Summary
इस वीडियो लेख में, हम कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए संशोधित mRNA की इन विट्रो संश्लेषण का वर्णन.
Abstract
वांछित कोशिकाओं में प्रोटीन संश्लेषण के शामिल होने के लिए सिंथेटिक मैसेंजर आरएनए (mRNA) कोडिंग के बहिर्जात वितरण पुनर्योजी दवा, बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान, रोगों के उपचार, और कोशिकाओं के reprogramming के क्षेत्र में अपार क्षमताएं हैं. यहाँ, हम प्रवाह cytometry द्वारा प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति की कम प्रतिरक्षा सक्रियण क्षमता और वृद्धि की स्थिरता, उत्पादन mRNA की गुणवत्ता नियंत्रण, कोशिकाओं के अभिकर्मक mRNA के साथ और सत्यापन के साथ संशोधित mRNA की पीढ़ी के लिए कदम प्रोटोकॉल से एक कदम का वर्णन. EGFP mRNA के साथ एक एकल अभिकर्मक के बाद 3 दिन तक, ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं EGFP उत्पादन. इस वीडियो लेख में, EGFP mRNA की संश्लेषण एक उदाहरण के रूप में वर्णित है. हालांकि, प्रक्रिया अन्य वांछित mRNA की उत्पादन के लिए लागू किया जा सकता है. MRNA के संशोधित सिंथेटिक का प्रयोग, कोशिकाओं क्षणिक वे सामान्य रूप से व्यक्त नहीं होता जो वांछित प्रोटीन, व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है.
Introduction
कोशिकाओं में, मैसेंजर आरएनए का प्रतिलेखन (mRNA) और वांछित प्रोटीन में mRNA की निम्नलिखित अनुवाद कोशिकाओं के समुचित कार्य सुनिश्चित करते हैं. वंशानुगत या अधिग्रहीत आनुवंशिक विकार प्रोटीन की अपर्याप्त और बेकार संश्लेषण के लिए नेतृत्व और गंभीर बीमारियों का कारण बन सकता है. इस प्रकार, लापता या दोषपूर्ण प्रोटीन के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए एक नया चिकित्सकीय दृष्टिकोण कोशिकाओं में mRNA संशोधित सिंथेटिक के बहिर्जात वितरण, वांछित प्रोटीन के लिए जो कोड है. इस प्रकार, कोशिकाओं वे सामान्य रूप से उत्पादन नहीं कर सकते या स्वाभाविक रूप से जरूरत नहीं होगी जो कार्यात्मक प्रोटीन, synthesize करने के लिए शुरू हो रहे हैं. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, आनुवंशिक विकार mRNA की शुरूआत से ठीक किया जा सकता है कि दोषपूर्ण या लापता प्रोटीन 1 के लिए कोड. mRNA के चिकित्सा भी ट्यूमर कोशिकाओं या रोगजनकों द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, जो प्रोटीन एंटीजन, synthetize को टीकाकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रभावी ढंग से ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने या infe को रोकने के लिए सक्रिय किया जा सकताctions 2,3. इसके अलावा, हाल के वर्षों में, mRNA के सफलतापूर्वक प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए, fibroblasts के reprogramming की अभिव्यक्ति 4-6 कारकों को प्रेरित करने के लिए और पुनर्योजी चिकित्सा में एक विशाल क्षमता के साथ IPSCs में उन्हें बदलने की mRNAs साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे.
इससे पहले, पारंपरिक mRNA की उपयोग कम स्थिरता और मजबूत प्रतिरक्षाजनकता के साथ जुड़े थे. इस प्रकार, पारंपरिक mRNAs का नैदानिक अनुप्रयोगों सीमित थे. हालांकि, Kariko और उनके सहयोगियों द्वारा mRNA के अणु के भीतर 5-methylcytidine और pseudouridine द्वारा cytidine और uridine के प्रतिस्थापन जैविक तरल पदार्थ में स्थिर mRNA के अणुओं गाया और नाटकीय रूप से अब संशोधित mRNAs का नैदानिक प्रयोज्यता की अनुमति देता है जो प्रतिरक्षा सक्रियण 7-10, कम कर दिया.
