Summary
In deze video artikel beschrijven we de in vitro synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen.
Abstract
De afgifte van exogene coderende synthetische messenger RNA (mRNA) voor inductie van eiwitsynthese in gewenste cellen enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, fundamentele celbiologie, behandeling van ziekten en herprogrammering van cellen. We beschrijven hier een stapsgewijze protocol voor het genereren van gemodificeerde mRNA met verminderde immuunactivatie en potentieel verhoogde stabiliteit, kwaliteitscontrole van geproduceerde mRNA, transfectie van cellen met mRNA en verificatie van de eiwitexpressie geïnduceerd door flowcytometrie. Tot 3 dagen na een transfectie met eGFP mRNA, de getransfecteerde HEK293 cellen eGFP. In deze video artikel, wordt de synthese van eGFP mRNA beschreven als een voorbeeld. Echter, de procedure worden toegepast voor de productie van andere gewenste mRNA. Met de synthetische gemodificeerde mRNA, kunnen cellen worden geïnduceerd om de gewenste eiwitten, die zij normaal gesproken niet tot expressie transient expressie.
Introduction
In cellen de transcriptie van messenger RNA (mRNA) en de volgende translatie van mRNA in de gewenste eiwitten de goede werking van de cellen. Erfelijke of verworven genetische aandoeningen kan leiden tot onvoldoende en disfunctionele synthese van eiwitten en ernstige ziekten. Dus een nieuwe therapeutische benadering voor de produktie van ontbrekende of defecte eiwitten induceren exogene levering van synthetisch gemodificeerde mRNA in cellen, die codeert voor het gewenste eiwit. Daardoor worden cellen geactiveerd om functionele eiwitten, die ze normaal niet produceert of zou uiteraard niet moeten synthetiseren. Met deze benadering kunnen genetische aandoeningen worden gecorrigeerd door het inbrengen van mRNA dat codeert voor de defecte of ontbrekende eiwit 1. De mRNA therapie kan ook worden gebruikt voor vaccinatie eiwit antigenen die worden uitgedrukt door tumorcellen of pathogenen synthetiseren. Daardoor kan gastheerimmuunsysteem worden geactiveerd om effectief elimineren tumorcellen of Infe voorkomenCTIES 2,3. Bovendien afgelopen jaren mRNA succes gebruikt geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) genereren. Hiertoe werden fibroblasten getransfecteerd met mRNA induceren de expressie van herprogrammering factoren 4-6 en om te zetten in iPSCs met een enorm potentieel regeneratieve geneeskunde.
Eerder is het gebruik van conventionele mRNA geassocieerd met lage stabiliteit en sterke immunogeniciteit. Aldus klinische toepassingen van conventionele mRNA beperkt. De vervanging van cytidine en uridine van 5-methylcytidine en pseudouridine in het mRNA-molecuul door Kariko en collega rendered mRNA-moleculen stabiel in biologische vloeistoffen en drastisch verminderd immuunactivatie 7-10, die nu kan de klinische toepasbaarheid van gemodificeerde mRNA.
Met synthetisch geproduceerde gemodificeerde mRNA, kan gewenst gen transcripten tijdelijk worden geleverd in vivo 11of in vitro om eiwitexpressie te induceren. De geïntroduceerde mRNA wordt vertaald onder fysiologische omstandigheden door de cellulaire translatie machinerie. Wegens gebrek aan integratie in het gastheergenoom opzichte virale gentherapie vectoren, is het risico van oncogenese voorkomen 12,13. Zo zal de behandeling met behulp van gemodificeerde synthetische mRNA krijgen betere klinische acceptatie in de toekomst.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de productie van gemodificeerde mRNA (figuur 1), transfectie van cellen met mRNA en de evaluatie van eiwitexpressie in getransfecteerde cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vergroting van plasmiden die Vereiste codering van DNA-sequenties (CDS)
- Voorverwarmen SOC medium, dat is opgenomen in de transformatie kit, tot kamertemperatuur en de LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline bij 37 ° C. Equilibreer het waterbad tot 42 ° C.
- Dooi een flacon van chemisch component E. coli op ijs.
- Voeg 1-5 ul van het plasmide (10 pg tot 100 ng) met de CDS in de flacon met chemisch component E. coli en meng voorzichtig. Laat de cellen niet meng door pipetteren. Na het toevoegen van plasmiden, meng door het buisje te tikken.
- Incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 min.
- Heat-shock de E. coli gedurende 30 seconden bij 42 ° C in een waterbad zonder schudden.
- Plaats de flacon op ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 250 ul voorverwarmde SOC medium om de E. coli en schud de bacteriën horizontaal bij 300 rpm gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bacteriële incubator.
- Spread 100 ui en 150 ui van transformatiemengsel op voorverwarmd LB agarplaten, de platen om en incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Nadat kolonies zichtbaar, enten een enkele kolonie van elke plaat in een 15 ml kweek buis met 5 ml LB-medium met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer ze een nacht bij 37 ° C onder schudden bij 300 rpm tot cultuur in late log of stationaire fase.
- Voor de lange termijn opslag van getransformeerde E. coli Pipetteer 75 ul 100% glycerol in het cryovial. Voeg 225 ul van de bacteriecultuur (ingevroren voorraad zal 25% glycerol), goed mengen en opslaan van de cryovial bij -80 ° C.
- Isoleer de plasmiden die de gewenste CDS met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant.
- Bepaal de plasmideconcentratie met een spectrofotometer.
- Aliquots van 20 pl en opgeslagen bij -20 ° C gedurende langere tijd.
- Opmerking: Om de DNA-matrijs voor de in vitro transcriptie (IVT), de CDS van belang hier eGFP, wordt geamplificeerd met behulp van PCR verkregen. Tegelijkertijd wordt een poly T-staart van 120 thymidinen (T) op het insert toegevoegd onder gebruikmaking van een reverse primer met een T 120 extensie. Waarbij de aangemaakte mRNAs verkrijgen van een poly A-staart met een gedefinieerde lengte na IVT.
- Bereid PCR mengsel zoals beschreven in tabel 1.
- Meng de reactie mix grondig. OPMERKING: PCR product kan worden gebruikt in 4-5 IVT reacties. Om het DNA template bedrag voor IVT verhogen, kan totale volume van het PCR mengsel worden verhoogd. Verschillende PCR buisjes die elk 100 pi PCR mengsel worden gebruikt om een voldoende opbrengst aan PCR product.
- Plaats de PCR buizen in een thermocycler en laat de PCR met de PCR cycling protocol (Tabel 2).
- Het schoonmaken van de PCR reactie met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant en elueer het DNA met 20 ul nuclease-vrij water.
- Meet de concentratie van het DNA met een spectrofotometer. OPMERKING: De gedetecteerde DNA-concentratie is ongeveer 300 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 6 ug. De hoeveelheid van DNA van andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS, hoeveelheid plasmide gebruikt voor PCR, annealing temperatuur van primers en cyclusnummer.
- Bevries het DNA bij -20 ° C gedurende een lange tijd of zodanig gebruikt voor IVT.
3. Controle Stap: Kwaliteit van de PCR-product
- De kwaliteit van het PCR product door gel elektroforese DNA.
- Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE.
- Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing.
- Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel.
- Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel gestold.
- Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade.
- Meng 2 pl (200 ng) van 80-10,000 bp DNA ladder en 200 ng PCR-product met elk 2 pl 6x laadbuffer in een totaal volume van 12 pl.
- Laden DNA monsters voorzichtig in de putjes van de agarose gel.
- Met behulp van 1x TBE als running buffer, lopen de agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur.
- Visualiseren DNA banden op een beeldvormingssysteem (figuur 2).
4. In vitro transcriptie (IVT)
- OPMERKING: Na PCR werd het plasmide inserts worden geamplificeerd en een poly T-staart toegevoegd. Tijdens de IVT wordt genetische informatie getranscribeerd van DNA naar RNA. De gegenereerde mRNA transcript wordt gebruikt om eiwitten in cellen.
- Reinig de werkruimte en pipetten met een RNase decontamination oplossing. Gebruik PCR schoon en steriel dual-filter pipet tips en vaak veranderen handschoenen om besmetting te minimaliseren van de reactie vermengt met RNases.
- Bereid de NTP / cap analoog mengsel als beschreven in Tabel 3.
- Meng de NTP / dop analoge mengsel goed door vortexen en spin down kort.
- Monteer de IVT reactiemengsel zoals beschreven in Tabel 4.
