Summary
Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células.
Abstract
O fornecimento exógeno de codificação de RNA mensageiro sintético (ARNm) para a indução da síntese de proteínas nas células desejadas tem um potencial enorme nos domínios da medicina regenerativa, biologia celular básico, tratamento de doenças, e reprogramação das células. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de ARNm modificado com reduzido potencial imunológico activação e aumento da estabilidade, controlo de qualidade de ARNm produzido, a transfecção de células com o mRNA e verificação da expressão da proteína induzida por citometria de fluxo. Até 3 dias após a transfecção com um único mRNA eGFP, as células HEK293 transfectadas produzir eGFP. Neste artigo de vídeo, a síntese de mRNA eGFP é descrito como um exemplo. No entanto, o procedimento pode ser aplicado para a produção de outros ARNm desejados. Usando o mRNA sintético modificado, as células podem ser induzidas a expressar transitoriamente as proteínas desejadas, que normalmente não expressam.
Introduction
Nas células, a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) e a tradução na sequência de ARNm em proteínas desejadas garantir o bom funcionamento das células. Doenças genéticas, hereditárias ou adquiridas pode levar à síntese de proteínas insuficiente e ineficiente e causar doenças graves. Assim, uma nova abordagem terapêutica para induzir a produção de proteínas defeituosas ou em falta é o fornecimento exógeno de ARNm sintético modificado em células, que codifica para a proteína desejada. Desse modo, as células são acionados para sintetizar proteínas funcionais, que normalmente não podem produzir ou, naturalmente, não precisa. Usando esta abordagem, as doenças genéticas pode ser corrigido por introdução do ARNm que codifica para a proteína defeituosa ou falta 1. A terapia de mRNA também pode ser utilizada para a vacinação de sintetizar proteínas, antigénios que são expressos pelas células tumorais ou agentes patogénicos. Deste modo, o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para eliminar de forma eficaz as células tumorais ou prevenir infeficções 2,3. Além disso, nos últimos anos, o ARNm foi utilizado com sucesso para gerar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). Para este efeito, os fibroblastos foram transfectadas com os mRNAs para induzir a expressão de factores de reprogramação 4-6 e de convertê-los em iPSCs com um enorme potencial em medicina regenerativa.
Anteriormente, o uso de ARNm convencional estava associada com a baixa estabilidade e forte imunogenicidade. Assim, aplicações clínicas de mRNAs convencionais foram limitados. No entanto, a substituição de citidina e uridina por 5-metilcitidina e pseudouridina dentro da molécula de ARNm por Kariko e colegas rendeu moléculas de mRNA estáveis em fluidos biológicos e reduziu dramaticamente a activação imunitária 7-10, que agora permite que a aplicabilidade clínica de mRNAs modificados.
Utilizando mRNAs modificados produzidos sinteticamente, transcritos de genes desejados podem ser temporariamente entregues in vivo 11ou in vitro para induzir a expressão da proteína. O mRNA é traduzido introduzido sob condições fisiológicas pela máquina de tradução celular. Devido à falta de integração no genoma da célula hospedeira em comparação com vectores de terapia de genes virais, o risco de oncogénese é impedido 12,13. Assim, a terapia usando mRNA sintético modificado vai ficar melhor aceitação clínica no futuro.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a produção de ARNm modificado (Figura 1), a transfecção de células com o ARNm e a avaliação da expressão da proteína em células transfectadas.
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Protocol
1. Aumento de plasmídeos contendo Obrigatório Codificação de DNA seqüências (CDS)
- Meio de pré-SOC morno, que está incluída no kit de transformação, para a temperatura ambiente e as placas de agar LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar o banho de água a 42 ° C.
- Descongelar um frasco de química componente E. coli em gelo.
- Adicionar 1-5 ul do plasmídeo (10 pg a 100 ng) contendo os CDS para dentro do frasco de componente quimicamente E. coli e misture delicadamente. Não misture as células por pipetagem. Após a adição de plasmídeos, misture tocando suavemente o tubo.
- Incubar a mistura em gelo durante 30 min.