Synthetically का उत्पादन संशोधित mRNAs का प्रयोग, वांछित जीन टेप अस्थायी रूप से विवो 11 में दिया जा सकता हैया इन विट्रो में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए. पेश mRNA के सेलुलर अनुवाद मशीनरी द्वारा शारीरिक परिस्थितियों में अनुवाद किया है. कारण वायरल जीन थेरेपी वैक्टर की तुलना में मेजबान सेल जीनोम में एकीकरण की कमी के कारण, oncogenesis का खतरा 12,13 रोका है. इस प्रकार, संशोधित सिंथेटिक mRNA का उपयोग चिकित्सा भविष्य में बेहतर नैदानिक स्वीकृति मिल जाएगी.
यहाँ, हम संशोधित mRNA की उत्पादन (चित्रा 1) mRNA के साथ कोशिकाओं और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की, अभिकर्मक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
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Protocol
आवश्यक डीएनए दृश्यों कोडिंग युक्त plasmids के 1. विस्तार (सीडीएस)
- पूर्व गर्म कमरे के तापमान को परिवर्तन किट में शामिल है जो समाज मध्यम, और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन युक्त लेग अगर प्लेटों. 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान संतुलित करना.
- रासायनिक घटक ई की एक शीशी पिघलना बर्फ पर कोलाई.
- रासायनिक घटक ई की शीशी में सीडीएस युक्त प्लाज्मिड की 1-5 μl (100 एनजी को 10 पीजी) जोड़ें कोलाई और धीरे मिश्रण. Pipetting द्वारा कोशिकाओं मिश्रण नहीं है. प्लास्मिड जोड़ने के बाद, धीरे ट्यूब दोहन द्वारा मिश्रण.
- 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं.
- हीट सदमे ई झटकों के बिना एक पानी के स्नान में 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए कोलाई.
- 2 मिनट के लिए बर्फ पर शीशी रखें.
- ई करने के लिए पूर्व गर्म समाज माध्यम के 250 μl जोड़ें कोलाई जीवाणु इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 300 rpm पर क्षैतिज बैक्टीरिया मिलाने और.
- 100 μl और पूर्व गर्म लेग अगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण से 150 μl बिखरा प्लेटों को पलटना और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
- कालोनियों दृष्टिगोचर हो जाने के बाद, 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन के साथ 5 मिलीलीटर लेग मध्यम युक्त एक 15 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में प्रत्येक थाली से एक भी कॉलोनी टीका लगाना. संस्कृति देर प्रवेश या स्थिर चरण में है जब तक 300 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात उन्हें सेते हैं.
- बदल ई की लंबी अवधि के भंडारण के लिए कोलाई, pipet cryovial में 100% ग्लिसरॉल के 75 μl. जीवाणु संस्कृति (जमे हुए शेयर 25% ग्लिसरॉल शामिल होंगे) के 225 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovial की दुकान.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग आवश्यक सीडीएस युक्त प्लास्मिड पृथक.
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग प्लाज्मिड एकाग्रता का निर्धारण.
- 20 μl की aliquots तैयार है और लंबे समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.
- नोट: पीसीआर का उपयोग परिलक्षित होता है इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT), यहां ब्याज की सीडी, EGFP, के लिए डीएनए टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए. इसके साथ ही, 120 thymidines (टी) के एक पाली टी पूंछ एक टी 120 विस्तार के साथ एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके डालने के लिए जोड़ा है. इस प्रकार, उत्पन्न mRNAs IVT के बाद एक निर्धारित लंबाई के साथ एक पाली ए-पूंछ प्राप्त करते हैं.
- तालिका 1 में विस्तृत रूप में पीसीआर मिश्रण तैयार करें.
- अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाएं. नोट: पीसीआर उत्पाद 4-5 IVT प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है. IVT के लिए डीएनए टेम्पलेट राशि बढ़ाने के लिए, पीसीआर मिश्रण की कुल मात्रा बढ़ा जा सकता है. कई पीसीआर ट्यूब प्रत्येक युक्त 100 μl पीसीआर मिश्रण पीसीआर उत्पाद की पर्याप्त उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक thermocycler में पीसीआर ट्यूब प्लेस और पीसीआर साइकिल प्रोटोकॉल (तालिका 2) का उपयोग करते हुए पीसीआर चला रहे हैं.
