Summary
Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.
Abstract
İstenilen hücrelerinde protein sentezinin endüksiyonu için sentetik mesajcı RNA (mRNA) kodlama eksojen dağıtım rejeneratif tıpta, temel hücre biyolojisi, hastalıkların tedavisi ve hücrelerin yeniden programlanmasının alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, akış sitometrisi ile indüklenmiş protein ekspresyonu azaltılmış immün aktivasyon potansiyeli ve stabilitesi arttırılmış üretilen mRNA kalite kontrolü, hücrelerin transfeksiyonu mRNA ile ve test modifiye mRNA'nın üretimi için aşamalı protokolde bir adım tarif eder. EGFP mRNA ile tek bir transfeksiyon sonrasında 3 güne kadar, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri eGFP üretir. Bu video makalede, EGFP mRNA sentezi bir örnek olarak tarif edilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, diğer arzu edilen mRNA'nın üretilmesi için uygulanabilir. MRNA, modifiye edilmiş sentetik kullanarak hücreleri geçici olarak normalde eksprese olmaz arzu edilen proteinleri eksprese etmek için uyarılan edilebilir.
Introduction
Hücrelerde, haberci RNA transkripsiyon (mRNA) ve istenen mRNA'nın proteinlere aşağıdaki çeviri hücrelerin düzgün işleyişini sağlamak. Kalıtsal veya sonradan kazanılmış genetik bozukluklar proteinlerin yetersiz ve işlevsiz sentezine yol ve şiddetli hastalıklara neden olabilir. Bu nedenle, eksik ya da kusurlu protein üretimini uyarmak için yeni bir tedavi yaklaşımı hücreler içine mRNA, değiştirilmiş sentetik eksojen dağıtım, istenilen protein için kodları. Böylece, hücreler normal olarak üretemez ya da doğal olarak ihtiyaç olan fonksiyonel proteinleri sentezlenmesi için tetiklenir. Bu yaklaşım kullanılarak, genetik bozukluklar mRNA'nın katılmasıyla çözülebildiğini bozuk veya eksik protein 1 kodlar. MRNA, tedavi aynı zamanda tümör hücrelerinin ya da patojen uyarıcılar tarafından ifade edilen proteini antijenleri ile sentezlemek için aşılama için kullanılabilir. Böylece, konak bağışıklık sistemi tümör hücrelerini etkili bir şekilde ortadan kaldıracak ya INFE önlemek için etkinleştirilebilirseksiyonlar 2,3. Bundan başka, son yıllarda, mRNA, başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretmek için kullanıldı. Bu amaçla, fibroblastlar yeniden programlama için sentezleme 4-6 faktörleri uyarılması için ve rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahip iPSCs bunları dönüştürmek için mRNA ile transfekte edilmiştir.
Daha önce, bilinen mRNA kullanımı, düşük stabilite ve güçlü immünojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, geleneksel bir mRNA klinik uygulamalar ile sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, Kariko ve arkadaşları tarafından mRNA molekülü içinde 5-metilsitidin ve pseudouridine ile sitidin ve üridin yerine biyolojik sıvılar içinde kararlı mRNA moleküllerini hale getirilir ve önemli ölçüde artık tadil edilmiş mRNA'ların klinik uygulanabilirliği karşılaştırın immün aktivasyonu, 7-10, azaltmıştır.
Sentetik olarak üretilen tadil edilmiş mRNA'ların kullanarak, istenen gen transkript geçici olarak in vivo 11 teslim edilebilirya da in vitro protein ifadesini uyarmak için. İlave edilen mRNA, hücre nakil mekanizması tarafından fizyolojik koşullar altında çevrilmiştir. Nedeniyle Viral gene terapi vektörleri göre konakçı hücre genomuna entegrasyon eksikliği, onkojenez riski 12,13 önlenir. Böylece, modifiye sentetik mRNA kullanılarak tedavi gelecekte daha iyi klinik kabul alırsınız.
