约1小时，直到凝胶索利dified。
- 取出梳子，并将凝胶中的凝胶托盘。
- 混合3微升0.5-10 kb的RNA的梯子（3微克）与200纳克的合成的修饰mRNA的每个组中的10微升的总体积7微升加样缓冲液。加样缓冲液的组成在表5中描述。
- 变性梯和mRNA样品在70℃下进行10分钟。
- 谨慎地装载梯并在1％琼脂糖凝胶的mRNA样品。
- 1小时用1×TBE为电泳缓冲液进行电泳，在100伏。
- 直观上的UV透射和照片使用凝胶记录系统（ 图4）的阶梯和mRNA条带。
7.制备细胞用于转染
- 板2×10 5个细胞（HEK293细胞）每12孔板井。
- 在细胞培养箱中过夜培养的细胞，在37℃。注：在转染当天，将细胞应具有REAC建置80-90％汇合。
8.执行细胞基因转染
- 解冻修改后的表达。
- 生成脂质复合物转染。
- 添加25μl的修饰的mRNA（2.5微克）和2微升阳离子脂质转染试剂，以473微升的Opti-MEM（最低必需培养基）予还原的血清培养基中，以产生转染混合物的12孔板的一个孔中的转染。根据要转染井的数量扩展的卷。作为阴性对照，不表达制备转染混合物。
- 通过移液轻轻混合组分。在室温下孵育转染混合物20分钟，以产生脂质复合物进行转染。
注：转染混合物不含抗生素。因此，一定要确保无菌处理，同时细胞。 - 用500微升DPBS洗涤细胞/孔。
- 微升转染混合物加入500一个良好12孔解放军TE。
- 孵育细胞4小时，在37℃和5％的CO 2。
- 吸去转染混合物，并加入1 ml的完整的细胞培养基的细胞中。
- 孵育细胞24小时，在细胞培养箱中培养。
- 进行荧光显微分析使用荧光显微镜（ 图5）。注意：为了检测在细胞中的其它蛋白质，其通过转染产生的与其他的mRNA比的eGFP编码mRNA的表达，该细胞可以培养在盖玻片上。然后将转染能进行和所述细胞可被染色的合适的抗体和通过荧光显微镜进行分析。
在细胞EGFP表达9.流式细胞仪分析
- 从孔中除去细胞培养基，并用1毫升DPBS井洗各（无钙和镁）。加入500μl胰蛋白酶/ EDTA，每孔以从细胞培养板的表面分离的细胞。随后，加入500TNS微升每孔灭活胰蛋白酶。
- 离心分离的细胞5分钟，在300×g离心室温。除去上清液只留下沉淀。重悬在150μl的细胞固定溶液中的细胞团块和细胞悬浮液转移到一个流式细胞管。
- 分析eGFP的表达细胞的百分比，并使用几何平均值（荧光强度的几何平均值）（ 图6）的荧光强度。
10.测量蛋白表达随着时间的推移
- 作为另外在步骤8中所述的方法进行细胞的3个孔的12孔平板中的mRNA的转染，不加入mRNA的孵育3个孔的HEK293细胞与转染混合物。
- 测量eGFP的1，2的表达，并且在转染后3天，以评估蛋白质表达（ 图7）的持续时间。
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Representative Results
使用含有的eGFP的CDS的一个的pCDNA 3.3质粒的修饰的eGFP基因的合成成立（ 图1）。通过PCR扩增插入物和聚T形拖尾之后，以大约1100碱基对长度的清晰条带被检测到（ 图2）。增加了IVT时间增加的mRNA（ 图3）的产量。 IVT之后，一个清晰的mRNA条带大约1100碱基对的长度被检测，对应于绿色荧光蛋白的mRNA的要生产的长度（ 图4）。
所产生的绿色荧光蛋白基因的功能，是由HEK293细胞的转染试验。为了这个目的，转染复合物（脂质复合物）使用阳离子脂质的转染试剂中产生。以每12孔板以及2×10 5个细胞中进行转染。绿色荧光蛋白的细胞中的生产，检测用荧光显微镜在转染后24小时（Figu再5）和流式细胞术（ 图6）。
将HEK293细胞用eGFP的表达。 eGFP的表达，测定转染，以评估细胞蛋白表达的持续时间（ 图7）之后，1，2，和3天。 24小时后，蛋白表达量最高的细胞。量减少1.6倍，每第二天。即使是3天后，所述细胞含有eGFP的。
图1：修饰的mRNA的生产过程的概述编码DNA序列（CDS），与已知的侧翼序列通过PCR使用特异性引物进行扩增。对PCR产物进行纯化并将所产生的DNA的质量被确定。将mRNA从使用体外转录过程的DNA产物产生。该产品是purifie D和与磷酸酶处理以除去5'-三磷酸。之后的额外的纯化和生成的mRNA的质量控制中，mRNA转染可以执行。
图2：DNA梯状条带和PCR产物后PCR的DNA产物的分析均在1％琼脂糖凝胶上运行。应检测约为1100 bp的清晰的DNA条带。
图3： 在体外转录的动力学产生的绿色荧光蛋白的mRNA 1）RNA的梯子和IVT制品2后）0分钟，3）10分钟，4）30分钟后，5）180分钟，6）360分钟，和7） DNA模板单独进行，在1％琼脂糖凝胶上运行。
图4：IVT RNA梯度和IVT的产品后分析mRNA产物分别在1％琼脂糖凝胶上运行。要检测一个明显的表达条带，约1,100 bp的长度。
图5：HEK293细胞的绿色荧光蛋白基因转染后24小时荧光显微镜分析。细胞以100倍的放大倍数（A）的相位对比图像。（B）中的细胞以100倍的倍率荧光图像。
身材6：绿色荧光蛋白表达在HEK293细胞绿色荧光蛋白基因转染后流式细胞仪分析24小时的粉色线代表无转基因细胞和蓝线代表绿色荧光蛋白阳性细胞表达绿色荧光蛋白转染后。绿色荧光蛋白基因转染后，所有测量细胞的93.91％，是积极的几何平均值（荧光强度的几何平均值）为720.16。
图7：eGFP的表达eGFP的表达在转染后1,2天和3天的流式细胞分析在HEK293细胞中的蛋白表达是mRNA转染后最高24小时。此后，量减少1.6倍，每天（n = 3时）。