- Heat-choque do E. coli durante 30 segundos a 42 ° C num banho de água sem agitação.
- Colocar o frasco em gelo durante 2 min.
- Adicionar 250 ul de meio SOC pré-aquecido para a E. coli e agitar as bactérias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C num incubador bacteriano.
- Espalhe 100 ul e 150 ul da mistura de transformação em placas de agar de LB pré-aquecido, inverter as placas e incubar durante a noite a 37 ° C.
- Depois de colónias tornam-se visíveis, inocular uma única colónia de cada placa num tubo de cultura de 15 ml contendo 5 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Incubar-los durante a noite a 37 ° C com agitação a 300 rpm até a cultura está em log tardia ou fase estacionária.
- Para armazenamento a longo prazo de transformada E. coli, pipeta 75 ul de glicerol a 100% para o frasco de congelação. Adicionar 225 ul da cultura bacteriana (estoque congelada conterá 25% de glicerol), misturar bem e armazenar o frasco de congelação a -80 ° C.
- Isolar os plasmídeos que contêm os CDS necessários usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante.
- Determinar a concentração de plasmídeo utilizando um espectrofotómetro.
- Preparar alíquotas de 20 ul e armazená-las a -20 ° C durante um tempo prolongado.
- NOTA: Para obter o DNA molde para a transcrição in vitro (IVT), CDS de interesse, aqui eGFP, é amplificado utilizando PCR. Simultaneamente, um poli-T-cauda de 120 timidinas (T) é adicionada à pastilha utilizando um iniciador reverso com uma extensão de 120 t. Deste modo, os mRNAs gerados obter um poli A-cauda com um comprimento definido, após o IVT.
- Prepare a mistura de PCR conforme detalhado na Tabela 1.
- Misture a mistura de reacção completamente. NOTA: o produto de PCR pode ser usado em reacções 4-5 IVT. Para aumentar a quantidade de ADN molde para IVT, o volume total da mistura de PCR pode ser aumentada. Vários tubos de PCR de 100 ul de cada mistura de PCR contendo pode ser utilizado para obter um rendimento suficiente de produto de PCR.
- Inserir os tubos de PCR num termociclador e executar a PCR utilizando o protocolo de PCR de ciclismo (Tabela 2).
- Limpe o PCR reacção utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e eluir o ADN, utilizando 20 ul de água livre de nuclease.
- Medir a concentração do ADN, utilizando um espectrofotómetro. NOTA: A concentração de DNA detectado é de aproximadamente 300 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 6 mg. A quantidade de ADN para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento da CDS, quantidade de plasmídeo utilizado para a PCR, a temperatura de emparelhamento de iniciadores, e o número do ciclo.
- Congelar o ADN a -20 ° C, durante um longo período de tempo ou usá-lo directamente para IVT.
Passo 3. Controlo: Qualidade do Produto PCR
- Para verificar a qualidade do produto de PCR por electroforese em gel de ADN.
- Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE.
- Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução.
- Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose.
- Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel solidificado.
- Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel.
- Misture 2 ul (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN-Escada e 200 ng de produto de PCR, cada uma com 2 ul de tampão de carregamento 6x num volume total de 12 ul.
- Encher cuidadosamente amostras de ADN nos poços do gel de agarose.
- Usando 1 x TBE como tampão de corrida, correr o gel de agarose a 100 V durante 1 h.
- Visualizar as bandas de ADN em um sistema de imagem (Figura 2).
4. transcrição in vitro (IVT)
- NOTA: Após a PCR, os insertos de plasmídeo são amplificados e uma cauda poli-T é adicionado. Durante o IVT, a informação genética é transcrito a partir do DNA para o RNA. A transcrição do mRNA gerado é usado para produzir proteínas em células.
- Limpe a área de trabalho e pipetas com uma RNase dsolução econtamination. Use PCR pontas de pipeta dual-filtro limpo e esterilizado e mudam frequentemente de luvas para minimizar a contaminação da reação mistura com RNases.
- Prepare a mistura analógica NTP / cap, conforme descrito na Tabela 3.
