Summary
I dette video artikkelen beskriver vi in vitro syntese av mRNA modifisert for induksjon av protein ekspresjon i celler.
Abstract
Den eksogene levering av koding syntetisk messenger-RNA (mRNA) for induksjon av proteinsyntese i ønskede celler har et enormt potensial innen regenerativ medisin, grunnleggende cellebiologi, behandling av sykdommer, og omprogrammering av celler. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for generering av modifiserte mRNA med redusert immunaktivering potensial og økt stabilitet, kvalitetskontroll av mRNA som produseres, transfeksjon av celler med mRNA og verifikasjon av det induserte proteinet ekspresjon ved strømningscytometri. Opp til 3 dager etter en enkelt transfeksjon med EGFP mRNA, de transfekterte HEK293 cellene produserer EGFP. I dette video artikkelen, er syntesen av EGFP-mRNA beskrevet som et eksempel. Imidlertid kan fremgangsmåten anvendes for fremstilling av andre ønskede mRNA. Ved hjelp av den syntetiske modifiserte mRNA, kan cellene bli indusert til forbigående å uttrykke de ønskede proteiner, som de normalt ikke ville uttrykke.
Introduction
I celler, transkripsjonen av messenger-RNA (mRNA) og den følgende translasjon av mRNA til ønskede proteiner sikrer riktig funksjon av celler. Arvelig eller ervervet genetiske lidelser kan føre til mangelfull og dysfunksjonell syntese av proteiner og forårsake alvorlige sykdommer. Således er en ny terapeutisk tilnærming for å indusere produksjonen av manglende eller defekte det eksogene proteiner levering av syntetisk modifisert mRNA i celler, som koder for det ønskede protein. Dermed blir cellene utløst å syntetisere funksjonelle proteiner, som de normalt ikke kan produsere eller ville naturligvis ikke trenger. Ved bruk av denne tilnærmingen, kan genetiske sykdommer korrigeres ved innføring av mRNA som koder for den defekte eller manglende protein 1. MRNA-terapi kan også bli brukt for vaksinasjon for å syntetisere proteinantigener, som uttrykkes av patogener eller tumorceller. Derved kan vertens immunsystem aktiveres til effektivt å eliminere tumorceller eller forhindre infections 2,3. Videre er det i de senere år, mRNA ble med hell anvendt for å generere induserte pluripotente stamceller (iPSCs). For dette formål, ble fibroblaster transfektert med mRNA for å indusere ekspresjon av reprogrammerings faktorer til 4-6 og for å omdanne dem i iPSCs med et enormt potensiale i regenerativ medisin.
Tidligere var bruk av konvensjonelle mRNA forbundet med lav stabilitet og sterk immunogenisitet. Dermed ble kliniske anvendelser av konvensjonelle mRNA begrenset. Imidlertid, utskifting av cytidin og uridin med 5-metylcytidin og pseudouridine innenfor mRNA molekylet ved Kariko og kolleger gjengitt stabile mRNA molekyler i biologiske væsker og dramatisk redusert immunaktivering 7-10, som nå tillater den kliniske anvendbarhet av modifiserte mRNA.
Ved hjelp av syntetisk produsert modifiserte mRNA, kan ønskede gentranskriptene bli midlertidig levert in vivo 11eller in vitro til å indusere proteinekspresjon. Den innførte mRNA oversettes under fysiologiske betingelser oversettelsen av det cellulære maskineri. På grunn av mangel på integrasjon i vertscellegenomet i forhold til viral genterapi vektorer, er risikoen for onkogenese hindres 12,13. Dermed vil terapi bruker modifiserte syntetiske mRNA bli bedre klinisk aksept i fremtiden.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for produksjon av modifisert mRNA (figur 1), transfeksjon av celler med mRNA og evaluering av protein ekspresjon i transfekterte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Økning av plasmider som inneholder Nødvendig Coding DNA-sekvenser (CDS)
- Pre-varm SOC medium, som er inkludert i transformasjons kit, til romtemperatur og LB-agarplater inneholdende 100 ug / ml ampicillin til 37 ° C. Ekvilibrere vannbad til 42 ° C.
- Tine ett hetteglass med kjemisk komponent E. coli på is.
- Legg 1-5 mL av plasmid (10 pg til 100 ng) som inneholder CDS inn i hetteglasset med kjemisk komponent E. coli og bland forsiktig. Ikke bland cellene ved pipettering. Etter å legge plasmider, bland ved å banke røret forsiktig.
- Inkuber blandingen på is i 30 min.