表1：PCR混合物的组成。
| 部件 | 终浓度 | 量（微升） |
| 正向引物 | 0.7微米 | 7 |
| 反向引物 | 0.7微米 | 7 |
| 5X Q-解决方案 | 1个 | 20 |
| 5X HotStar HiFidelity PCR缓冲液 | 1个 | 20 |
| 质粒DNA | 50毫微克/ 100微升 | 变量 |
| HotStar HiFidelity DNA聚合酶（2.5 U /μL） | 2.5单位 | 1 |
| 不含核酸酶的水 | 变量 | |
| 总成交量 | 100 |
表1：PCR混合物的组成。
| 循环次数 | 时间 | 温度（℃） | |
| 起始变性步骤 | 1 | 5分钟 | 95 |
| 3步循环 | 2-25 | ||
| ·变性 | 45秒 | 95 | |
| ·退火 | 1分钟 | 55 | |
| ·扩展 | 1分钟 | 72 | |
| 最终的延伸步骤 | 26 | 10分钟 | 72 |
| PCR循环结束 | 不定 | 4 |
表2：PCR循环公关otocol。
| 部件 | 股权集中度（MM） | 终浓度（MM） | 体积（微升） |
| ATP（从MEGAscript T7套装） | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP（从MEGAscript T7套装） | 75 | 1.875 | 1 |
| 我-CTP（从TriLink是） | 100 | 7.5 | 3 |
| 伪UTP（从TriLink是） | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-ME-M 7 G（5'），PPP（5'）G帽的RNA结构模拟 | 10 | 2.5 | 10 |
| 总成交量 | 23 |
表3：NTP /帽模拟混合组成。
| 部件 | 终浓度 | 量（微升） |
| 不含核酸酶的水 | 变量 | |
| 核糖核酸酶抑制剂 | 40单位 | 1 |
| NTP /帽模拟混合（步骤4.3） | 23 | |
| PCR产物 | 1微克 | 变量 |
| 10×反应缓冲液 | 1个 | 4 |
| 10×T7 RNA聚合酶的酶混合物 | 1个 | 4 |
| 总成交量 | 40 |
表4： 体外转录的组成（我VT）的反应混合物中。
| 部件 | 量（微升） |
| 甲酰胺 | 3.3 |
| 37％的甲醛 | 1 |
| MEN缓冲液（10X） | 1 |
| 6X上样缓冲液（用peqGOLD范围混合DNA梯提供） | 1.7 |
| 总成交量 | 7 |
表5：用于RNA凝胶电泳制备的加样缓冲液。
| 细胞培养液和缓冲液 | |
| HEK-293细胞培养液中 | 添加25毫升的FCS，2.5 ml青霉素/链霉素的2.5毫升的L-谷氨酸的tamine在220毫升DMEM高糖。储存在4℃的培养基，并用它在2周内。 |
| TBE缓冲液（10X） | 溶解0.9M的Tris碱，将0.9M硼酸和20mM EDTA的1升水中（Ampuwa）。所述缓冲液的pH为8。 |
| MEN缓冲液（10X） | 溶解的200mM MOPS，50mM的醋酸钠，10mM EDTA的在1L水（Ampuwa）。 pH值用NaOH调节至7。 |
表6：细胞培养基和缓冲液。
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Discussion
mRNA的疗法在再生医学，治疗的疾病和免疫接种领域的巨大潜力。在这段视频中，我们展示了生产稳定，修饰诱导的细胞蛋白表达的mRNA。使用该协议，其他期望的mRNA可被生成。 在体外合成修饰mRNA的允许细胞的转染具有所需的mRNA诱导靶蛋白的表达。由此，所需的蛋白瞬时表达的生理条件下，直到外源递送的mRNA被完全降解。
在此视频中，绿色荧光蛋白的表达，证实了3天的HEK293细胞的eGFP的mRNA的单次转染后。 mRNA分子编码的其他蛋白有可能导致更短的蛋白质的表达时期。该蛋白的表达减少由于外源递送的mRNA的降解。这种技术对于索姆的。因此，该限制权证申请可能是短暂的诱导蛋白表达。因此，为了维持在细胞中的时间较长蛋白表达，反复递送基因是必需的。虽然，基因转染具有非整合到宿主基因组中，从而防止插入突变和癌症和白血病的发展相比，病毒载体的优势， 在体内转染效率可能低于使用病毒载体。
转染试剂的所需mRNA的浓度和量应该为每个不同的细胞类型14，它们是在目标细胞中的外源递送的mRNA，以产生缺失的蛋白质进行优化。
反复冷冻和mRNA的解冻，应避免以保持所产生的mRNA的稳定性。因此，工作等分试样，可以制备。 PCR和IVT之后，只有一个单一的特定频带应该被检测到。否则，PCR循环数，引物annea灵温度，和/或质粒DNA的量应该优化，以获得特定的DNA产物为IVT。此外，该IVT的时间和IVT的DNA模板的量可被优化以获得足够数量的特定长度的mRNA的表达。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
该项目是在巴登 - 符腾堡州，德国资助的欧洲社会基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
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