Summary
I denne video artiklen beskriver vi in vitro syntese af modificerede mRNA for induktion af proteinekspression i cellerne.
Abstract
Den exogene levering af kodning syntetisk messenger RNA (mRNA) for induktion af proteinsyntese i ønskede celler har et enormt potentiale inden for regenerativ medicin, grundlæggende cellebiologi, behandling af sygdomme og omprogrammering af celler. Her beskriver vi en trinvis protokol for generering af modificeret mRNA med nedsat immun aktivering potentiale og øget stabilitet, kvalitetskontrol af produceret mRNA, transfektion af celler med mRNA og verifikation af den inducerede protein-ekspression ved flowcytometri. Op til 3 dage efter en enkelt transfektion med eGFP mRNA, de transficerede HEK293-celler producerer eGFP. I denne video artiklen, er syntesen af eGFP mRNA beskrevet som et eksempel. Imidlertid kan fremgangsmåden anvendes til fremstilling af andre ønskede mRNA. Anvendelse af det syntetiske modificerede mRNA kan celler induceres til transient at udtrykke de ønskede proteiner, som de normalt ikke ville udtrykke.
Introduction
I celler, transkriptionen af messenger-RNA (mRNA) og følgende translation af mRNA til ønskede proteiner sikre en korrekt funktion af celler. Arvelige eller erhvervede genetiske sygdomme kan føre til utilstrækkelig og dysfunktionelle syntese af proteiner og forårsage alvorlige sygdomme. Således er en ny terapeutisk fremgangsmåde til at inducere produktion af manglende eller defekte proteiner er det exogene levering af syntetisk modificeret mRNA i celler, som koder for det ønskede protein. Derved celler udløst at syntetisere funktionelle proteiner, som de normalt ikke kan producere eller ville naturligvis ikke brug for. Med denne fremgangsmåde kan genetiske sygdomme korrigeres ved indføring af mRNA, der koder for det defekte eller manglende protein 1. MRNA terapi kan også anvendes til vaccination at syntetisere protein-antigener, som udtrykkes af tumorceller eller patogener. Derved kan værtens immunsystem aktiveres til effektivt at fjerne tumorceller eller forhindre infeKTIONER 2,3. Endvidere i de senere år blev mRNA med held anvendt til at generere inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Til dette formål blev fibroblaster transficeret med mRNA'er at inducere ekspressionen af omprogrammering faktorer 4-6 og omsætte dem i iPSCs med et enormt potentiale i regenerativ medicin.
Tidligere var brugen af konventionelle mRNA forbundet med lav stabilitet og stærk immunogenicitet. Således blev kliniske anvendelser af konventionelle mRNA'er begrænset. Men udskiftning af cytidin og uridin med 5-methylcytidin og pseudouridine inden mRNA-molekylet ved Kariko og kolleger gjorde mRNA molekyler stabile i biologiske væsker og dramatisk reduceret immunaktivering 7-10, som nu giver mulighed for den kliniske anvendelighed af modificerede mRNA'er.
Ved hjælp af syntetisk fremstillede modificerede mRNA'er kan ønskede gentranskripter midlertidigt leveres in vivo 11eller in vitro at inducere proteinekspression. Den indførte mRNA translateres under fysiologiske betingelser af den cellulære translation maskineri. På grund af manglende integration i værtscellegenomet i forhold til virale genterapivektorer, er risikoen for onkogenese forhindret 12,13. Således vil behandling med modificeret syntetisk mRNA få bedre klinisk accept i fremtiden.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af modificerede mRNA (figur 1) transfektion af celler med mRNA og evaluering af protein-ekspression i transficerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Augmentation af plasmider indeholdende Nødvendig kodende DNA sekvenser (CDS)
- Pre-varm SOC medium, der er inkluderet i transformation kit, til stuetemperatur, og de LB-agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin til 37 ° C. Ækvilibrere vandbad til 42 ° C.
- Optø et hætteglas af kemisk komponent E. coli på is.
- Tilføj 1-5 pi af plasmidet (10 pg til 100 ng) indeholdende CDS i hætteglasset med kemisk komponent E. coli og blandes forsigtigt. Bland ikke cellerne ved pipettering. Efter tilsætning af plasmider, bland ved at banke røret forsigtigt.
- Inkubere blandingen på is i 30 minutter.
- Heat-chok E. coli i 30 sek ved 42 ° C i et vandbad uden omrystning.