Burada, modifiye mRNA üretiminde (Şekil 1) mRNA ile hücreler ve transfekte hücrelerde protein ifade değerlendirilmesi, transfeksiyon için detaylı bir protokol açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gerekli olan DNA dizinlerini Kodlama içeren plazmidlerin 1. Büyütme (CDS)
- Ön oda sıcaklığına getirilmiş ve dönüşüm kiti dahildir SOC ortamında, 37 ° C'de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar plakaları. 42 ° C su banyosu dengeye getirin.
- Kimyasal bileşen E bir şişe çözülme buz üzerinde coli.
- Kimyasal bileşen E. şişe içine CDS içeren plazmidin 1-5 ul (100 ng, 10 pg) ekleyin coli ve hafifçe karıştırın. Pipetleme hücreleri karışmaz. Plasmidlerini ekledikten sonra, yavaşça tüp dokunarak karıştırın.
- 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
- Isı şok E. çalkalamadan bir su banyosu içinde 42 ° C sıcaklıkta 30 sn için E. coli.
- 2 dakika boyunca buz üzerinde şişe yerleştirin.
- E. önceden ısıtılmış SOC ortamında 250 ul ekleyin E. coli bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 1 saat süre ile, 300 rpm'de yatay bakteri sallayın.
- 100 ul ve önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı 150 ul yay plakalar ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Koloniler görünür hale sonra, 100 ug / ml ampisilin ile 5 ml LB ortamı içeren 15 ml'lik bir kültür tüpü içine, her plakadan tek bir koloni inoküle. Kültür late Günlük veya durağan faz içinde yer alana kadar 300 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca inkübe.
- Dönüşmüş E. coli, uzun süreli depolama için E. coli, pipeti dondurarak saklamaya uygun viallerin içine% 100 gliserol, 75 ul. Bakteri kültürüne (dondurulmuş bir stoku,% 25 gliserol içeren) 225 ul eklenir, iyice karıştırılır ve -80 ° C 'de cryovial saklayın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti ile birlikte istenen CDS içeren plazmidler izole edin.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, plazmid konsantrasyonunun belirlenmesi.
- 20 ul alikotları hazırlanması ve uzun bir süre boyunca -20 ° C'de saklayın.
- Not: PCR kullanılarak amplifiye edilir, in vitro transkripsiyon (IVT), burada söz konusu CDS EGFP için DNA şablonu elde etmek için. Aynı zamanda, 120 timidinler (T) 'in bir poli T-kuyruk T 120 uzantılı bir ters primer kullanılarak inserte eklenmiştir. Böylece, oluşturulan mRNA'lar IVT sonra tanımlanmış bir uzunluğa sahip olan bir poli A kuyruğu elde edilir.
- Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR ile bir karışım hazırlayın.
- Iyice reaksiyon karışımı karıştırın. Not: PCR ürünü, 4-5 IVT reaksiyonlarında kullanılabilir. IVT için DNA şablonu miktarını artırmak için, PCR karışımı, toplam hacmi arttırılabilir. Birkaç PCR tüpleri, her biri 100 ul PCR karışımı, PCR ürünü yeterli bir verim elde etmek için kullanılabilir.
- Bir PCR PCR tüpleri yerleştirin ve PCR çevrim protokolü (Tablo 2) kullanılarak PCR çalıştırın.
- P temizleyin20 ul nükleaz içermeyen su kullanılarak DNA üreticinin talimatlarına ve elüte göre olan bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak CR reaksiyonu.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA'nın konsantrasyonu ölçümü. Not: Saptanan DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak 300 ug / ml'dir. Böylece, beklenen toplam miktarının ~ 6 mg olmalıdır. Diğer proteinler için DNA miktarı CDS uzunluğuna bağlı olarak farklı olabilir, plazmid miktarı PCR, primer tavlama sıcaklığı ve devir sayısı için de kullanılır.
- Uzun bir süre için, -20 ° C'de DNA Freeze veya IVT doğrudan kullanın.
3. Kontrol Adım: PCR Ürünü Kalitesi
- DNA jel elektroforezi ile PCR ürününün kalitesini kontrol edin.
- Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin.
- Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun.
- 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin.
- , Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat bekleyin.
- Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin.
- 12 ul bir toplam hacimde 2 ul, 6x yükleme tamponu ile 80-10,000 bp'lik bir DNA merdiven 2 ul (200 ng) ve PCR ürünü, 200 ng her karıştırın.
- Dikkatlice agaroz jel kuyu içine DNA örnekleri yükleyin.
- Tampon olarak 1 x TBE kullanarak 1 saat boyunca 100 V'ta agaroz jel üzerinde çalıştırıldı.
- Bir görüntüleme sistemi (Şekil 2) DNA bantları görselleştirmek.
4. in vitro transkripsiyon (IVT)
- Not: PCR'den sonra plasmit amplifiye edilir ve bir poli T kuyruğu eklenmiştir. IVT sırasında genetik bilgi haliyle RNA'nın DNA'dan transkribe edilmektedir. Oluşturulan mRNA transkript hücrelerde proteinlerin üretilmesi için kullanılır.
- Bir Rnase d çalışma alanı ve pipetler temizleyinecontamination çözeltisi. Reaksiyon RNases karışır sık sık kullanımı, PCR, temiz ve steril çift filtre pipet uçları ve kirlenmeyi en aza indirmek için eldiven değiştirmek.
- Tablo 3'te tarif edildiği gibi NTP / kap benzeri bir karışım hazırlayın.
- Vorteks ile iyice NTP / kap analog karışımı karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
- Tablo 4'te tarif edildiği gibi IVT, reaksiyon karışımı bir araya getirin.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyice IVT reaksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra tüpün altındaki karışımın toplanması için kısa bir süre için PCR tüpü santrifüj.
- Termomikser içinde 3 saat 37 ° C'de inkübe edilir.
NOT: En uygun kuluçka zamanı ekler ve belirli bir şablon transkripsiyonel etkinliğinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa uçlar (nt <500), bir uzun bir enkübasyon süresi avantajlı olabilir. Bir zaman ders deney maksimum verim için optimum inkübasyon süresini belirlemek için yapılabilir. Bu nedenle, exampl için, IVT reaksiyonları kurmake 1, 2, 3, 4, 6 saat, ve gece boyunca kuluçka için ve mRNA miktarının belirlenmesi. EGFP mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon kinetiği Şekil 3'te gösterilmiştir. - , Şablon DNA kaldırmak IVT Reaksiyon karışımına DNase 1 ul (2 U / ml) ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
- Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 40 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA'nın tasfiye edilir. Not: bulgulanan RNA konsantrasyonu, yaklaşık 1.500 ug / ml arasındadır. Böylece, beklenen toplam miktarı, ~ 120 ug olması gerekir. Diğer proteinler için sentez mRNA miktarı CDS uzunluğu ve IVT için kullanılan PCR ürününün miktarına bağlı olarak değişebilir.
Antarktika fosfataz ile saflaştırılmış mRNA 5. Tedavi
- Not: üretilen mRNA 5 çıkarmak için fosfataz ile işlemden geçirildi 'tri-Bağışıklık aktifleşmesi Rig-I tarafından tanınan ve kurşun olabilir fosfatlar. Ayrıca, fosfotaz muamelesine kendinden ligasyon reaksiyonunda yeniden daire haline engeller.
- Saflaştırılmış mRNA solüsyonuna 79 ul 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon maddesi 9 ul ekleyin. Daha sonra, Antarktika fosfataz (5 U / ul), 2 ul ekleyin ve yavaşça örnek karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de, reaksiyon karışımı inkübe edin.
- Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 50 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA'nın tasfiye edilir.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, modifiye mRNA'nın konsantrasyonu ölçümü. Giriş 260 nm / 280 nm'de absorbans, (A 260 / A 280), ≥ 1.8 ve 260 oranı / 230 saflığa işaret eden, 2.0 olduğundan emin olun.