- Heat-sjokk E. coli i 30 sek ved 42 ° C i et vannbad uten risting.
- Plasser flasken på is i 2 min.
- Legg 250 ul av forvarmet SOC medium til E. coli og rist bakteriene horisontalt ved 300 rpm i 1 time ved 37 ° C i en bakterie inkubator.
- Spre 100 mL og 150 mL fra transformasjon mix på forhånds varmet LB agar plater, invertere plater og inkuberes over natten ved 37 ° C.
- Etter at kolonier blir synlige, inokulere en enkelt koloni fra hver plate til en 15 ml dyrkningsrør inneholdende 5 ml LB-medium med 100 pg / ml ampicillin. Inkuber dem over natten ved 37 ° C med rysting ved 300 rpm inntil kulturen er i sen logg eller stasjonær fase.
- For langtidslagring av transformert E. coli, pipette 75 ul av 100% glyserol inn i kryoampulle. Legg 225 pl av bakteriekulturen (frosset lager vil inneholde 25% glycerol), bland godt og lagre kryoampulle ved -80 ° C.
- Isolere plasmider som inneholder de nødvendige CDS ved hjelp av et plasmid rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bestem konsentrasjonen plasmidet ved hjelp av et spektrofotometer.
- Forbered aliquoter av 20 pl og lagre dem ved -20 ° C i lengre tid.
- MERK: For å få DNA mal for in vitro transkripsjon (IVT), CDS av interesse, her EGFP, forsterkes ved hjelp av PCR. Samtidig blir et poly-T-hale på 120 thymidines (T) tilsatt til innsatsen ved hjelp av en revers primer med en T 120 forlengelse. Dermed de genererte mRNAs få en poly A-hale med en definert lengde etter IVT.
- Forbered PCR blandingen som beskrevet i Tabell 1.
- Bland reaksjonsblandingen grundig. MERK: PCR-produktet kan brukes i 4-5 IVT reaksjoner. For å øke mengden DNA-templatet for IVT, kan totalt volum av PCR-blandingen økes. Flere PCR-rør hver inneholdende 100 ul PCR-blanding kan anvendes for å oppnå et tilstrekkelig utbytte av PCR-produktet.
- Plasser de PCR-rørene i en termosykler og kjøre PCR ved å bruke PCR-protokollen sykling (tabell 2).
- Rydde opp i PCR reaksjon ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner og eluere DNA ved hjelp av 20 ul nukleasefritt vann.
- Måle konsentrasjonen av DNA ved å bruke et spektrofotometer. MERK: detektert DNA-konsentrasjonen er omtrent 300 ug / ml. Dermed bør den forventede totale beløpet være ~ 6 mikrogram. Mengden av DNA for andre proteiner kan variere, avhengig av lengden av CDS, mengden av plasmid som anvendes for PCR, glødetemperatur av primere, og syklusnummer.
- Fryse DNA ved -20 ° C i lang tid, eller bruke den direkte for IVT.
3. Kontroll Step: Quality of PCR Produkt
- Kontroller kvaliteten av PCR-produktet ved DNA-elektroforese.
- Blande den ønskede mengde av agarose med 1 x TBE i en kolbe. For en 1% agarosegel, tilsett 0,5 g agarose i 50 ml av 1 x TBE.
- Mikrobølgeovn inntil agarose er oppløst. Ikke la det koke. Sørg for at agarose er helt i oppløsning.
- Tilsett 5 ul nukleinsyre gel flekken til 50 ml agarosegel.
- Hell geleen i en agarosegel boksen, sett kam, og vente ca 1 time før gelen stivnet.
- Fjern kammen og plasser gel boksen i en gel skuffen.
- Bland 2 pl (200 ng) av 80-10,000 bp DNA-stige og 200 ng av PCR-produktet hver med 2 ul 6x loading buffer i et totalvolum på 12 pl.
- Nøye laste DNA-prøver i brønnene av agarosegelen.
- Bruke 1x TBE som buffer, kjører agarosegel ved 100 V i 1 time.
- Visualisere DNA-band på et bildesystem (figur 2).
4. in vitro transkripsjon (IVT)
- MERK: Etter PCR blir plasmid inserts forsterkes og en poly T-tail er lagt til. Under IVT, er genetisk informasjon transkriberes fra DNA til RNA. Den genererte mRNA-transkriptet blir brukt til å produsere proteiner i celler.