- पी साफ20 μl nuclease मुक्त पानी का उपयोग डीएनए निर्माता के निर्देशों के और elute अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर सीआर प्रतिक्रिया.
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए की एकाग्रता उपाय. नोट: पता लगाया डीएनए एकाग्रता लगभग 300 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर है. इस प्रकार, उम्मीद की कुल राशि ~ 6 माइक्रोग्राम प्रति होना चाहिए. अन्य प्रोटीन के लिए डीएनए की राशि सीडीएस की लंबाई के आधार पर अलग कर सकते हैं, प्लाज्मिड की राशि पीसीआर, प्राइमरों की annealing तापमान, और चक्र संख्या के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक लंबे समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए रुक या IVT के लिए सीधे इस्तेमाल करते हैं.
3. नियंत्रण कदम: पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता
- डीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता की जाँच करें.
- एक फ्लास्क में 1x TBE साथ agarose के वांछित राशि मिलाएं. एक 1% agarose जेल के लिए, 1x TBE की 50 मिलीलीटर agarose के 0.5 ग्राम जोड़ें.
- जब तक agarose माइक्रोवेव भंग कर रहा है. यह फोड़ा मत देना. Agarose समाधान में पूरी तरह से है कि यह सुनिश्चित करें.
- 50 मिलीलीटर agarose जेल को 5 μl न्यूक्लिक एसिड जेल दाग जोड़ें.
- , एक agarose जेल बॉक्स में जेल डालो कंघी सेट, और जेल जम जब तक लगभग 1 घंटा इंतजार.
- कंघी निकालें और एक जेल ट्रे में जेल बॉक्स जगह है.
- 12 μl की कुल मात्रा में 2 μl 6x लोड हो रहा है बफर के साथ 80-10,000 बीपी डीएनए सीढ़ी के 2 μl (200 एनजी) और पीसीआर उत्पाद के 200 एनजी प्रत्येक मिलाएं.
- ध्यान agarose जेल के कुओं में डीएनए नमूने लोड.
- बफर चलाने के रूप में 1x TBE का प्रयोग, 1 घंटे के लिए 100 वी पर agarose जेल चला रहे हैं.
- एक इमेजिंग प्रणाली (चित्रा 2) पर डीएनए बैंड कल्पना.
4. इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT)
- नोट: पीसीआर के बाद, प्लाज्मिड सम्मिलित परिलक्षित कर रहे हैं और एक पाली टी पूंछ जोड़ा जाता है. IVT के दौरान, आनुवंशिक जानकारी डीएनए से शाही सेना को लिखित है. उत्पन्न mRNA के प्रतिलेख कोशिकाओं में प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक RNase डी के साथ कार्य क्षेत्र और pipettes साफecontamination समाधान. प्रतिक्रिया RNases साथ घुलमिल का अक्सर उपयोग पीसीआर स्वच्छ और बाँझ दोहरे फिल्टर विंदुक युक्तियाँ और प्रदूषण कम करने के लिए दस्ताने बदल जाते हैं.
- तालिका 3 में वर्णित के रूप में एनटीपी / टोपी अनुरूप मिश्रण तैयार करें.
- Vortexing द्वारा अच्छी तरह से एनटीपी / टोपी अनुरूप मिश्रण मिलाएं और संक्षेप में नीचे स्पिन.
- तालिका 4 में वर्णित के रूप में IVT प्रतिक्रिया मिश्रण को इकट्ठा करो.
- धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से IVT प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाएं. फिर ट्यूब के नीचे मिश्रण इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में पीसीआर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
- एक thermomixer में 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
नोट: इष्टतम ऊष्मायन समय सम्मिलित करता है और दिए गए टेम्पलेट के transcriptional दक्षता की लंबाई पर निर्भर करता है. कम सम्मिलित (NT <500) के लिए, एक लंबी ऊष्मायन समय लाभप्रद हो सकता है. एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग अधिकतम उपज के लिए इष्टतम ऊष्मायन समय निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है. इसलिए, exampl के लिए, IVT प्रतिक्रियाओं की स्थापनाई, 1, 2, 3, 4, 6 घंटा, और रात भर ऊष्मायन के लिए और mRNA राशि का निर्धारण. EGFP mRNA की पीढ़ी के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के कैनेटीक्स 3 चित्र में दिखाया गया है. - , टेम्पलेट डीएनए निकालने के IVT प्रतिक्रिया मिश्रण को DNase की 1 μl (2 यू / μl) जोड़ने के लिए, मिश्रण अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट सेते हैं.