NOT: beklenen toplam verim, hangi sufficie olduğunu, yaklaşık 90 ug olmalınt yaklaşık 36 mRNA Transfeksiyonlar için. - Nükleaz içermeyen su ilave edilerek, 100 ng / ul mRNA konsantrasyonu ayarlayın.
- -80 ° C'de Transfeksiyonlar ve mağaza için gerekli olan tek kullanımlık kısma modifiye mRNA'nın kısım. Birden fazla donma ve çözülme döngüleri kaçının. Düzgün hazırlanmış ve mRNA yıllardır istikrarlı saklanır. Çalışma sırasında, her zaman buz üzerinde modifiye mRNA tutun.
6. Kontrol Aşama: Sentezlenen Modifiye mRNA'nın Kalitesi
- RNA, jel elektroforezi ile modifiye mRNA'nın kalitesini kontrol edin.
- Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin.
- Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun.
- 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin.
- Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel soli oluncaya kadar yaklaşık 1 saat beklemekasitleştirildi.
- Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin.
- 0.5-10 kb RNA merdiveni 3 ul (3 ug) ve mRNA, 10 uL bir toplam hacimde 7 ul yükleme tamponu ile değiştirilen her sentezlenir 200 ng karıştırın. Yükleme tamponu kompozisyonu, Tablo 5'te tarif edilmektedir.
- 10 dakika süreyle 70 ° C de merdiven ve mRNA örnekleri, denatüre.
- Dikkatle merdiveni ve% 1 agaroz jel üzerinde mRNA örnekleri yükleyin.
- Tampon olarak 1x TBE kullanılarak 1 saat boyunca 100 V elektroforezi gerçekleştirin.
- Bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak UV transilluminator ve fotoğraf üzerinde merdiven ve mRNA bantları görselleştirmek.
7. Transfeksiyonu için Hücrelerin Hazırlanması
- 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu Levha 2 x 10 5 hücreleri (HEK293 hücreleri) içerir.
- Bir hücre kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: transfeksiyon gününde, hücreler REAC olmalıdır% 80-90 hed.
8. Hücre mRNA Transfeksiyon gerçekleştirme
- Modifiye edilmiş mRNA çözülme.
- Transfeksiyon için lipoplexes oluşturur.
- Modifiye edilmiş mRNA, 25 ul (2.5 ug) ve 12-çukurlu bir levhanın bir kuyu transfeksiyonu için transfeksiyon karışımı oluşturmak üzere, serum ortamı, indirgenmiş 473 ul Opti-MEM (Minimal Essential Medium) katyonik lipit transfeksiyon reaktifı 2 ul ekleyin. Transfekte edilecek kuyu sayısı uygun hacimleri Scale. Negatif bir kontrol olarak, mRNA olmadan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.
- Pipetleme tarafından yavaşça karıştırınız. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin.
NOT: transfeksiyon karışımı hiçbir antibiyotikler içerir. Böylece, hücrelerin kullanımı sırasında kısırlık sağlamak için özen gösterin. - 500 ul DPBS hücreleri yıkayın / kuyu.
- 12-iyi bir pla iyi biri transfeksiyon karışımı ul 500 eklete.
- 37 ° C de 4 saat ve% 5 CO2 için hücreleri inkübe edin.
- Transfeksiyon karışımı aspire ve hücrelerin 1 ml tam hücre kültür ortamına ilave edin.
- Hücre kuluçka makinesi içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
- Floresan mikroskobik yapın bir floresan mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak analiz eder. Not: eGFP dışında mRNA, mRNA kodlayıcı ile transfeksiyon ile üretilen hücrelerde başka proteinlerin ekspresyonunu incelemek için hücreler, lamelleri yetiştirilebilir. Daha sonra transfeksiyon gerçekleştirilebilir ve hücreler, uygun antikorlar ile boyanmış ve fluoresan mikroskobu ile analiz edilebilir.