- Rengjør arbeidsområde og pipetter med en RNase decontamination løsning. Bruk PCR rene og sterile dual-filter pipettespisser og ofte skifte hansker for å redusere forurensning av reaksjon blander seg med RNases.
- Klargjør NTP / cap analog blanding som beskrevet i Tabell 3.
- Bland NTP / cap analog blandingen omhyggelig ved virvling og spinne ned en kort stund.
- Monter IVT reaksjonsblandingen som beskrevet i tabell 4.
- Bland IVT reaksjonsblandingen grundig ved forsiktig pipettering opp og ned. Deretter Sentrifuger PCR røret lett for å samle blandingen ved bunnen av røret.
- Inkuber ved 37 ° C i 3 timer i en termomikser.
MERK: Den optimale inkubasjonstiden avhenger av lengden av innsatsene og effektiviteten av transkripsjonen gitt mal. For korte innsatser (<500 nt), kan en lengre inkubasjonstid være fordelaktig. En tids selvfølgelig eksperiment kan gjøres for å bestemme den optimale inkubasjonstiden for maksimal utbytte. Derfor satt opp IVT reaksjoner, for example, 1, 2, 3, 4, 6 timer, og inkubering over natten, og bestemme mengden mRNA. Kinetikken av in vitro transkripsjon for generering av EGFP-mRNA er vist i figur 3. - For å fjerne templat-DNA, tilsett 1 pl av DNase (2 U / pl) til IVT reaksjonsblandingen, bland godt og inkuber i 15 minutter ved 37 ° C.
- Rens reaksjonsblandingen ved hjelp av en RNA-rensesett i henhold til produsentens anvisninger instruksjoner. Eluere den modifiserte mRNA fra spinnkolonne membran to ganger med 40 ul nuclease-fritt vann. MERK: oppdaget RNA konsentrasjonen er ca 1500 ng / ml. Dermed bør den forventede totale beløpet være ~ 120 mikrogram. Mengden av mRNA syntetisert for andre proteiner kan variere, avhengig av lengden av CDS og mengden av PCR-produkt som brukes for IVT.
5. Behandling av Renset mRNA med Antarktis fosfatase
- MERK: Den genererte mRNA blir behandlet med fosfatase å fjerne 5 'trifosfater, som kan gjenkjennes av RIG-I og fører til aktivering av immunsystemet. Videre hindrer fosfatase-behandling for re-sirkularisering i en selv-ligeringsreaksjon.
- Legg 9 mL av 10x Antarktis fosfatase reaksjon buffer til 79 mL av renset mRNA løsning. Deretter tilsett 2 mL av Antarktis fosfatase (5 U / mL) og forsiktig bland prøven. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 30 min.
- Rens reaksjonsblandingen ved hjelp av en RNA-rensesett i henhold til produsentens anvisninger instruksjoner. Eluere den modifiserte mRNA fra spinnkolonne membran to ganger med 50 ul nuclease-fritt vann.
- Måle konsentrasjonen av de modifiserte mRNA ved hjelp av et spektrofotometer. Kontroller at forholdet mellom absorbans ved 260 nm / 280 nm (260 A / A-280) er ≥ 1,8 og forholdet mellom A 260/230 A er 2,0, noe som indikerer renhet.
MERK: Den forventede totale utbyttet skal være omtrent 90 mikrogram, som er sufficient for ca 36 mRNA transfections. - Juster konsentrasjonen av mRNA til 100 ng / ul ved tilsetning av nuklease-fritt vann.
- Delmengde den modifiserte mRNA i engangs delprøver som kreves for transfections og oppbevar ved -80 ° C. Unngå flere fryse og tinesykluser. Skikkelig forberedt og lagret mRNA er stabil i mange år. Under arbeide, alltid holde den modifiserte mRNA på is.
6. Kontroll Step: Quality of Syntetisert Modifisert mRNA
- Kontrollere kvaliteten på modifisert RNA mRNA ved gelelektroforese.
- Blande den ønskede mengde av agarose med 1 x TBE i en kolbe. For en 1% agarosegel, tilsett 0,5 g agarose i 50 ml av 1 x TBE.
- Mikrobølgeovn inntil agarose er oppløst. Ikke la det koke. Sørg for at agarose er helt i oppløsning.
- Tilsett 5 ul nukleinsyre gel flekken til 50 ml agarosegel.
- Hell geleen i en agarosegel boks, sett kam, og vente ca 1 time før gelen er solidified.
- Fjern kammen og plasser gel boksen i en gel skuffen.