- Placer hætteglasset på is i 2 min.
- Tilsættes 250 pi forvarmet SOC-medium til E. coli og ryste bakterier vandret ved 300 rpm i 1 time ved 37 ° C i en bakteriel inkubator.
- Spred 100 ul og 150 pi fra transformation mix på forvarmet LB agarplader, vendes pladerne og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Efter kolonier bliver synlige, pode en enkelt koloni fra hver plade i en 15 ml kultur rør indeholdende 5 ml LB-medium med 100 ug / ml ampicillin. Inkubere dem natten over ved 37 ° C med omrystning ved 300 rpm, indtil kulturen er i sen log eller stationær fase.
- For langtidsopbevaring af transformerede E. coli, pipette 75 pi 100% glycerol til kryoglas. Tilføj 225 pi af bakteriekulturen (frossen lager vil indeholde 25% glycerol), bland godt og opbevares kryoglas ved -80 ° C.
- Isoler plasmider, der indeholder de nødvendige CDS hjælp af et plasmid oprensning kit i henhold til producentens anvisninger.
- Bestem plasmid koncentration anvendelse af et spektrofotometer.
- Der forberedes delprøver på 20 pi og gemme dem ved -20 ° C i længere tid.
- BEMÆRK: For at opnå DNA-template til in vitro transkription (IVT), CDS af interesse, her eGFP, amplificeres under anvendelse af PCR. Samtidigt, en poly-T-hale 120 thymidiner (T) tilsat til indsatsen ved hjælp af en revers primer med en T 120 forlængelse. Derved de genererede mRNA'er opnå en poly A-hale med en defineret længde efter IVT.
- Forbered PCR-blandingen som beskrevet i tabel 1.
- Blande reaktionsblandingen grundigt. BEMÆRK: PCR-produktet kan anvendes i 4-5 IVT reaktioner. At øge DNA-template beløb for IVT kan totale volumen af PCR-blandingen forøges. Flere PCR-rør kan anvendes hver indeholder PCR-blandingen 100 pi at opnå et tilstrækkeligt udbytte af PCR-produkt.
- Placer PCR-rør i en thermocycler og køre PCR under anvendelse af PCR-cykling protokol (tabel 2).
- Rydde op i PCR reaktion under anvendelse af et PCR-oprensningskit ifølge producentens instruktioner, og eluering af DNA ved anvendelse af 20 pi nuclease-frit vand.
- Måle koncentrationen af DNA'et ved hjælp af et spektrofotometer. BEMÆRK: detekterede DNA-koncentrationen er ca. 300 ug / ml. Således bør det forventede samlede beløb være ~ 6 ug. Mængden af DNA for andre proteiner kan variere afhængigt af længden af CDS, mængden af plasmid brugt til PCR, annealeringstemperatur af primere, og cyklus nummer.
- Frys DNA ved -20 ° C i lang tid, eller anvende det direkte til IVT.
3. Kontrol Trin: Kvaliteten af PCR-produkt
- Kontrollere kvaliteten af PCR-produktet ved hjælp af DNA gelelektroforese.
- Bland den ønskede mængde agarose med 1x TBE i en kolbe. For en 1% agarose gel, tilsættes 0,5 g agarose til 50 ml 1x TBE.
- Mikrobølgeovn indtil agarosen er opløst. Lad det ikke koge. Sørg for, at agarose er helt i opløsning.
- Tilsæt 5 pi nukleinsyre gel pletten til 50 ml agarose gel.
- Hæld gelen i en agarosegel boksen indstille kam, og vent ca. 1 time indtil gelen størkner.
- Tag kammen og placere gelboksen i en gel bakke.
- Bland 2 pi (200 ng) af 80-10,000 bp DNA-stigen og 200 ng af PCR-produktet med hver 2 pi 6x loading buffer i et samlet volumen på 12 pi.
- Indlæse omhyggeligt DNA-prøver i brøndene på agarosegelen.
- Hjælp 1x TBE som løbebuffer køre agarose gel ved 100 V i 1 time.
- Visualiser DNA-båndene på et billeddannende system (figur 2).
4. In vitro transkription (IVT)
- BEMÆRK: Efter PCR, er plasmid indsætter forstærket og der tilsættes en poly T-hale. Under IVT er genetisk information transkriberet fra DNA til RNA. Den genererede mRNA-transkript anvendes til fremstilling af proteiner i celler.