- Manufacturer's निर्देश के अनुसार एक शाही सेना शुद्धि किट का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण शुद्ध. 40 μl nuclease मुक्त पानी के साथ दो बार स्पिन स्तंभ झिल्ली से संशोधित mRNA के elute. नोट: पता लगाया शाही सेना एकाग्रता लगभग 1500 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर है. इस प्रकार, उम्मीद की कुल राशि ~ 120 माइक्रोग्राम प्रति होना चाहिए. अन्य प्रोटीन के लिए संश्लेषित mRNA की राशि सीडीएस की लंबाई और IVT के लिए इस्तेमाल किया पीसीआर उत्पाद की मात्रा के आधार पर अलग कर सकते हैं.
अंटार्कटिक फॉस्फेट के साथ शुद्ध mRNA की 5. उपचार
- नोट: उत्पन्न mRNA के 5 दूर करने के लिए फॉस्फेट के साथ व्यवहार किया जाता है 'त्रिप्रतिरक्षा सक्रियण के लिए रिग मैं द्वारा मान्यता प्राप्त है और नेतृत्व किया जा सकता है जो फॉस्फेट,. इसके अलावा, फॉस्फेट उपचार एक आत्म बंधाव प्रतिक्रिया में पुनः circularization रोकता है.
- शुद्ध mRNA के समाधान के 79 μl को 10x अंटार्कटिक फॉस्फेट प्रतिक्रिया बफर के 9 μl जोड़ें. बाद में, अंटार्कटिक फॉस्फेट (5 यू / μl) के 2 μl जोड़ने और धीरे नमूना मिश्रण. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं.
- Manufacturer's निर्देश के अनुसार एक शाही सेना शुद्धि किट का उपयोग कर प्रतिक्रिया मिश्रण शुद्ध. 50 μl nuclease मुक्त पानी के साथ दो बार स्पिन स्तंभ झिल्ली से संशोधित mRNA के elute.
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर संशोधित mRNA की एकाग्रता उपाय. जाँचें 260 एनएम / 280 एनएम पर absorbance के अनुपात (ए 260 / ए 280) ≥ 1.8 और ए 260 का अनुपात / ए 230 पवित्रता को इंगित करता है, जो 2.0 है है कि.
नोट: उम्मीद की कुल उपज जो sufficie है, लगभग 90 माइक्रोग्राम प्रति होना चाहिएNT लगभग 36 mRNA के transfections के लिए. - Nuclease मुक्त पानी जोड़कर 100 एनजी / μl के लिए mRNA की एकाग्रता को समायोजित करें.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर transfections और दुकान के लिए आवश्यक एकल उपयोग aliquots में संशोधित mRNA के विभाज्य. कई फ्रीज और पिघलना चक्र से बचें. ठीक से तैयार और mRNA के कई वर्षों के लिए स्थिर है संग्रहीत. काम के दौरान, हमेशा बर्फ पर संशोधित mRNA के रखना.
6. नियंत्रण कदम: संश्लेषित संशोधित mRNA की गुणवत्ता
- आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा संशोधित mRNA की गुणवत्ता की जाँच करें.
- एक फ्लास्क में 1x TBE साथ agarose के वांछित राशि मिलाएं. एक 1% agarose जेल के लिए, 1x TBE की 50 मिलीलीटर agarose के 0.5 ग्राम जोड़ें.
- जब तक agarose माइक्रोवेव भंग कर रहा है. यह फोड़ा मत देना. Agarose समाधान में पूरी तरह से है कि यह सुनिश्चित करें.
- 50 मिलीलीटर agarose जेल को 5 μl न्यूक्लिक एसिड जेल दाग जोड़ें.
- एक agarose जेल बॉक्स में जेल डालो कंघी सेट, और जेल सोली है जब तक लगभग 1 घंटा इंतजारdified.
- कंघी निकालें और एक जेल ट्रे में जेल बॉक्स जगह है.