Hücrelerde eGFP İfade 9. Akış Sitometrik Analizleri
- Kaynaklardan gelen hücre kültürü ortamı çıkarın ve (kalsiyum ve magnezyum içermeyen), 1 ml DPBS ile her bir yıkama. Hücre kültür plakalarının yüzeyinden hücreleri ayırmak için oyuk başına 500 ul tripsin / EDTA ilave edin. Daha sonra, 500 eklemekul TNS başına iyi tripsin inaktive.
- Oda sıcaklığında, 300 x g'de 5 dakika boyunca müstakil hücreleri santrifüjleyin. Sadece pelet bırakarak süpernatantı. 150 ul hücre sabitleme çözeltisi hücre pelletini ve tüp sitometri akışı içine hücre süspansiyonu aktarın.
- EGFP ifade eden hücrelerin yüzdesini ve Coğrafi İfade (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) (Şekil 6) kullanılarak floresans yoğunluğu analiz edin.
Over Time Protein İfade 10. Ölçümü
- Ayrıca 8. adımda tarif edildiği gibi, bir 12-yuvalı plakanın 3 gözleri içindeki hücreler mRNA transfeksiyonu yapın mRNA ilavesi olmadan transfeksiyon karışımı ile HEK293 hücrelerinde 3 kuyu inkübe edin.
- EGFP 1, 2 ekspresyonunu ölçmek ve Transfeksiyondan 3 gün sonra, proteinin (Şekil 7) süresini değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGFP CD içeren pcDNA 3.3 plasmidi kullanılarak, tadil edilmiş eGFP mRNA sentezi (Şekil 1) kurulmuştur. PCR ile uç amplifikasyon ve poli T-atık sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluktaki temiz bir bant (Şekil 2) tespit edilir. MRNA (Şekil 3) verimi IVT zaman Artırılmış artırılması. IVT sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluğunda bir açık mRNA bandı üretilecek EGFP mRNA'nın uzunluğu (Şekil 4) tekabül edecek şekilde tespit edilmiştir.
Oluşturulan EGFP mRNA işlevselliği HEK293 hücrelerine transfeksiyonu ile test edilmiştir. Bu amaç için, transfeksiyon kompleksleri (lipoplexes) bir katyonik lipit transfeksiyon ayıracı kullanılarak üretilmiştir. Transfeksiyon 12 oyuklu plaka oyuk başına 2 x 10 5 hücre ile gerçekleştirildi. Hücrelerdeki eGFP üretimi Figu (floresan mikroskopi kullanılarak transfeksiyondan sonra 24 saat saptandıre 5) ve sitometri (Şekil 6) akar.
HEK293 hücreleri EGFP mRNA ile transfekte edilmiştir. EGFP ifade 1, 2, ve 3 gün transfeksiyon hücrelerde protein ifade süresini değerlendirmek için (Şekil 7) sonra tespit edildi. 24 saat sonra, protein sentezleme hücreleri içinde en yüksek idi. Miktarı her Ertesi gün 1.6 kat azaltılmıştır. Hatta 3 gün sonra, hücreler, eGFP ihtiva etmiştir.
Şekil 1:. Bilinen kuşatıcı sekanslar ile de modifiye mRNA'nın, üretim işleminin genel kodlayan DNA sekansları (CDS) spesifik primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir. PCR ürünü saflaştırılmış ve üretilen DNA kalitesi belirlenir. MRNA in vitro transkripsiyon işlemi kullanılarak bir DNA ürünü oluşturulur. Ürün ile saflaştırılmış olan Rd ve fosfataz ile işlemden geçirildi 5'-trifosfat kaldırın. Ilave saflaştırma ve üretilen mRNA kalite kontrolünün ardından, mRNA transfeksiyon gerçekleştirilebilir.
Şekil 2:. Sonra PCR DNA merdiveni ve PCR ürünün DNA ürününün analizi bir% 1 agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. 1100 bp uzunluğunda bir açık DNA bandı tespit edilmelidir.
