Summary
В этом видео статье мы описывают синтез в пробирке модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках.
Abstract
Экзогенный доставка кодирования синтетических РНК (мРНК) для индукции синтеза белка в нужные ячейки имеет огромный потенциал в области регенеративной медицины, основной клеточной биологии, лечения заболеваний, и перепрограммирования клеток. Здесь мы опишем шаг за шагом протокола для генерации модифицированной мРНК с пониженным потенциалом иммунной активации и повышенной стабильности, контроля качества производимой мРНК, трансфекции клеток с мРНК и проверки экспрессии белка индуцированной цитометрическим. До 3-х дней после одного трансфекции EGFP мРНК, трансфицированные клетки НЕК293 производить EGFP. В этой статье видео, синтез мРНК EGFP описан в качестве примера. Тем не менее, эта процедура может быть применена для производства других желаемых мРНК. Использование синтетических модифицированный мРНК, клетки могут быть индуцированы к временно выразить желаемые белки, которые они обычно не экспрессируют.
Introduction
В клетках, транскрипция матричной РНК (мРНК) и следующие перевод мРНК в нужных белков обеспечения надлежащего функционирования клеток. Наследственные или приобретенные генетические нарушения могут привести к недостаточной и неблагополучной синтеза белков и вызвать серьезные заболевания. Таким образом, новый терапевтический подход, чтобы вызвать выработку недостающих или поврежденных белков является экзогенный поставка синтетических изменены мРНК в клетках, который кодирует нужного белка. Таким образом, клетки активируются синтезировать функциональных белков, которые они обычно не могут производить или, естественно, не нужно. Используя этот подход, генетические нарушения могут быть исправлены путем введения мРНК, которая кодирует дефектных или отсутствующих белка 1. МРНК терапия также может быть использован для вакцинации, чтобы синтезировать белковые антигены, которые экспрессируются опухолевыми клетками или патогенов. Таким образом, хост иммунная система может быть активирована, чтобы эффективно устранить опухолевые клетки или предотвратить INFEctions 2,3. Кроме того, в последние годы, мРНК была успешно использована для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Для этой цели, фибробласты, трансфицированные мРНК, чтобы индуцировать экспрессию факторов перепрограммирования 4-6 и преобразовывать их в ИПСК с огромным потенциалом в регенеративной медицине.
Ранее использование обычного мРНК была связана с низкой стабильности и сильной иммуногенности. Таким образом, клиническое применение обычных мРНК были ограничены. Тем не менее, замена цитидином и уридином на 5-methylcytidine и псевдоуридина внутри молекулы мРНК по Kariko и коллег оказал молекулы мРНК стабильные в биологических жидкостях и резко снижается иммунная активация 7-10, который теперь позволяет клиническое применение модифицированных мРНК.
Использование синтетически произведенные модифицированных мРНК, желаемый ген стенограммы может быть временно поставлены в естественных условиях 11или в пробирке для индуцирования экспрессии белка. Введены мРНК переводится в физиологических условиях по переводческой техники сотовой. Из-за отсутствия интеграции в геном клетки-хозяина по сравнению с вирусными векторами генной терапии, риск онкогенеза предотвращается 12,13. Таким образом, терапия с использованием модифицированной синтетической мРНК получите лучшую клиническую принятие в будущем.
Здесь мы описываем подробный протокол для получения модифицированного мРНК (рис 1), трансфекции клеток с мРНК и оценки экспрессии белка в трансфекции клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Увеличение плазмиды, содержащие Обязательные Кодирование последовательностей ДНК (CDS)
- Предварительно теплой средой SOC, который входит в набор преобразований, до комнатной температуры и агаром LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина до 37 ° С. Уравновешивают ванну воды до 42 ° С.
- Оттепель один флакон химически компонента Е. палочка на льду.
- Добавить 1-5 мкл плазмиды (10 мкг до 100 нг), содержащий СДУ во флакон с химически компонента Е. палочка и аккуратно перемешать. Не смешивать клетки с помощью пипетки. После добавления плазмиды, тщательно смешать трубку осторожно.
- Выдержите смесь на льду в течение 30 мин.