- 0.5-10 केबी शाही सेना सीढ़ी के 3 μl (3 माइक्रोग्राम प्रति) और mRNA के 10 μl की कुल मात्रा में 7 μl लोड हो रहा है बफर के साथ एक संशोधित संश्लेषित के 200 एनजी मिलाएं. लोड हो रहा है बफर की रचना तालिका 5 में वर्णित है.
- 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सीढ़ी और mRNA नमूनों denature.
- सावधानी से सीढ़ी और 1% agarose जेल पर mRNA के नमूने लोड.
- बफर चलाने के रूप में 1x TBE का उपयोग 1 घंटे के लिए 100 वी पर वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना.
- एक जेल प्रलेखन प्रणाली (चित्रा 4) का उपयोग कर एक यूवी transilluminator और तस्वीर पर सीढ़ी और mRNA बैंड कल्पना.
7. अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं की तैयारी
- 12 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति प्लेट 2 X10 5 कोशिकाओं (HEK293 कोशिकाओं).
- एक सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं. नोट: अभिकर्मक के दिन पर, कोशिकाओं reac होनी चाहिए80-90% संगम hed.
8. कोशिकाओं की mRNA के अभिकर्मक प्रदर्शन
- संशोधित mRNA के पिघलना.
- अभिकर्मक के लिए लाइपोप्लेक्सेस उत्पन्न करता है.
- संशोधित mRNA की 25 μl (2.5 माइक्रोग्राम प्रति) और मैं एक 12 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से अभिकर्मक के लिए अभिकर्मक मिश्रण उत्पन्न करने के लिए सीरम मध्यम कम 473 μl Opti- सदस्य (न्यूनतम आवश्यक मध्यम) को cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक के 2 μl जोड़ें. ट्रांसफ़ेक्ट हो कुओं की संख्या के अनुसार संस्करणों को पैमाने पर. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, mRNA के बिना एक अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं.
- Pipetting द्वारा धीरे घटकों मिलाएं. अभिकर्मक के लिए लाइपोप्लेक्सेस उत्पन्न करने के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं.
नोट: अभिकर्मक मिश्रण कोई एंटीबायोटिक दवाओं में शामिल है. इस प्रकार, कोशिकाओं से निपटने जबकि बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना. - 500 μl DPBS के साथ कोशिकाओं को धो लें / अच्छी तरह से.
- एक 12 अच्छी तरह से पीएलए की एक अच्छी तरह से करने के लिए अभिकर्मक मिश्रण μl 500 जोड़ेंते.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- अभिकर्मक मिश्रण Aspirate और कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर पूरा सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें.
- सेल इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- प्रतिदीप्ति सूक्ष्म प्रदर्शन करना एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 5) का उपयोग का विश्लेषण करती है. नोट: EGFP के अलावा अन्य mRNA के mRNA के कोडिंग के साथ अभिकर्मक द्वारा उत्पादित कर रहे हैं जो कोशिकाओं में अन्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, कोशिकाओं coverslips पर खेती की जा सकती. तब अभिकर्मक किया जा सकता है और कोशिकाओं उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति की 9. प्रवाह cytometric विश्लेषण
- कुओं से सेल संस्कृति के माध्यम से निकालें और (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) 1 मिलीलीटर DPBS के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धोने. सेल संस्कृति प्लेटों की सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 500 μl / trypsin EDTA जोड़ें. बाद में, 500 जोड़μl टीएनएस प्रति अच्छी तरह से trypsin निष्क्रिय करने के लिए.
- कमरे के तापमान पर 300 XG पर 5 मिनट के लिए अलग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. केवल गोली छोड़ने सतह पर तैरनेवाला निकालें. 150 μl सेल निर्धारण समाधान में सेल गोली Resuspend और ट्यूब cytometry के एक प्रवाह में सेल निलंबन हस्तांतरण.
- EGFP व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत और भू मीन (प्रतिदीप्ति तीव्रता के ज्यामितीय मतलब) (चित्रा 6) का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करें.
समय से अधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति की 10 मापन
- इसके अतिरिक्त चरण 8 में वर्णित के रूप में, एक 12 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं में कोशिकाओं की mRNA के अभिकर्मक प्रदर्शन mRNA के अलावा बिना अभिकर्मक मिश्रण के साथ HEK293 कोशिकाओं के 3 कुओं सेते हैं.