- Misture a mistura analógica NTP / cap completamente em vórtice e mexer um pouco.
- Montar a mistura de reacção IVT como descrito na Tabela 4.
- Misture a mistura de reação IVT com cuidado pipetando cima e para baixo. Em seguida centrifugar o tubo de PCR rapidamente para recolher a mistura na parte inferior do tubo.
- Incubar a 37 ° C durante 3 horas num termomisturador.
NOTA: O tempo de incubação óptimo depende do comprimento das inserções e a eficiência transcricional de determinado modelo. Para inserções curtas (<500 nt), um tempo de incubação mais longo pode ser vantajoso. Uma experiência ao longo do tempo pode ser realizado para determinar o tempo de incubação óptimo para um rendimento máximo. Por isso, criou reações FPI, para example, durante 1, 2, 3, 4, 6 hr, e a incubação durante a noite e determinar a quantidade de ARNm. A cinética da transcrição in vitro para a geração de mRNA eGFP é mostrado na Figura 3. - Para remover o DNA molde, adicionar 1 ul de ADNase (2 U / ul) à mistura de reacção IVT, misturar bem e incubar 15 min a 37 ° C.
- Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o mRNA modificado a partir da membrana coluna de rotação duas vezes com 40 mL de água livre de nuclease. NOTA: A concentração de ARN detectado é cerca de 1,500 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 120 mg. A quantidade de mRNA sintetizados para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento de CDS e a quantidade de produto de PCR utilizado para IVT.
5. Tratamento de mRNA purificado com Antártica Phosphatase
- NOTA: O mRNA gerado é tratado com fosfatase para remover 5 tri 'fosfatos, que podem ser reconhecidos por RIG-I e levam à activação imunitária. Além disso, o tratamento com fosfatase evita a re-circularização numa reacção de auto-ligação.
- Adicionar 9 mL de tampão de reação 10x fosfatase Antártida a 79 ml de solução de mRNA purificado. Posteriormente, adicionar 2 mL de fosfatase Antártica (5 U / mL) e misture delicadamente a amostra. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 30 min.
- Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o ARNm modificado a partir da membrana coluna de centrifugação duas vezes com 50 mL de água livre de nuclease.
- Medir a concentração dos ARNm modificados utilizando um espectrofotómetro. Verificar que a razão de absorvância a 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) é ≥ 1,8 e a proporção de A 260 / A 230 é de 2,0, o que indica pureza.
NOTA: O rendimento total esperado deve ser aproximadamente de 90 ug, que é sufficient por aproximadamente 36 transfections mRNA. - Ajustar a concentração de mRNA de 100 ng / mL por adição de água livre de nuclease.
- Alíquota o ARNm modificado em alíquotas de uso único necessários para transfecções e armazenar a -80 ° C. Evite múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Devidamente preparado e armazenado ARNm é estável durante muitos anos. Durante o trabalho, mantenha sempre o mRNA modificado no gelo.
6. Controle de Passo: Qualidade de mRNA Modificado Sintetizado
- Verificar a qualidade de ARNm modificado por electroforese em gel de ARN.
- Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE.
- Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução.
- Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose.
- Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel é solidified.
- Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel.
- Misturar 3 ul (3 ug) de 0,5-10 kb ARN Escada e 200 ng de cada mRNA sintetizados modificado com tampão de carga 7 ul num volume total de 10 ul. A composição do tampão de carga é descrita na Tabela 5.
- Desnaturar a escada e as amostras de ARNm, a 70 ° C durante 10 min.
- Carregar cuidadosamente a escada e as amostras de ARNm sobre o gel de agarose a 1%.
- Efectuar a electroforese a 100 V durante 1 h utilizando 1 x TBE como tampão de corrida.
- Visualizar a escada e bandas de ARNm num transiluminador de UV e uma fotografia utilizando um sistema de documentação de gel (Figura 4).
7. Preparação de células para transfecção
- Placa 2 x 10 5 células (células HEK293) por poço da placa de 12 poços.