Şekil 3:. 2 sonra EGFP mRNA'sı 1) RNA merdiveni IVT ürünlerin üretimi için, in vitro transkripsiyon kinetiği) 0 dakika, 3), 10 dakika, 4), 30 dakika, 5), 180 dakika sonra, 6) 360 dakika, ve 7) DNA şablonları, ya tek başına bir% 1 agaroz jel üzerinde yürütülmüştür.
Şekil 4:. IVT RNA merdiveni IVT ürün sonra mRNA'nın Ürünün analizi bir% 1 agaroz jel üzerinde yürütülmüştür. Yaklaşık 1,100 bp uzunluğunda net bir mRNA bandı tespit edilmelidir.
Şekil 5: HEK293 hücreleri eGFP mRNA transfeksiyon sonra 24 saat Floresan mikroskobik analizleri. 100X büyütmede hücrelerin (A), Faz kontrast görüntüsü. (B), 100X büyütmede hücrelerin floresans görüntüleri.
Şekil6: Akış sitometri eGFP mRNA transfeksiyon sonra HEK293 hücrelerinde eGFP ifade 24 saat analizleri pembe çizgi mRNA transfeksiyonla olmadan hücreleri temsil ve mavi çizgi eGFP mRNA transfeksiyon sonra eGFP pozitif hücreleri temsil eder.. EGFP mRNA Transfeksiyondan sonra, tüm ölçülen hücrelerin 93,91% pozitiftir ve Coğrafi Ortalama (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) 720,16 olup.
Şekil 7: Akış sitometrik 1, 2 ve 3 gün EGFP mRNA, transfeksiyondan sonra HEK293 hücrelerinde EGFP ifade analizleri, protein mRNA'sının ifadesinin transfeksiyonundan sonra en fazla 24 saat 'tir.. Bundan sonra, bu miktar 1.6 kat azaltılır her gün (n = 3).
Tablo 1: PCR karışımı bileşimi.
| Bileşen | Nihai konsantrasyon | Tutar (ul) |
| İleri Astar | 0.7 iM | 7 |
| Ters Primer | 0.7 iM | 7 |
| 5x Q-Çözümü | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity PCR Tampon | 1x | 20 |
| Plazmid DNA, | 50 ng / 100 ul | Değişken |
| HotStar HiFidelity DNA Polimeraz (2.5 U / ul) | 2.5 u | 1 |
| Nükleazlar-serbest su | Değişken | |
| Toplam hacmi | 100 |
Tablo 1: PCR karışımı bileşimi.
| Döngü sayısı | Zaman | Sıcaklık (° C) | |
| İlk denatürasyon adım | 1 | 5 dakika | 95 |
| 3-adım bisiklet | 2-25 | ||
| · Denatürasyonu | 45 sn | 95 | |
| · Tavlama | 1 dakika | 55 | |
| · Uzatma | 1 dakika | 72 | |
| Final uzatma adım | 26 | 10 dakika | 72 |
| PCR bisiklet sonu | Belirsiz | 4 |
Tablo 2: PCR döngü protocol.
| Bileşen | Hazır konsantrasyonu (mM): | Nihai konsantrasyonu (mM): | Hacim (ul) |
| ATP (MEGAscript T7 Kit itibaren) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (MEGAscript T7 Kit itibaren) | 75 | 1.875 | 1 |
| (TRILINK den) Me-CTP-CTP | 100 | 7.5 | 3 |
| (TRILINK itibaren) pseudo-UTP | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-Me-m, 7 g (5') ppp (5 ') G RNA, başlık yapısı, benzeri | 10 | 2.5 | 10 |
| Toplam hacmi | 23 |
Tablo 3: NTP / kap analog karışımı Bileşimi.