- Rengør arbejdsområdet og pipetter med en RNase decontamination opløsning. Brug PCR rent og sterilt dual-filter pipettespidser og ofte skifter handsker for at minimere forurening af reaktion blander sig med RNaser.
- Forbered NTP / cap analog blanding som beskrevet i tabel 3.
- Bland NTP / cap analog blanding grundigt ved hvirvelblanding og centrifuger kortvarigt.
- Saml IVT reaktionsblandingen som beskrevet i tabel 4.
- Bland IVT reaktionsblandingen grundigt ved forsigtigt at pipettere op og ned. Derefter centrifugeres PCR-rør kort for at samle blandingen i bunden af røret.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 3 timer i en termomikser.
BEMÆRK: Den optimale inkubationstid afhænger af længden af de skær og transkriptionel effektivitet given skabelon. For korte indsatser (<500 nt) kan en længere inkubationstid være fordelagtig. En tidsforløbet eksperiment kan gøres for at bestemme den optimale inkubationstid for maksimalt udbytte. Derfor er nedsat IVT reaktioner, for example, 1, 2, 3, 4, 6 timer, og inkubation natten over og bestemme mRNA beløb. Kinetikken af in vitro transkription til generering af eGFP mRNA er vist i figur 3. - For at fjerne template-DNA'et tilsættes 1 ul DNase (2 U / ul) til IVT reaktionsblandingen, bland godt og inkuberes 15 minutter ved 37 ° C.
- Renses reaktionsblandingen ved anvendelse af en RNA-oprensningskit ifølge Producentens anvisninger. Eluere det modificerede mRNA fra søjlen membran centrifugering to gange med 40 pi nuclease-frit vand. BEMÆRK: detekteret RNA-koncentrationen er ca. 1.500 pg / ml. Således bør det forventede samlede beløb være ~ 120 ug. Mængden af syntetiseret mRNA for andre proteiner kan variere afhængigt af længden af CDS og mængden af PCR-produkt, der anvendes til IVT.
5. Behandling af renset mRNA med Antarktis phosphatase
- BEMÆRK: Den genererede mRNA behandles med phosphatase for at fjerne 5'-trifosfater, som kan genkendes af RIG-I og fører til immun aktivering. Desuden phosphatase behandling forebygger re-cirkularisering i en selvstændig ligeringsreaktion.
- Tilføj 9 pi 10x phosphatase reaktionspuffer Antarktis til 79 pi oprenset mRNA opløsning. Efterfølgende tilsættes 2 pi Antarktis phosphatase (5 U / pl) og bland forsigtigt prøven. Inkubere reaktionsblandingen ved 37 ° C i 30 min.
- Renses reaktionsblandingen ved anvendelse af en RNA-oprensningskit ifølge Producentens anvisninger. Eluere det modificerede mRNA fra søjlen membran centrifugering to gange med 50 pi nuclease-frit vand.
- Måle koncentrationen af de modificerede mRNA ved hjælp af et spektrofotometer. Kontrollere, at forholdet mellem absorbansen ved 260 nm / 280 nm (A260 / 280) er ≥ 1,8, og forholdet A260 / 230 er 2,0, hvilket indikerer renhed.
BEMÆRK: Det forventede totale udbytte skal være ca. 90 ug, hvilket er sufficient for ca. 36 mRNA transfektioner. - Indstille koncentrationen af mRNA til 100 ng / ul ved tilsætning af nuclease-frit vand.
- Alikvot det modificerede mRNA i engangskuvetter portioner kræves for transfektioner og opbevares ved -80 ° C. Undgå flere fryse og tø-cykler. Ordentligt forberedt og opbevaret mRNA er stabilt i mange år. Under arbejde, altid holde det modificerede mRNA på is.
6. Kontrol Trin: Kvaliteten af Syntetiseret Modified mRNA
- Kontrollere kvaliteten af modificerede mRNA med RNA-gelelektroforese.
- Bland den ønskede mængde agarose med 1x TBE i en kolbe. For en 1% agarose gel, tilsættes 0,5 g agarose til 50 ml 1x TBE.
- Mikrobølgeovn indtil agarosen er opløst. Lad det ikke koge. Sørg for, at agarose er helt i opløsning.
- Tilsæt 5 pi nukleinsyre gel pletten til 50 ml agarose gel.
- Hæld gelen i en agarosegel boksen indstille kam, og vent ca. 1 time indtil gelen er solidified.