- Meng de IVT reactiemengsel grondig door de pipet voorzichtig op en neer. Centrifugeer de PCR-buis kort het mengsel verzamelen op de bodem van de buis.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 uur in een thermomixer.
OPMERKING: De optimale incubatietijd afhankelijk van de lengte van de inserties en transcriptionele efficiëntie van template gegeven. Voor korte inzetstukken (<500 nt), kan een langere incubatietijd voordelig zijn. Een tijdsverloop experiment kan worden gedaan om de optimale incubatietijd voor een maximale opbrengst te bepalen. Daarom zetten IVT reacties, voor example, 1, 2, 3, 4, 6 uur en overnacht incubatie en bepalen de hoeveelheid mRNA. De kinetiek van de in vitro transcriptie voor het genereren van eGFP mRNA wordt getoond in figuur 3. - Om het matrijs-DNA te verwijderen, 1 gl DNase (2 U / pl) aan de IVT reactiemengsel mengen en incubeer 15 min bij 37 ° C.
- Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 40 ul nuclease-vrij water. OPMERKING: De gedetecteerde RNA-concentratie is ongeveer 1500 pg / ml. Derhalve dient de verwachte totale ~ 120 ug. De hoeveelheid mRNA gesynthetiseerde andere eiwitten kan afhankelijk van de lengte van CDS en de hoeveelheid PCR product voor IVT.
5. Behandeling van gezuiverde mRNA met Antarctische Phosphatase
- OPMERKING: De gegenereerde mRNA behandeld met fosfatase verwijderen 5 'trifosfaten, die kunnen worden herkend door RIG-I en tot immuunactivatie. Bovendien is de fosfatase behandeling voorkomt opnieuw circularization als zelfstandige ligatiereactie.
- Voeg 9 ul van 10x reactiebuffer Antarctische fosfatase tot 79 pl gezuiverd mRNA oplossing. Voeg vervolgens 2 pl Antarctische fosfatase (5 U / ul) en het monster wordt zachtjes mengen. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 30 min.
- Zuiver het reactiemengsel met een RNA zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Elueer het gemodificeerde mRNA van de spinkolom membraan tweemaal met 50 ul nuclease-vrij water.
- Meet de concentratie van het gemodificeerde mRNA met een spectrofotometer. Controleer dat de verhouding van de absorptie bij 260 nm / 280 nm (A260 / A280) is ≥ 1,8 en de verhouding A 260 / A 230 is 2,0, wat aangeeft zuiverheid.
OPMERKING: De verwachte totale opbrengst moet ongeveer 90 ug te zijn, dat is sufficient ongeveer 36 mRNA transfecties. - Stel de concentratie van mRNA tot 100 ng / pl door toevoeging van nuclease-vrij water.
- Aliquot het gemodificeerde mRNA in single-aliquots vereist voor transfecties en bewaar bij -80 ° C. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien cycli. Goed voorbereid en opgeslagen mRNA stabiel gedurende vele jaren. Tijdens het werken, altijd de gewijzigde mRNA op ijs.
6. Controle Stap: Kwaliteit van Gesynthetiseerd Gemodificeerde mRNA
- Controleer de kwaliteit van gemodificeerde mRNA door RNA gelelektroforese.
- Meng de gewenste hoeveelheid agarose met 1x TBE in een kolf. Voor een 1% agarose gel, voeg 0,5 g agarose 50 ml 1x TBE.
- Magnetron tot de agarose is opgelost. Laat het niet koken. Zorg ervoor dat de agarose volledig in oplossing.
- Voeg 5 gl nucleïnezuur gel vlek 50 ml agarose gel.
- Giet de gel in een agarosegel doos, zet de kam, en wacht ongeveer 1 uur totdat de gel is solidified.
- Verwijder de kam en plaats de doos gel in een gel lade.
- Meng 3 pl (3 ug) van 0,5-10 kb RNA Ladder en 200 ng mRNA gesynthetiseerd gemodificeerd met elk 7 ul loading buffer in een totaal volume van 10 pl. De samenstelling van de laadbuffer wordt beschreven in Tabel 5.
- Denatureren de ladder en het mRNA monsters bij 70 ° C gedurende 10 min.
- Laadt de ladder en de mRNA monsters op 1% agarose gel zorgvuldig.
- Voer elektroforese bij 100 V gedurende 1 uur met 1x TBE als loopbuffer.