- EGFP 1, 2 की अभिव्यक्ति उपाय है, और 3 दिन अभिकर्मक के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा 7) की अवधि का मूल्यांकन करने के लिए.
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Representative Results
EGFP की सीडी युक्त एक pcDNA 3.3 प्लाज्मिड का उपयोग करना, संशोधित EGFP mRNA की संश्लेषण (चित्रा 1) स्थापित किया गया था. पीसीआर द्वारा डालने प्रवर्धन और पाली टी पीछा करने के बाद, लगभग 1,100 बीपी की लंबाई के साथ एक स्पष्ट बैंड (चित्रा 2) का पता चला है. MRNA (चित्रा 3) की उपज IVT समय संवर्धित बढ़ रही है. IVT के बाद, लगभग 1,100 बीपी की लंबाई के साथ एक स्पष्ट mRNA के बैंड का उत्पादन किया जाना EGFP mRNA की लंबाई (चित्रा 4) से मेल खाती है, पता चला था.
उत्पन्न EGFP mRNA की कार्यक्षमता HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा परीक्षण किया गया था. इस प्रयोजन के लिए, अभिकर्मक परिसरों (लाइपोप्लेक्सेस) एक cationic लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर उत्पन्न हुए थे. अभिकर्मक 12 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था. कोशिकाओं में EGFP का उत्पादन figu (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग अभिकर्मक के बाद 24 घंटा का पता चला थाफिर 5) और cytometry (चित्रा 6) प्रवाह.
HEK293 कोशिकाओं EGFP mRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. EGFP अभिव्यक्ति 1, 2, और 3 दिन अभिकर्मक कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की अवधि का मूल्यांकन करने के लिए (चित्रा 7) के बाद निर्धारित किया गया था. 24 घंटे के बाद, प्रोटीन अभिव्यक्ति की कोशिकाओं में सबसे ज्यादा था. राशि हर अगले दिन 1.6 गुना कम हो गया था. यहां तक कि 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं EGFP निहित.
चित्रा 1:. ज्ञात flanking दृश्यों के साथ संशोधित mRNA के उत्पादन की प्रक्रिया का अवलोकन कोडिंग डीएनए दृश्यों (सीडीएस) विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग पीसीआर द्वारा परिलक्षित कर रहे हैं. पीसीआर उत्पाद शुद्ध है और उत्पन्न डीएनए की गुणवत्ता निर्धारित किया जाता है. mRNA में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रिया का उपयोग डीएनए उत्पाद से उत्पन्न होता है. उत्पाद purifie है डी और फॉस्फेट के साथ इलाज 5'-triphosphates दूर करने के लिए. अतिरिक्त शुद्धि और उत्पन्न mRNA की गुणवत्ता नियंत्रण के बाद, mRNA के transfections किया जा सकता है.
चित्रा 2:. के बाद पीसीआर डीएनए सीढ़ी और पीसीआर उत्पाद डीएनए उत्पाद का विश्लेषण एक 1% agarose जेल पर चलाए जा रहे थे. लगभग 1,100 बीपी की लंबाई के साथ एक स्पष्ट डीएनए बैंड का पता लगाया जाना चाहिए.
चित्रा 3:. 2 के बाद EGFP mRNA 1) आरएनए सीढ़ी और IVT उत्पादों की पीढ़ी के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के कैनेटीक्स) 0 मिनट, 3) 10 मिनट, 4) 30 मिनट, 5) 180 मिनट, 6) 360 मिनट, और 7) डीएनए टेम्पलेट अकेले एक 1% agarose जेल पर चलाए जा रहे थे.
चित्रा 4:. IVT शाही सेना सीढ़ी और IVT उत्पाद के बाद mRNA के उत्पाद का विश्लेषण एक 1% agarose जेल पर चलाए जा रहे थे. लगभग 1,100 बीपी की लंबाई के साथ एक स्पष्ट mRNA के बैंड का पता लगाया जाना चाहिए.