- Bland 3 mL (3 ug) på 0,5-10 kb RNA Stige og 200 ng av hver mRNA syntetisert modifisert med 7 ul loading buffer i et totalvolum på 10 ul. Sammensetningen av ladningsbuffer er beskrevet i tabell 5.
- Denaturere stigen og mRNA-prøver ved 70 ° C i 10 min.
- Laste nøye stigen og mRNA prøver på 1% agarosegel.
- Utfør elektroforese ved 100 V i 1 time ved hjelp 1x TBE som buffer.
- Visualisere stigen og mRNA-band på en UV transilluminator og fotografi ved hjelp av en gel dokumentasjonssystem (figur 4).
7. Tilrettelegging av celler for Transfeksjon
- Plate 2 x 10 5 celler (HEK293 celler) pr brønn av 12-brønns plate.
- Cellene inkuberes over natten ved 37 ° C i en celleinkubator. MERK: På dagen for transfeksjon, bør cellene har Reached 80-90% samløpet.
8. Utføre mRNA Transfeksjon av celler
- Tine den modifiserte mRNA.
- Generere lipoplexes for transfeksjon.
- Legg 25 ul (2,5 ug) av modifisert mRNA og 2 ul av kationisk lipid transfeksjon reagens til 473 ul Opti-MEM (minimalt essensielt medium) jeg redusert serummedium for å generere transfeksjon blandingen for transfeksjon av en brønn i en 12-brønns plate. Skalere opp volumene i henhold til det antall brønner som skal transfekteres. Som negativ kontroll, utarbeide en transfeksjon blanding uten mRNA.
- Bland komponentene forsiktig ved pipettering. Inkuber transfeksjon blandingen ved romtemperatur i 20 min for å generere lipoplexes for transfeksjon.
MERK: transfeksjon Blandingen inneholder ingen antibiotika. Dermed ta vare å sikre steriliteten mens håndtering celler. - Vask cellene med 500 mL DPBS / brønn.
- Legg 500 ul transfeksjon blandingen til en brønn av en 12-brønns plate.
- Cellene inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Aspirer transfeksjon blandingen og tilsett 1 ml komplett cellekulturmedium til cellene.
- Cellene inkuberes i 24 timer i celleinkubator.
- Utføre fluorescens mikroskopanalyser ved anvendelse av en fluorescens-mikroskop (figur 5). MERK: For å undersøke uttrykket av andre proteiner i celler, som er produsert av transfeksjon med andre mRNA enn EGFP koding mRNA, kan cellene dyrkes på dekkglass. Deretter transfeksjon kan utføres, og cellene kan være farget med passende antistoffer og analysert ved fluorescens mikroskopi.
9. Flowcytometriske Analyser av EGFP Expression i Cells
- Fjern cellekulturmedium fra brønnene og vaskes godt med hver 1 ml DPBS (uten kalsium og magnesium). Legg 500 ul trypsin / EDTA per brønn for å løsne cellene fra overflaten av cellekulturplater. Deretter tilsett 500il TNS per brønn å inaktivere trypsin.
- Sentrifuger de løsnede celler i 5 min ved 300 x g ved romtemperatur. Fjern supernatanten slik at bare pellet. Resuspender cellepelleten i 150 ul cellefikseringsløsning og overføre cellesuspensjonen inn i en flowcytometri rør.
- Analyser prosentandelen av EGFP uttrykkende celler, og fluorescensintensiteten ved hjelp Geo Mean (geometrisk gjennomsnitt av fluorescens-intensitet) (figur 6).
10. Måling av Protein Expression over tid
- MRNA utføre transfeksjon av celler i 3 brønner på en 12-brønners plate som beskrevet i trinn 8. I tillegg inkuber 3 brønner av HEK293-celler med transfeksjon blandingen uten tilsetning av mRNA.
- Måle ekspresjonen av EGFP 1, 2 og 3 dager etter transfeksjon for å vurdere varigheten av proteinekspresjon (figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av en pcDNA 3.3 plasmid inneholdende de CDS av EGFP, ble syntesen av modifiserte EGFP mRNA opprettet (figur 1). Etter at innsatsen amplifikasjon ved hjelp av PCR og poly T-tailing, er et klart bånd med en lengde på omtrent 1100 bp detektert (Figur 2). Økning av IVT tid utvidet utbyttet av mRNA (figur 3). Etter IVT, ble en klar mRNA bånd med en lengde på omtrent 1100 bp detekteres, noe som tilsvarer lengden av EGFP mRNA som skal fremstilles (figur 4).