- Visualiseren ladder en mRNA banden op een UV transilluminator en foto met een gel documentatiesysteem (figuur 4).
7. Voorbereiding van Cellen voor transfectie
- Plaat 2 x10 5 cellen (HEK293 cellen) per putje van 12-well plaat.
- Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C in een cel incubator. OPMERKING: Op de dag van transfectie, moet de cellen hebben reached 80-90% samenvloeiing.
8. Het uitvoeren van mRNA Transfectie van Cellen
- Ontdooi de gewijzigde mRNA.
- Genereren lipoplexen voor transfectie.
- Voeg 25 pl (2,5 ug) van gemodificeerde mRNA en 2 pl kationisch lipide transfectie reagens 473 ul Opti-MEM (minimaal essentieel medium) I gereduceerd serum medium om de transfectie mengsel voor transfectie van een putje van een 12-wells plaat genereren. Opschalen volumes volgens het aantal putten te transfecteren. Als negatieve controle, bereiden een transfectie mengsel zonder mRNA.
- Meng de componenten voorzichtig door pipetteren. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 min lipoplexen voor transfectie genereren.
OPMERKING: De transfectie mengsel bevat geen antibiotica. Dus, zorg om de steriliteit te waarborgen en tegelijkertijd de behandeling van de cellen. - Was de cellen met 500 gl DPBS / putje.
- Voeg 500 ul transfectie mengsel een putje van een 12-well plaTE.
- Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zuig het transfectie mengsel en voeg 1 ml volledig celkweekmedium aan de cellen.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de cel incubator.
- Voer fluoriscentiemicroscopische analyseert met behulp van een fluorescentie microscoop (Figuur 5). OPMERKING: Om de expressie van andere eiwitten in cellen, die worden geproduceerd door transfectie met andere mRNA dan eGFP codering mRNA te onderzoeken, kunnen de cellen worden gekweekt op dekglaasjes. Dan de transfectie kan worden uitgevoerd en de cellen worden gekleurd met geschikte antilichamen en door fluorescentiemicroscopie geanalyseerd.
9. Flowcytometrische Analyses van eGFP Expressie in cellen
- Verwijderen celkweekmedium uit de putjes en spoel elk putje met 1 ml DPBS (zonder calcium en magnesium). Voeg 500 ul trypsine / EDTA per putje om de cellen los van het oppervlak van celkweek platen. Voeg vervolgens 500gl per putje TNS trypsine te inactiveren.
- Centrifugeer de losgemaakte cellen gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant zodat alleen de pellet. Resuspendeer de celpellet in 150 ui cel fixatie oplossing en breng de celsuspensie in een flowcytometrie buis.
- Analyseer het percentage van eGFP expressie brengende cellen en de fluorescentie-intensiteit met Geo Mean (geometrisch gemiddelde fluorescentie-intensiteit) (Figuur 6).
10. Meting van Protein Expression Over Time
- Voer mRNA transfectie van cellen in 3 wells van een 12-well plaat zoals beschreven in stap 8. Bovendien incubeer 3 putjes van HEK293 cellen met de transfectie mengsel zonder toevoeging van mRNA.
- Meet de expressie van eGFP 1, 2 en 3 dagen na transfectie met de duur van eiwitexpressie (figuur 7) te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met een pcDNA 3.3 plasmide dat de CDS van eGFP, de synthese van gemodificeerde eGFP mRNA werd vastgesteld (figuur 1). Na insertie amplificatie met PCR en poly T-tailing is een duidelijke band met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd (Figuur 2). Verhogen van de IVT tijd Augmented de opbrengst van mRNA (figuur 3). Na de IVT, werd een duidelijke band mRNA met een lengte van ongeveer 1100 bp gedetecteerd, hetgeen overeenkomt met de lengte van eGFP mRNA te produceren (figuur 4).
De functionaliteit van de gegenereerde eGFP mRNA werd getest door transfectie van HEK293-cellen. Hiertoe werden transfectie complexen (lipoplexen) gegenereerd met een kationisch lipide transfectie reagens. De transfectie werd uitgevoerd met 2 x 10 5 cellen per well van 12-well plaat. De productie van eGFP in de cellen werd gedetecteerd 24 uur na transfectie met fluorescentiemicroscopie (FiguAd 5) en flowcytometrie (Figuur 6).