चित्रा 5: HEK293 कोशिकाओं EGFP mRNA के अभिकर्मक के बाद 24 घंटे के प्रतिदीप्ति सूक्ष्म विश्लेषण. 100X के एक बढ़ाई कोशिकाओं की (ए) चरण विपरीत छवि. (बी) 100X के एक बढ़ाई कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों.
आकृति6: प्रवाह cytometric EGFP mRNA के अभिकर्मक के बाद HEK293 कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति की 24 घंटा का विश्लेषण करती है गुलाबी लाइन mRNA के अभिकर्मक बिना कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है और नीली रेखा EGFP mRNA के अभिकर्मक के बाद EGFP सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है.. EGFP mRNA के अभिकर्मक के बाद, सभी मापा कोशिकाओं के 93.91% सकारात्मक रहे हैं और भू मीन (प्रतिदीप्ति तीव्रता के ज्यामितीय मतलब) 720.16 है.
चित्रा 7: प्रवाह cytometric 1, 2, और 3 दिन EGFP mRNA के अभिकर्मक के बाद HEK293 कोशिकाओं में EGFP अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है प्रोटीन अभिव्यक्ति mRNA के अभिकर्मक के बाद उच्चतम 24 घंटा है.. इसके बाद राशि 1.6 गुना कम हो जाता है हर दिन (एन = 3).
तालिका 1: पीसीआर मिश्रण की संरचना.
| अंग | अंतिम एकाग्रता | राशि (μl) |
| आगे प्राइमर | 0.7 माइक्रोन | 7 |
| रिवर्स प्राइमर | 0.7 माइक्रोन | 7 |
| 5x क्यू समाधान | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity पीसीआर बफर | 1x | 20 |
| प्लास्मिड डीएनए | 50 एनजी / 100μl | परिवर्तनशील |
| HotStar HiFidelity डीएनए पोलीमरेज़ (2.5 यू / μl) | 2.5 यू | 1 |
| Nuclease मुक्त पानी | परिवर्तनशील | |
| कुल मात्रा | 100 |
तालिका 1: पीसीआर मिश्रण की संरचना.
| साइकिल संख्या | समय | तापमान (डिग्री सेल्सियस) | |
| प्रारंभिक विकृतीकरण कदम | 1 | 5 मिनट | 95 |
| 3-कदम साइकिल चलाना | 25/02 | ||
| · विकृतीकरण | 45 सेकंड | 95 | |
| · एनीलिंग | 1 मिनट | 55 | |
| · एक्सटेंशन | 1 मिनट | 72 | |
| अंतिम विस्तार कदम | 26 | 10 मिनट | 72 |
| पीसीआर साइकिल का अंत | अनिश्चितकालीन | 4 |
तालिका 2: पीसीआर साइकिल जनसंपर्कotocol.
| अंग | शेयर एकाग्रता (मिमी) | अंतिम एकाग्रता (मिमी) | वॉल्यूम (μl) |
| एटीपी (MEGAscript T7 किट से) | 75 | 7.5 | 4 |
| जीटीपी (MEGAscript T7 किट से) | 75 | 1.875 | 1 |
| (Trilink से) मुझे CTP | 100 | 7.5 | 3 |
| (Trilink से) छद्म UTP | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-ओ-मी-मी 7 जी (5') पीपीपी (5') जी आरएनए टोपी संरचना अनुरूप | 10 | 2.5 | 10 |
| कुल मात्रा | 23 |
तालिका 3: एनटीपी / टोपी अनुरूप मिश्रण की संरचना.
| अंग | अंतिम एकाग्रता | राशि (μl) |
| Nuclease मुक्त पानी | परिवर्तनशील | |
| RNase अवरोध करनेवाला | 40 यू | 1 |
| एनटीपी / टोपी अनुरूप मिश्रण (कदम 4.3 से) | 23 | |
| पीसीआर उत्पाद | 1 माइक्रोग्राम प्रति | परिवर्तनशील |
| 10x प्रतिक्रिया बफर | 1x | 4 |
| 10x T7 शाही सेना पोलीमरेज़ एंजाइम मिश्रण | 1x | 4 |
| कुल मात्रा | 40 |
सारणी 4: इन विट्रो प्रतिलेखन की संरचना (मैंवीटी) प्रतिक्रिया मिश्रण.