Funksjonaliteten til den genererte EGFP-mRNA ble testet ved transfeksjon av HEK293-celler. For dette formål, ble transfeksjon komplekser (lipoplexes) generert ved hjelp av et kationisk lipid transfeksjon reagens. Den transfeksjon ble utført med 2 x 10 5 celler per brønn av 12-brønns plate. Produksjonen av EGFP i cellene ble påvist 24 timer etter transfeksjon ved hjelp av fluorescensmikroskopi (Figure 5) og flow-cytometri (figur 6).
HEK293-celler ble transfektert med EGFP-mRNA. EGFP ekspresjon ble bestemt 1, 2 og 3 dager etter transfeksjon for å vurdere varigheten av protein ekspresjon i celler (figur 7). Etter 24 timer, var den høyeste protein ekspresjon i celler. Beløpet ble redusert 1,6 ganger hver neste dag. Selv etter 3 dager ble cellene inneholdt EGFP.
Fig. 1: Oversikt av den modifiserte produksjonsprosessen mRNA kodende DNA-sekvenser (CDS) med kjent flankerende sekvenser blir amplifisert ved PCR ved anvendelse av spesifikke primere. PCR-produktet blir renset og kvaliteten av den genererte DNA blir bestemt. MRNA er generert fra DNA-produkt ved hjelp av in vitro-transkripsjonsprosessen. Produktet er rensede d og behandlet med fosfatase for å fjerne 5'-trifosfater. Etter ytterligere rensing og kvalitetskontroll av mRNA som genereres, kan mRNA-transfeksjoner utføres.
Fig. 2: Analyse av DNA-produktet etter PCR-DNA-stige, og PCR-produktet ble kjørt på en 1% agarosegel. En klar DNA-bånd med en lengde på omtrent 1100 bp skal påvises.
Fig. 3: Kinetikk av in vitro transkripsjon for generering av EGFP-mRNA 1) RNA stige og IVT produkter etter 2 0 min), 3) 10 min, 4) 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min, og 7) DNA-templat alene ble kjørt på en 1% agarosegel.
Fig. 4: Analyse av mRNA produktet etter IVT RNA stige og IVT produktet ble kjørt på en 1% agarosegel. En klar mRNA bånd med en lengde på omtrent 1100 bp skal påvises.
Figur 5: Fluorescens mikroskopiske analyser av HEK293-celler 24 timer etter transfeksjon EGFP-mRNA. (A) fasekontrastbilde av cellene ved en forstørrelse på 100X. (B) Fluorescens bilder av cellene ved en forstørrelse på 100X.
Figur6: Strømningscytometrisk analyser av EGFP uttrykk i HEK293 celler 24 timer etter EGFP mRNA transfeksjon Den rosa linjen representerer celler uten mRNA transfeksjon og den blå linjen representerer EGFP positive celler etter EGFP mRNA transfeksjon.. Etter EGFP mRNA transfeksjon, 93,91% av alle målte cellene er positive og Geo Mean (geometrisk gjennomsnitt av fluorescens intensitet) er 720,16.
Figur 7: Flow-cytometrisk analyse av EGFP-ekspresjon i HEK293-celler 1, 2 og 3 dager etter transfeksjon EGFP-mRNA-ekspresjon Proteinet er høyest 24 timer etter transfeksjon mRNA.. Deretter blir mengden redusert 1,6 ganger hver dag (n = 3).
Tabell 1: Sammensetning av PCR-blanding.
| Komponent | Sluttkonsentrasjon | Beløp (pl) |
| Forward Primer | 0,7 mikrometer | 7 |
| Omvendt Primer | 0,7 mikrometer | 7 |
| 5x Q-løsning | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity PCR Buffer | 1x | 20 |
| Plasmid-DNA | 50 ng / 100 III | Variable |
| HotStar HiFidelity DNA Polymerase (2,5 U / mL) | U 2.5 | 1 |
| Nukleasefritt vann | Variable | |
| Totalt volum | 100 |
Tabell 1: Sammensetning av PCR-blanding.
| Cycle Antall | Tid | Temperatur (° C) | |
| Initial denatureringstrinn | 1 | 5 min | 95 |
| 3-trinns sykling | 2-25 | ||
| · Denaturering | 45 sek | 95 | |
| · Annealing | 1 min | 55 | |
| · Utvidelse | 1 min | 72 | |
| Endelig ekstensjon trinn | 26 | 10 min | 72 |
| Slutten av PCR sykling | Ubestemt | 4 |
Tabell 2: PCR sykling protocol.