- Incubar as células durante a noite a 37 ° C num incubador celular. NOTA: No dia da transfecção, as células devem ter reacele tinha 80-90% de confluência.
8. Realizar mRNA transfecção de células
- Descongelar o ARNm modificado.
- Gerar os lipoplexos para transfecção.
- Adicionar 25 ul (2,5 ug) de ARNm modificado e 2 ul de reagente de transfecção de lípido catiónico para 473 ul de Opti-MEM (Meio Essencial Mínimo) I de meio de soro reduzido para gerar a mistura de transfecção para a transfecção de um poço de uma placa de 12 poços. Dimensionar-se os volumes de acordo com o número de poços a serem transfectadas. Como controle negativo, prepare uma mistura de transfecção sem mRNA.
- Misturar os componentes com cuidado por pipetagem. Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 20 min para gerar lipoplexos para transfecção.
NOTA: A mistura de transfecção não contém antibióticos. Assim, tome cuidado para garantir a esterilidade durante o manuseio de células. - Lavar as células com DPBS 500 ul / poço.
- Adicionar 500 ul mistura de transfecção para um poço de uma pla de 12 poçoste.
- Incubar as células durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Aspirar a mistura de transfecção e juntar 1 mL de meio de cultura de células completa para as células.
- Incubar as células durante 24 horas na incubadora celular.
- Realizar fluorescência microscópica análises utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 5). NOTA: Para analisar a expressão de outras proteínas nas células, as quais são produzidas através de transfecção com o outro do que o ARNm de codificação de mRNA eGFP, as células podem ser cultivadas em lamelas. Em seguida, a transfecção pode ser realizada e as células podem ser coradas com anticorpos apropriados e analisadas por microscopia de fluorescência.
9. A análise de citometria de fluxo de eGFP Expressão em Células
- Remover o meio de cultura de células a partir dos poços e lavar cada poço 1 ml com DPBS (sem cálcio e magnésio). Adicionar 500 ul de tripsina / EDTA por cavidade para destacar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500TNS ul por cavidade para inactivar a tripsina.
- Centrifugar as células destacadas durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante, deixando apenas o sedimento. Ressuspender o sedimento celular em 150 ul solução de fixação de células e transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo.
- Analisar a percentagem de células que expressam eGFP e da intensidade de fluorescência utilizando Geo média (média geométrica da intensidade de fluorescência) (Figura 6).
10. A medição da expressão da proteína ao longo do tempo
- Realizar ARNm de transfecção de células em três poços de uma placa de 12 poços tal como descrito no passo 8. Para além disso, incubar três poços de células HEK293 com a mistura de transfecção sem a adição de ARNm.
- Medir a expressão de eGFP 1, 2, e 3 dias após a transfecção para avaliar a duração da expressão da proteína (Figura 7).
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Representative Results
Usando um plasmídeo pcDNA 3.3 contendo CDS da eGFP, a síntese de mRNA eGFP foi estabelecida modificada (Figura 1). Após a amplificação por PCR de inserção e poli-T-cauda, uma banda clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb é detectado (Figura 2). Aumentando o tempo de FPI aumentou o rendimento de ARNm (Figura 3). Após o IVT, uma banda de ARNm clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb foi detectado, o que corresponde ao comprimento do mRNA eGFP a ser produzido (Figura 4).
A funcionalidade do mRNA eGFP gerado foi testada por transfecção de células HEK293. Para este efeito, os complexos de transfecção (lipoplexos) foram geradas usando um reagente de transfecção de lípido catiónico. A transfecção foi realizada com 2 x 10 5 células por poço da placa de 12 poços. A produção de eGFP nas células foi detectada 24 horas após a transfecção usando microscopia de fluorescência (Figure 5) e citometria de fluxo (Figura 6).
As células HEK293 foram transfectadas com eGFP ARNm. expressão eGFP foi determinada 1, 2 e 3 dias após a transfecção para avaliar a duração da expressão da proteína nas células (Figura 7). Após 24 horas, a expressão da proteína foi maior nas células. A quantidade foi reduzida de 1,6 vezes a cada dia seguinte. Mesmo depois de 3 dias, as células contidas eGFP.