| अंग | राशि (μl) |
| Formamide | 3.3 |
| 37% formaldehyde | 1 |
| मर्दों बफर (10x) | 1 |
| (PeqGOLD रेंज मिक्स डीएनए सीढ़ी के साथ आपूर्ति) 6x लोड हो रहा है बफर | 1.7 |
| कुल मात्रा | 7 |
तालिका 5: आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए लोडिंग बफर तैयार करना.
| संस्कृति मध्यम और बफर सेल | |
| HEK-293 सेल संस्कृति माध्यम | एफसीएस के 25 एमएल, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन की 2.5 मिलीलीटर, एल ग्लू के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें220 मिलीलीटर DMEM उच्च ग्लूकोज में tamine. 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर और 2 सप्ताह के भीतर इसका इस्तेमाल. |
| TBE बफर (10x) | 0.9 एम Tris आधार, 0.9 एम बोरिक एसिड और 1 एल पानी में 20 मिमी EDTA (Ampuwa) भंग. बफर के पीएच 8. |
| मर्दों बफर (10x) | 200 मिमी mops, 50 मिमी NaOAc, 1 एल पानी में 10 मिमी EDTA (Ampuwa) भंग. 7 को NaOH के साथ पीएच मान को समायोजित करें. |
तालिका 6: सेल संस्कृति माध्यम और buffers.
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Discussion
mRNA के चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा, रोग और टीकाकरण के उपचार के क्षेत्र में जबरदस्त क्षमता है. इस वीडियो में, हम कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रेरण के लिए एक स्थिर, संशोधित mRNA की उत्पादन प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग, अन्य वांछित mRNA उत्पन्न किया जा सकता. संशोधित mRNA की इन विट्रो संश्लेषण लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए वांछित mRNAs के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक की अनुमति देता है. Exogenously दिया mRNA के पूरी तरह से अपमानित है जब तक इस प्रकार, वांछित प्रोटीन शारीरिक शर्तों के तहत क्षणिक व्यक्त किया है.
इस वीडियो में, EGFP की अभिव्यक्ति EGFP mRNA के साथ HEK293 कोशिकाओं की एक एकल अभिकर्मक के बाद 3 दिन के लिए प्रदर्शन किया गया. अन्य प्रोटीन कोडिंग mRNA के अणुओं एक कम प्रोटीन अभिव्यक्ति की अवधि के लिए ले जा सकता है. प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण exogenously दिया mRNA की गिरावट को कम हो जाती है. सोम के लिए इस तकनीक का इसलिए, सीमाई अनुप्रयोगों प्रोटीन अभिव्यक्ति की क्षणिक प्रेरण हो सकता है. इस प्रकार, एक लंबी अवधि के लिए कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए, mRNA की दोहराया प्रसव के लिए आवश्यक है. MRNA के अभिकर्मक insertional उत्परिवर्तजनन और वायरल वैक्टर की तुलना में कैंसर और ल्यूकेमिया के विकास को रोकता है जो मेजबान जीनोम, में गैर एकीकरण का लाभ दिया है, हालांकि, इन विवो अभिकर्मक दक्षता वायरल वैक्टर का उपयोग की तुलना में कम हो सकता है.
अभिकर्मक अभिकर्मक की आवश्यकता mRNA के एकाग्रता और राशि लापता प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए mRNA की बहिर्जात वितरण के लिए लक्ष्य कोशिकाओं रहे हैं जो एक अलग सेल प्रकार 14, के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
बार-बार ठंड और mRNA की विगलन उत्पादित mRNA की स्थिरता बनाए रखने के लिए बचा जाना चाहिए. इसलिए, काम कर aliquots तैयार किया जा सकता है. पीसीआर और IVT के बाद, केवल एक विशिष्ट बैंड का पता लगाया जाना चाहिए. अन्यथा, पीसीआर चक्रों की संख्या, प्राइमर anneaलिंग तापमान, और / या प्लास्मिड डीएनए की राशि IVT के लिए विशिष्ट डीएनए उत्पाद प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, IVT समय और IVT के लिए डीएनए टेम्पलेट की राशि पर्याप्त मात्रा में एक विशिष्ट लंबाई के mRNA के प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.
Acknowledgments
इस परियोजना Baden-Wuerttemberg, जर्मनी में यूरोपीय सामाजिक फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
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