| Komponent | Stock konsentrasjon (mM) | Sluttkonsentrasjon (mM) | Volum (mL) |
| ATP (fra MEGAscript T7 Kit) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (fra MEGAscript T7 Kit) | 75 | 1,875 | 1 |
| Me-CTP (fra Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| Pseudo-UTP (fra Trilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'-O-Me-m 7 G (5 ') ppp (5') G RNA cap struktur analog | 10 | 2,5 | 10 |
| Totalt volum | 23 |
Tabell 3: Sammensetning av NTP / cap analog blanding.
| Komponent | Sluttkonsentrasjon | Beløp (pl) |
| Nukleasefritt vann | Variable | |
| RNase inhibitor | 40 U | 1 |
| NTP / cap analog blanding (fra trinn 4.3) | 23 | |
| PCR-produkt | 1 mikrogram | Variable |
| 10x reaksjonsbuffer | 1x | 4 |
| 10x T7 RNA-polymerase-enzym blanding | 1x | 4 |
| Totalt volum | 40 |
Tabell 4: Sammensetning av in vitro transkripsjon (IVT) reaksjonsblandingen.
| Komponent | Beløp (pl) |
| Formamidet | 3.3 |
| 37% formaldehyd | 1 |
| MEN buffer (10x) | 1 |
| 6x loading buffer (følger med peqGOLD Range Mix DNA-Ladder) | 1.7 |
| Totalt volum | 7 |
Tabell 5: Fremstilling av ladningsbuffer for RNA-gelelektroforese.
| Cellekulturmedium og Buffer | |
| HEK-293 cellekulturmedium | Legg 25 ml FCS, 2,5 ml penicillin / streptomycin, 2,5 ml av L-gluglutamin i 220 ml DMEM høy glukose. Oppbevar medium ved 4 ° C og bruke det i løpet av 2 uker. |
| TBE buffer (10x) | Oppløs 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre og 20 mM EDTA i 1 L vann (Ampuwa). PH av bufferen er 8. |
| MEN buffer (10x) | Løs opp 200 mm MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA i en L vann (Ampuwa). Juster pH-verdien med NaOH til 7. |
Tabell 6: Cellekultur og medium buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MRNA-terapi har et stort potensial i feltet av regenerativ medisin, behandling av sykdommer og vaksinasjon. I denne video, viser vi fremstilling av et stabilisert, modifisert mRNA for induksjon av protein ekspresjon i celler. Ved hjelp av denne protokollen, kan andre ønskede mRNA bli generert. In vitro syntese av mRNA modifisert tillater transfeksjon av celler med de ønskede mRNA for å indusere ekspresjon av målproteiner. Derved blir det ønskede protein uttrykt forbigående under fysiologiske betingelser til eksogent levert mRNA er fullstendig nedbrutt.
I denne videoen, ble uttrykket av EGFP påvist for 3 dager etter en enkelt transfeksjon av HEK293 celler med EGFP mRNA. mRNA molekyler som koder andre proteiner kan føre til en kortere periode proteinekspresjon. Ekspresjon av proteinet reduseres på grunn av nedbrytning av eksogent levert mRNA. Derfor begrensning av denne teknikken for some applikasjoner kan være forbigående induksjon av proteinekspresjon. Således, for å opprettholde protein ekspresjon i celler for en lengre periode, er gjentatt levering av mRNA nødvendig. Selv om, transfeksjon mRNA har fordelen av ikke-integrering i vertsgenomet, som hindrer insertional mutagenese og utvikling av kreft og leukemi sammenlignet med virale vektorer, kan den in vivo transfeksjonseffektivitet være mindre enn ved hjelp av virale vektorer.
Den ønskede mRNA konsentrasjonen og mengden av transfeksjon reagens bør optimaliseres for hver annen celletype 14, som er målcellene for levering av eksogent mRNA for å produsere den manglende protein.
Gjentatt frysing og tining av mRNA bør unngås for å opprettholde stabiliteten av den produserte mRNA. Derfor kan arbeids alikvotene være forberedt. Etter PCR og IVT, bør kun en enkelt spesifikt bånd bli detektert. Ellers antall PCR-sykluser, primer Annealing temperatur, og / eller mengden av plasmid-DNA bør optimaliseres for å oppnå det spesifikke DNA-produkt for IVT. Videre kan IVT tid og mengden av DNA-templatet for IVT være optimalisert for å oppnå mRNA fra en bestemt lengde i tilstrekkelige mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av European Social Funds i Baden-Württemberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