| Bileşen | Nihai konsantrasyon | Tutar (ul) |
| Nükleazlar-serbest su | Değişken | |
| RNaz inhibitör | 40U | 1 |
| NTP / kap analog karışımı (adım 4.3) | 23 | |
| PCR ürünü, | 1 ug | Değişken |
| 10x reaksiyon tamponu | 1x | 4 |
| 10x T7 RNA polimeraz enzim karışımı | 1x | 4 |
| Toplam hacmi | 40 |
Tablo 4: in vitro transkripsiyon Kompozisyonu (lME) reaksiyon karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
| Bileşen | Tutar (ul) |
| Formamid | 3.3 |
| % 37 formaldehit | 1 |
| MEN tampon (10x) | 1 |
| (PeqGOLD Range Mix DNA-Merdiven ile verilir) 6x yükleme tamponu | 1.7 |
| Toplam hacmi | 7 |
Tablo 5: RNA jel elektroforez için yükleme tamponu hazırlanması.
| Kültür orta ya da sahte hücre | |
| HEK-293 hücre kültürü ortamı | FCS, 25 ml, penisilin / streptomisin, 2.5 ml, L-Glu, 2.5 ml ekle220 ml DMEM yüksek glikoz Tamine. 4 ° C'de orta muhafaza edilir ve 2 hafta içinde kullanın. |
| TBE tamponu (10x) | 0.9 M Tris, 0.9 M borik asit ve 1 litre su içinde 20 mM EDTA (Ampuwa) içinde çözülür. Tamponun pH değeri 8'dir. |
| MEN tampon (10x) | 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc, 1 L su içinde 10 mM EDTA (Ampuwa) içinde çözülür. 7 NaOH ile pH değerinin ayarlanması. |
Tablo 6: hücre kültür ortamı ve tamponlar da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MRNA, tedavi rejeneratif tıpta, hastalıkların ve aşı tedavisi alanında büyük bir potansiyele sahiptir. Bu video, hücrelerdeki protein ifadesinin endüksiyonu için bir stabilize edilmiş, modifiye mRNA'nın üretmektedirler. Bu protokol kullanılarak, istenen diğer mRNA oluşturulabilir. Modifiye edilmiş mRNA in vitro sentez hedef proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için arzu edilen mRNA ile hücrelerin transfeksiyonu sağlar. Ekzojen olarak teslim mRNA tamamen indirgendi kadar Böylece, arzu edilen protein, fizyolojik koşullar altında geçici olarak ifade edilir.
Bu video, EGFP ekspresyonu EGFP mRNA ile HEK 293 hücreleri tek transfeksiyonundan sonra 3 gün için gösterilmiştir. diğer proteinleri kodlayan mRNA moleküllerinin daha kısa bir protein sentezleme süresine neden olabilir. Proteinin ifadesi nedeniyle dışsal olarak teslim mRNA'nın degradasyonuna azalır. Som bu tekniğin nedenle, sınırlamaE uygulamalar protein ekspresyonunun geçici indüksiyon olabilir. Bu nedenle, uzun bir süre için hücrelerinde protein ifadesini sağlamak için, mRNA tekrarlanan dağıtım, gereklidir. MRNA, transfeksiyon sokma mutagenezi ve viral vektörler ile karşılaştırıldığında kanser ve lösemi gelişimini önleyen konakçı genom içine olmayan entegrasyon avantajına sahiptir, ancak, in vivo transfeksiyon verimi, viral vektörler kullanılarak daha az olabilir.
Transfeksiyon ayıracı gerekli mRNA konsantrasyonu ve miktarı eksik proteini üretmek için mRNA eksojen verilmesi için hedef hücreler her biri, farklı bir hücre tipi, 14 için optimize edilmelidir.
Tekrarlanan dondurma ve mRNA çözülme üretilen mRNA istikrarı korumak için kaçınılmalıdır. Bu nedenle, çalışma alikot hazırlanabilir. PCR ve IVT sonra, sadece tek bir spesifik bandı tespit edilmelidir. Aksi takdirde, PCR döngüsü sayısı, astar anneaLing sıcaklığı, ve / ya da plazmid DNA miktarı IVT için özel DNA ürününü elde etmek için optimize edilmelidir. Ayrıca, IVT zaman ve IVT DNA şablonunun bir miktarının, yeterli miktarlarda spesifik uzunlukta mRNA elde etmek için optimize edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu proje Baden-Württemberg, Almanya'nın Avrupa Sosyal Fonları tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