- Tag kammen og placere gelboksen i en gel bakke.
- Bland 3 pi (3 ug) på 0,5-10 kb RNA Ladder og 200 ng syntetiseret modificerede mRNA hver med 7 pi loading buffer i et samlet volumen på 10 pi. Sammensætningen af loadingpufferen er beskrevet i tabel 5.
- Denaturere stigen og de mRNA-prøver ved 70 ° C i 10 min.
- Omhyggeligt indlæse stigen og de mRNA-prøver på 1% agarose gel.
- Udføre elektroforese ved 100 V i 1 time ved hjælp af 1x TBE som løbebuffer.
- Visualisere stigen og mRNA-bånd på en UV-transilluminator og fotografi anvendelse af en gel dokumentation (figur 4).
7. Forberedelse af celler til Transfection
- Plade 2 x10 5-celler (HEK293 celler) per brønd af 12-brønds plade.
- Inkubere cellerne natten over ved 37 ° C i en celleinkubator. BEMÆRK: På dagen for transfektion, skal cellerne har reakhed 80-90% konfluens.
8. Udførelse af mRNA Transfektion af celler
- Optø den modificerede mRNA.
- Generere lipoplekser til transfektion.
- 25 pi (2,5 ug) modificeret mRNA og 2 pi af kationisk lipid transfektionsreagens til 473 pi Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I reduceret serummedium at generere transfektionsblandingen til transfektion af en brønd i en plade med 12 brønde. Opskalere mængder i forhold til antallet af brønde, der skal transficeres. Som negativ kontrol forberede en transfektion blanding uden mRNA.
- Bland komponenterne forsigtigt ved pipettering. Inkubér transfektion blandingen ved stuetemperatur i 20 min for at generere lipoplekser til transfektion.
BEMÆRK: transfektion blanding indeholder ingen antibiotika. Således sørge for at sikre sterilitet, mens håndtering celler. - Vask cellerne med 500 pi DPBS / brønd.
- Tilføj 500 pi transfektion blandingen til en brønd af en 12-brønds plate.
- Inkubér cellerne i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Sug transfektion blandingen og tilsæt 1 ml komplet celledyrkningsmedium til cellerne.
- Inkubér cellerne i 24 timer i cellen inkubator.
- Udføre fluorescens mikroskopiske analyser under anvendelse af et fluorescens mikroskop (figur 5). BEMÆRK: For at undersøge ekspressionen af andre proteiner i celler, der er fremstillet ved transfektion med andre mRNA end eGFP-kodende mRNA kan cellerne dyrkes på dækglas. Derefter transfektionen kan udføres, og cellerne kan farves med egnede antistoffer og analyseres ved fluorescensmikroskopi.
9. Flow-cytometriske analyser af eGFP Ekspression i celler
- Fjern celledyrkningsmediet fra brøndene og vask hver brønd med 1 ml DPBS (uden calcium og magnesium). Tilføj 500 pi trypsin / EDTA per brønd til at frigøre cellerne fra overfladen af cellekulturplader. Efterfølgende tilsættes 500pi TNS per brønd for at inaktivere trypsin.
- Centrifuger de løsnede celler i 5 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur. Fjern supernatanten efterlader kun pelleten. Resuspender cellepelleten i 150 pi cellefiksering opløsning og overføre cellesuspensionen i en flowcytometri rør.
- Analysere den procentdel af eGFP udtrykkende celler og fluorescensintensitet hjælp Geo Mean (geometrisk middelværdi af fluorescens intensitet) (figur 6).
10. Måling af Protein Expression Over Time
- Udfør mRNA transfektion af celler i 3 brønde i en plade med 12 brønde som beskrevet i trin 8. Derudover inkuberes 3 brønde i HEK293-celler med transfektion blanding uden tilsætning af mRNA.
- Måle ekspression af eGFP 1, 2 og 3 dage efter transfektion at vurdere varigheden af protein-ekspression (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en pcDNA 3.3 plasmid indeholdende CDS af eGFP, blev syntesen af modificeret eGFP mRNA etableret (figur 1). Efter insert amplifikation ved PCR og poly-T-hale, er et klart bånd med en længde på ca. 1.100 bp påvist (figur 2). Forøgelse af IVT tid forøgede udbyttet af mRNA (figur 3). Efter IVT blev en klar mRNA bånd med en længde på ca. 1.100 bp påvises, hvilket svarer til længden af eGFP mRNA skal fremstilles (figur 4).