HEK293-cellen werden getransfecteerd met eGFP mRNA. eGFP expressie werd bepaald 1, 2, en 3 dagen na transfectie met de duur van eiwitexpressie in de cellen geëvalueerd (figuur 7). Na 24 uur werd de eiwitexpressie was het hoogst in de cellen. Het bedrag werd verminderd 1,6-voudige elke volgende dag. Zelfs na 3 dagen, de cellen bevatte eGFP.
Figuur 1:. Overzicht van de gewijzigde mRNA productieproces coderende DNA-sequenties (CDS) met bekende flankerende sequenties worden geamplificeerd door PCR met gebruikmaking van specifieke primers. Het PCR-product wordt gezuiverd en de kwaliteit van de gegenereerde DNA bepaald. Het mRNA wordt geproduceerd uit DNA product met de in vitro transcriptie proces. Het product is purifie d en behandeld met fosfatase 5'-trifosfaten verwijderen. Na de aanvullende zuivering en kwaliteitscontrole van geproduceerde mRNA kan het mRNA transfecties uitgevoerd.
Figuur 2:. Analyse van DNA product na DNA ladder en PCR product PCR werden op een 1% agarose gel. Een duidelijke DNA band met een lengte van ongeveer 1100 bp worden gedetecteerd.
Figuur 3:. Kinetiek van in vitro transcriptie voor het genereren van eGFP mRNA 1) RNA ladder en IVT producten na 2) 0 min, 3) 10 min, 4) 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min, en 7) DNA-matrijs alleen werden op een 1% agarose gel.
Figuur 4:. Analyse van mRNA product na IVT RNA ladder en IVT product werden op een 1% agarose gel. Een duidelijke mRNA band met een lengte van ongeveer 1100 bp worden gedetecteerd.
Figuur 5: Fluorescentiemicroscopische analyse van HEK293-cellen 24 uur na transfectie eGFP mRNA. (A) fase contrast beeld van de cellen bij een vergroting van 100X. (B) Fluorescentie afbeeldingen van de cellen bij een vergroting van 100X.
Cijfer6: Flowcytometrische analyses van eGFP expressie in HEK293 cellen 24 uur na eGFP mRNA transfectie De roze lijn vertegenwoordigt cellen zonder mRNA transfectie en de blauwe lijn vertegenwoordigt eGFP positieve cellen na eGFP mRNA transfectie.. Na eGFP mRNA transfectie, 93,91% van alle gemeten cellen zijn positief en het Geo Mean (meetkundig gemiddelde van fluorescentie-intensiteit) is 720,16.
Figuur 7: Flow cytometrische analyses van eGFP expressie in HEK293 cellen 1, 2 en 3 dagen na transfectie eGFP mRNA De eiwitexpressie hoogste 24 uur na transfectie mRNA.. Daarna wordt de hoeveelheid verminderd met een factor 1,6 elke dag (n = 3).
Tabel 1: Samenstelling van PCR mengsel.
| Bestanddeel | Eindconcentratie | Bedrag (pl) |
| Forward Primer | 0.7 uM | 7 |
| Reverse Primer | 0.7 uM | 7 |
| 5x Q-Solution | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelityTM PCR Buffer | 1x | 20 |
| Plasmide DNA | 50 ng / 100 pl | Veranderlijk |
| HotStar HiFidelityTM DNA polymerase (2,5 U / pl) | 2.5 U | 1 |
| Nuclease-vrij water | Veranderlijk | |
| Totale volume | 100 |
Tabel 1: Samenstelling van PCR mengsel.
| Cyclus Aantal | Tijd | Temperatuur (° C) | |
| Initiële denaturatie stap | 1 | 5 min | 95 |
| 3-Step Cycling | 2-25 | ||
| · Denaturatie | 45 sec | 95 | |
| · Gloeien | 1 min | 55 | |
| · Uitbreiding | 1 min | 72 | |
| Laatste verlenging stap | 26 | 10 min | 72 |
| Einde van PCR fietsen | Onbepaald | 4 |
Tabel 2: PCR fietsen protocol.