Figura 1:. Visão geral do processo de produção de ARNm modificado de Codificação sequências de ADN (CDS) com sequências de flanqueamento conhecidas são amplificadas por PCR utilizando iniciadores específicos. O produto de PCR é purificado e a qualidade do ADN gerado é determinado. O mRNA é gerado a partir do produto de ADN, utilizando o processo de transcrição in vitro. O produto é purifie d e tratado com fosfatase para remover 5'-trifosfatos. Após a purificação adicional e controlo de qualidade do mRNA gerado, as transfecções de mRNA pode ser realizada.
Figura 2:. Análise do produto de ADN de PCR depois de escada de ADN e produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 1%. A banda de DNA clara, com um comprimento de aproximadamente 1.100 pb devem ser detectados.
Figura 3:. Cinética de transcrição in vitro para a produção de mRNA eGFP 1) escada de ARN IVT e produtos após 2 0 min), 3) 10 min, 4) 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min, e 7) molde de ADN isolado foram corridas num gel de agarose a 1%.
Figura 4:. Análise do produto de ARNm após IVT IVT escada de RNA e produto foram corridos num gel de agarose a 1%. A banda mRNA claro com um comprimento de aproximadamente 1.100 pb devem ser detectados.
Figura 5: análises microscópicas de fluorescência de células HEK293 24 horas após a transfecção eGFP mRNA. De imagem (A) Fase contraste das células com uma ampliação de 100X. (B) As imagens de fluorescência das células a uma ampliação de 100X.
FiguraAnálises por citometria de fluxo da expressão de GFP em células HEK293 24 horas após a transfecção eGFP mRNA A linha rosa representa células sem transfecção mRNA ea linha azul representa células positivas eGFP após transfecção eGFP mRNA: 6.. Após transfecção de mRNA eGFP, 93,91% de todas as células são medidos positivo e o Geo média (média geométrica da intensidade de fluorescência) é 720,16.
Figura 7: A análise por citometria de fluxo de expressão em células HEK293 eGFP 1, 2, e 3 dias após a transfecção eGFP ARNm A expressão da proteína é maior de 24 h após a transfecção ARNm.. Depois disso, a quantidade é reduzida em 1,6 vezes todos os dias (n = 3).
Tabela 1: Composição de mistura de PCR.
| Componente | A concentração final | Montante (ul) |
| Atacante Primer | 0,7 fiM | 7 |
| Primer Reverso | 0,7 fiM | 7 |
| 5x Q-Solution | 1x | 20 |
| 5x Tampão de PCR HotStar HiFidelity | 1x | 20 |
| O DNA de plasmídeo | 50 ng / 100 ul | Variável |
| HiFidelity HotStar ADN polimerase (2,5 U / ul) | 2,5 U | 1 |
| Água livre de nuclease | Variável | |
| O volume total | 100 |
Tabela 1: Composição de mistura de PCR.
| Número Ciclo | Tempo | Temperatura (° C) | |
| Passo de desnaturação inicial | 1 | 5 min | 95 |
| 3-passo ciclismo | 25/2 | ||
| · A desnaturação | 45 seg | 95 | |
| · Annealing | 1 min | 55 | |
| · Extensão | 1 min | 72 | |
| Passo final de extensão | 26 | 10 min | 72 |
| Fim de PCR ciclismo | Indeterminado | 4 |
Tabela 2: ciclos de PCR protocol.
| Componente | Da concentração (mM) | A concentração final (mM) | Volume (uL) |
| ATP (a partir de MEGAscript Kit T7) | 75 | 7,5 | 4 |
| GTP (a partir de MEGAscript Kit T7) | 75 | 1.875 | 1 |
| Me-CTP (de TriLink) | 100 | 7,5 | 3 |
| Pseudo-UTP (a partir de TriLink) | 100 | 7,5 | 3 |
| 3'-O-Me-m 7 G (5') ppp (5 ') G RNA estrutura cap analógico | 10 | 2.5 | 10 |
| O volume total | 23 |
Tabela 3: Composição do NTP / cap mistura analógica.