Funktionaliteten af den genererede eGFP mRNA blev testet ved transfektion af HEK293-celler. Til dette formål blev transfektionskomplekser (lipoplekser) genereres ved hjælp af et kationisk lipid transfektionsreagens. Transfektionen blev udført med 2 x 10 5 celler pr brønd i 12-brønds plade. Produktionen af eGFP i cellerne blev påvist 24 timer efter transfektion under anvendelse af fluorescensmikroskopi (Figure 5) og flowcytometri (figur 6).
HEK293-celler blev transficeret med eGFP mRNA. eGFP ekspression blev bestemt 1, 2 og 3 dage efter transfektion at vurdere varigheden af proteinekspression i cellerne (figur 7). Efter 24 timer protein ekspression var højest i cellerne. Beløbet blev reduceret 1,6 gange hver næste dag. Selv efter 3 dage, indeholdt cellerne eGFP.
Figur 1:. Oversigt over det modificerede mRNA fremstillingsprocessen kodende DNA-sekvenser (CDS) med kendte flankerende sekvenser amplificeret ved PCR under anvendelse af specifikke primere. PCR-produktet oprenses og kvaliteten af det genererede DNA bestemmes. MRNA dannes ud fra DNA-produkt under anvendelse af in vitro-transskription proces. Produktet er purifie d og behandlet med phosphatase for at fjerne 5'-triphosphater. Efter yderligere oprensning og kvalitetskontrol af genereret mRNA, kan mRNA transfektioner udføres.
Figur 2:. Analyse af DNA-produkt efter PCR DNA stigen og PCR-produkt blev kørt på en 1% agarose gel. En klar DNA-bånd med en længde på ca. 1.100 bp bør detekteres.
Figur 3:. Kinetik af in vitro transkription til generering af eGFP mRNA 1) RNA stigen og IVT produkter efter 2) 0 min, 3) 10 min, 4) 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min, og 7) DNA-template alene blev kørt på en 1% agarose gel.
Figur 4:. Analyse af mRNA produktet efter IVT-RNA-stigen og IVT produkt blev kørt på en 1% agarose gel. En klar mRNA bånd med en længde på ca. 1.100 bp bør detekteres.
Figur 5: Fluorescens mikroskopiske analyser af HEK293-celler 24 timer efter eGFP mRNA transfektion. (A) fase kontrast billede af cellerne ved en forstørrelse på 100X. (B) Fluorescens-billeder af cellerne ved en forstørrelse på 100X.
Figur6: Flow-cytometrisk analyse af eGFP ekspression i HEK293-celler 24 timer efter transfektion eGFP mRNA Den lyserøde linie repræsenterer celler uden mRNA transfektion og den blå linie repræsenterer eGFP positive celler efter eGFP mRNA transfektion.. Efter eGFP mRNA transfektion, 93,91% af alle målte celler er positive, og Geo gennemsnit (geometrisk middelværdi af fluorescens intensitet) er 720,16.
Figur 7: Flow-cytometrisk analyse af eGFP ekspression i HEK293-celler 1, 2 og 3 dage efter eGFP mRNA transfektion Proteinekspressionen er højest 24 timer efter transfektion mRNA.. Derefter reduceres beløbet 1,6 gange dagligt (n = 3).
Tabel 1: Sammensætning af PCR-blanding.
| Component | Slutkoncentration | Mængde (pi) |
| Forward Primer | 0,7 uM | 7 |
| Reverse Primer | 0,7 uM | 7 |
| 5x Q-Solution | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity PCR-buffer | 1x | 20 |
| Plasmid-DNA | 50 ng / 100 pi | Variabel |
| HotStar HiFidelity DNA Polymerase (2.5 U / pl) | 2,5 U | 1 |
| Nuclease-frit vand | Variabel | |
| Totalvolumen | 100 |
Tabel 1: Sammensætning af PCR-blanding.
| Cycle Number | Tid | (° C) | |
| Indledende denatureringstrin | 1 | 5 min | 95 |
| 3-trins cykling | 2-25 | ||
| · Denaturering | 45 sek | 95 | |
| · Annealing | 1 min | 55 | |
| · Udvidelse | 1 min | 72 | |
| Endelig udvidelse trin | 26 | 10 min | 72 |
| End of PCR cykling | Ubestemt | 4 |
Tabel 2: PCR cykling protocol.