| Bestanddeel | De concentratie (mM) | Uiteindelijke concentratie (mM) | Volume (pi) |
| ATP (van MEGAscript T7 Kit) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (van MEGAscript T7 Kit) | 75 | 1.875 | 1 |
| Me-CTP (van Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| Pseudo-UTP (van Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-Me-m 7 G (5') ppp (5') G RNA cap-structuur analoge | 10 | 2.5 | 10 |
| Totale volume | 23 |
Tabel 3: Samenstelling van NTP / cap analoge mengsel.
| Bestanddeel | Eindconcentratie | Bedrag (pl) |
| Nuclease-vrij water | Veranderlijk | |
| RNase Inhibitor | 40 U | 1 |
| NTP / cap analoge mengsel (uit stap 4.3) | 23 | |
| PCR product | 1 ug | Veranderlijk |
| 10x reactie buffer | 1x | 4 |
| 10x T7 RNA polymerase enzymmengsel | 1x | 4 |
| Totale volume | 40 |
Tabel 4: Samenstelling van de in vitro transcriptie (IVT) reactiemengsel.
| Bestanddeel | Bedrag (pl) |
| Formamide | 3.3 |
| 37% formaldehyde | 1 |
| MEN buffer (10x) | 1 |
| 6x ladingsbuffer (met de peqGOLD Range Mix DNA ladder meegeleverd) | 1.7 |
| Totale volume | 7 |
Tabel 5: Bereiding laadbuffer voor RNA gelelektroforese.
| Celcultuurmedium en Buffer | |
| HEK-293 celcultuurmedium | Voeg 25 ml FCS, 2,5 ml penicilline / streptomycine, 2,5 ml L-gluTamine in 220 ml DMEM hoge glucose. Bewaar het bij 4 ° C en gebruik het binnen 2 weken. |
| TBE buffer (10x) | Los op 0,9 M Tris-base, 0,9 M boorzuur en 20 mM EDTA in 1 L water (Ampuwa). De pH van de buffer 8. |
| MEN buffer (10x) | Los op 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA in 1 L water (Ampuwa). Stel de pH met NaOH tot 7. |
Tabel 6: Celkweekmedium en buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mRNA therapie enorm potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, behandeling van ziekten en vaccinatie. In deze video tonen we de productie van een gestabiliseerd, gemodificeerd mRNA voor inductie van eiwitexpressie in cellen. Met dit protocol kunnen andere gewenste mRNA gegenereerd. De in vitro synthese van gemodificeerde mRNA kan de transfectie van cellen met gewenste mRNA expressie van doeleiwitten induceren. Daardoor wordt het gewenste eiwit transiënt tot expressie gebracht onder fysiologische omstandigheden tot exogeen geleverde mRNA volledig afgebroken.
In deze video, de expressie van eGFP werd aangetoond voor 3 dagen na een transfectie van HEK293 cellen met eGFP mRNA. mRNA-moleculen coderen andere eiwitten kan leiden tot een kortere periode eiwitexpressie. De expressie van het eiwit daalt als gevolg van afbraak van het exogeen geleverde mRNA. Daarom is de beperking van deze techniek some toepassingen kunnen de voorbijgaande inductie van eiwitexpressie zijn. Dus om eiwitexpressie in cellen langer behouden herhaald levering van mRNA vereist. Hoewel transfectie mRNA heeft het voordeel van niet-integratie in het gastheergenoom, waarbij mutagenese en de ontwikkeling van kanker en leukemie vergeleken met virale vectoren voorkomen, kunnen de in vivo transfectie-efficiëntie dan met behulp van virale vectoren.
De vereiste mRNA concentratie en hoeveelheid transfectie reagens moet worden geoptimaliseerd voor elke verschillende celtype 14, waarbij de doelcellen exogene levering van mRNA naar de ontbrekende eiwit produceren.
Herhaald invriezen en ontdooien van mRNA moet worden vermeden om de stabiliteit van de geproduceerde mRNA handhaven. Daarom kan werken aliquots worden bereid. Na PCR en IVT moet slechts een enkele specifieke band gedetecteerd. Anders, het aantal PCR-cycli primer Annealeng temperatuur en / of de hoeveelheid plasmide DNA worden geoptimaliseerd om specifieke DNA te verkrijgen voor IVT. Bovendien kan het IVT tijd en de hoeveelheid DNA-matrijs voor IVT worden geoptimaliseerd om mRNA verkrijgen van een bepaalde lengte in voldoende hoeveelheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door het Europees Sociaal Fonds in Baden-Wuerttemberg, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