| Componente | A concentração final | Montante (ul) |
| Água livre de nuclease | Variável | |
| RNase Inibidor | 40 U | 1 |
| NTP / cap mistura analógica (a partir do passo 4.3) | 23 | |
| Produto de PCR | 1 ug | Variável |
| Tampão de reacção 10x | 1x | 4 |
| 10x T7 ARN polimerase mistura de enzima | 1x | 4 |
| O volume total | 40 |
Tabela 4: Composição de transcrição in vitro (IVT) mistura de reacção.
| Componente | Montante (ul) |
| Formamida | 3.3 |
| 37% de formaldeído | 1 |
| Tampão MEN (10x) | 1 |
| Tampão de carga 6x (fornecido com o DNA Ladder-peqGOLD Faixa Mix) | 1.7 |
| O volume total | 7 |
Tabela 5: Preparação de tampão de carga para electroforese em gel de ARN.
| Meio de cultura celular e tampão | |
| HEK-293 meio de cultura celular | Adicionar 25 ml de FCS, 2,5 ml de penicilina / estreptomicina, 2,5 ml de L-glutamina em 220 ml de glicose alta DMEM. Armazenar o meio a 4 ° C e usá-lo dentro de 2 semanas. |
| Tampão TBE (10x) | Dissolver 0,9 base M Tris, ácido bórico 0,9 M e EDTA 20 mM em 1 L de água (Ampuwa). O pH do tampão é de 8. |
| Tampão MEN (10x) | Dissolve-se 200 mM de MOPS, NaOAc 50 mM, EDTA 10 mM em 1 L de água (Ampuwa). Ajustar o valor de pH com NaOH a 7. |
Tabela 6: meio de cultura e buffers celular.
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Discussion
A terapia de ARNm tem um tremendo potencial no campo da medicina regenerativa, tratamento de doenças e de vacinação. Neste vídeo, que demonstram a produção de um ARNm modificado estabilizado para a indução da expressão da proteína nas células. Usando este protocolo, outros ARNm desejados podem ser gerados. A síntese in vitro do ARNm modificado permite a transfecção de células com mRNAs desejadas para induzir a expressão de proteínas alvo. Deste modo, a proteína desejada é expressa transientemente em condições fisiológicas até que o ARNm exogenamente entregue é completamente degradado.
Neste vídeo, foi demonstrada a expressão de eGFP durante 3 dias, após uma única transfecção de células HEK293 com eGFP ARNm. moléculas de mRNA que codificam outras proteínas pode levar a um período de expressão da proteína mais curta. A expressão da proteína diminui devido à degradação do mRNA exogenamente fornecido. Portanto, a limitação desta técnica para somde e aplicações pode ser a indução transiente da expressão da proteína. Assim, para manter a expressão da proteína nas células por um período mais longo, é necessária a entrega repetida de ARNm. Embora, transfecção ARNm tem a vantagem de não integração no genoma do hospedeiro, que impede a mutagénese de inserção e o desenvolvimento de cancro e leucemia comparativamente a vectores virais, a eficiência de transfecção in vivo, pode ser inferior a utilização de vectores virais.
A concentração de mRNA necessário e da quantidade de reagente de transfecção deve ser optimizada para cada tipo diferente de célula 14, que são as células alvo para entrega exógena de ARNm para produzir a proteína em falta.
Congelamento e descongelamento repetidos de ARNm deve ser evitado para manter a estabilidade do mRNA produzido. Portanto, alíquotas de trabalho pode ser preparado. Depois de PCR e IVT, apenas uma única banda específica deve ser detectado. Caso contrário, o número de ciclos de PCR, iniciador anneatemperatura, e / ou a quantidade de DNA de plasmídeo ling deve ser optimizado para obter o produto específico de ADN para IVT. Além disso, o tempo de IVT e a quantidade de molde de ADN para FPI pode ser optimizada para obter mRNA de um comprimento específico, em quantidades suficientes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pelo Fundo Social Europeu, em Baden-Württemberg, Alemanha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
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