| Component | Stock koncentration (mM) | Endelig koncentration (mM) | Volume (ul) |
| ATP (fra MEGAscript T7 Kit) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (fra MEGAscript T7 Kit) | 75 | 1.875 | 1 |
| Me-CTP (fra Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| Pseudo-UTP (fra Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-Me-m 7 G (5') ppp (5') G RNA cap struktur analog | 10 | 2.5 | 10 |
| Totalvolumen | 23 |
Tabel 3: Sammensætning af NTP / kasket analog blanding.
| Component | Slutkoncentration | Mængde (pi) |
| Nuclease-frit vand | Variabel | |
| RNase Inhibitor | 40 U | 1 |
| NTP / cap analog blanding (fra trin 4.3) | 23 | |
| PCR-produkt | 1 ug | Variabel |
| 10x reaktionsbuffer | 1x | 4 |
| 10x T7 RNA polymerase enzymblanding | 1x | 4 |
| Totalvolumen | 40 |
Tabel 4: Sammensætning af in vitro transkription (IVT) reaktionsblandingen.
| Component | Mængde (pi) |
| Formamide | 3.3 |
| 37% formaldehyd | 1 |
| MEN buffer (10x) | 1 |
| 6x loading buffer (leveres med peqGOLD Range Mix DNA-Ladder) | 1.7 |
| Totalvolumen | 7 |
Tabel 5: Fremstilling af loading buffer til RNA-gelelektroforese.
| Cellekulturmedium og Buffer | |
| HEK-293 cellekulturmedium | Tilsæt 25 ml FCS, 2,5 ml penicillin / streptomycin, 2,5 ml L-glutamine i 220 ml DMEM høj glucose. Opbevar ved 4 ° C og bruge det inden for 2 uger. |
| TBE-puffer (10x) | Opløs 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre og 20 mM EDTA i 1 L vand (Ampuwa). PH i bufferen er 8. |
| MEN buffer (10x) | Opløs 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA i 1 liter vand (Ampuwa). Juster pH-værdien med NaOH til 7. |
Tabel 6: Cell dyrkningsmedium og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MRNA terapi har et enormt potentiale inden for regenerativ medicin, behandling af sygdomme og vaccination. I denne video viser vi, fremstilling af en stabiliseret, modificeret mRNA for induktion af proteinekspression i cellerne. Anvendelse af denne protokol, kan andre ønskede mRNA genereres. In vitro syntese af modificerede mRNA giver transfektion af celler med ønskede mRNA'er at inducere ekspression af målproteiner. Derved er det ønskede protein udtrykkes forbigående under fysiologiske betingelser, indtil det eksogent leveret mRNA nedbrydes fuldstændigt.
I denne video blev ekspressionen af eGFP påvist i 3 dage efter en enkelt transfektion af HEK293-celler med eGFP mRNA. mRNA-molekyler, der koder andre proteiner kan føre til en kortere proteinekspression periode. Ekspressionen af proteinet falder som følge af nedbrydning af eksogent leveret mRNA. Derfor, begrænsning af denne teknik for whiche applikationer kan være forbigående induktion af proteinekspression. Således, for at opretholde protein ekspression i celler i en længere periode, gentages levering af mRNA påkrævet. Selvom mRNA transfektion har den fordel for ikke-integration i værtsgenomet, hvilket forhindrer insertionsmutagenese og udvikling af cancer og leukæmi i forhold til virale vektorer, kan in vivo transfektionseffektivitet være mindre end ved anvendelse af virale vektorer.
Den krævede mRNA koncentrationen og mængden af transfektionsreagens bør optimeres for hver enkelt celle 14, som er målcellerne for exogent levering af mRNA til fremstilling af den manglende protein.
Gentagen frysning og optøning af mRNA bør undgås for at opretholde stabiliteten af den producerede mRNA. Derfor kan arbejdsvilkår portioner være forberedt. Efter PCR og IVT, bør kun et enkelt specifikt bånd blive opdaget. Ellers antallet af PCR-cyklusser, primer anneaLing temperatur og / eller mængden af plasmid-DNA bør optimeres til opnåelse af den specifikke DNA-produkt for IVT. Endvidere kan IVT tid og mængden af DNA-skabelon for IVT optimeres til opnåelse af mRNA fra en bestemt længde i tilstrækkelige mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af Den Europæiske Socialfond i Baden-Wuerttemberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