- Тепло-шок E. палочки в течение 30 сек при 42 ° С на водяной бане без встряхивания.
- Помещают пробирку на льду в течение 2 мин.
- Добавить 250 мкл подогретого SOC среды в E. палочка и встряхивают в горизонтальном бактерии при 300 оборотах в минуту в течение 1 часа при 37 ° С в инкубаторе с бактериальной.
- Спред 100 мкл и 150 мкл из смеси трансформации на предварительно нагретый пластин агара LB, инвертировать пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
- После колонии становятся видимыми, прививку одну колонию от каждого планшета в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл LB среды со 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте их ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 300 оборотов в минуту, пока культура не в конце бревна или стационарной фазы.
- Для долговременного хранения трансформированной Е. палочка, пипетка 75 мкл 100% глицерина в криопробирку. Добавить 225 мкл бактериальной культуры (замороженных исходных будет содержать 25% глицерина), хорошо перемешать и хранить криопробирку при -80 ° С.
- Изолировать плазмиды, содержащие необходимые CDS с помощью набора для очистки плазмиды в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определить концентрацию плазмиды с использованием спектрофотометра.
- Подготовьте аликвоты 20 мкл и хранить их при температуре -20 ° С в течение длительного времени.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения ДНК-матрицы для транскрипции в пробирке (IVT), СРС, представляющих интерес, здесь EGFP, усиливается с помощью ПЦР. Одновременно, поли Т-образным оперением 120 тимидинов (Т) добавляют к вставке при помощи обратного праймера с T 120 расширения. Таким образом, сгенерированные мРНК получить поли А хвост с определенной длины после IVT.
- Подготовка ПЦР смесь, как указано в таблице 1.
- Смешайте реакции смесь тщательно. Примечание: ПЦР-продукт может быть использован в 4-5 IVT реакций. Для увеличения количества ДНК шаблона для IVT, общий объем смеси ПЦР может быть увеличена. Несколько трубок ПЦР каждый из которых содержит 100 мкл ПЦР смеси могут быть использованы для получения достаточного выхода продукта ПЦР.
- Поместите пробирки для ПЦР в амплификаторе и запустить ПЦР с использованием велосипедный протокол ПЦР (таблица 2).
- Очистка PРеакция CR использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями изготовителя и вымывания ДНК с использованием 20 мкл нуклеазы без воды.
- Измерить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра. ПРИМЕЧАНИЕ: обнаружена концентрация ДНК составляет примерно 300 мкг / мл. Таким образом, ожидается, общее количество должно быть ~ 6 мкг. Количество ДНК для других белков может отличаться в зависимости от длины CDS, количество плазмиды использовали для ПЦР, отжига праймеров температуре, и номер цикла.
- Замораживание ДНК при -20 ° С в течение длительного времени, или использовать его непосредственно для бесступенчатой.
3. Контроль Шаг: Качество продукта ПЦР
- Проверьте качество продукта ПЦР с помощью гель-электрофореза ДНК.
- Смешайте требуемое количество агарозы с 1x КЭ в колбе. Для 1% агарозном геле, добавить 0,5 г агарозы с 50 мл 1х КЭ.
- Микроволновая печь до растворения агарозы. Не позволяйте ему закипеть. Убедитесь, что в агарозном полностью в растворе.
- Добавить 5 мкл геля кислоты пятно нуклеиновой до 50 мл в агарозном геле.
- Вылейте гель в коробке агарозном геле, установить гребень, и подождите примерно 1 час, пока гель не затвердевает.
- Снимите гребень и разместить коробку геля в лоток гель.
- Смешайте 2 мкл (200 нг) 80-10,000 п.н. ДНК-лестницы и 200 нг ПЦР-продукта, каждый с 2 мкл 6x буфера для загрузки в общем объеме 12 мкл.
- Тщательно загрузить образцы ДНК в лунки на геле агарозы.
- Использование 1x TBE буфер, как работает, запустить агарозном геле при 100 В в течение 1 часа.
- Представьте полос ДНК на системы формирования изображения (рисунок 2).
4. In Vitro Транскрипция (ИВТ)
- Примечание: После ПЦР, плазмидные вставки усиливаются и поли Т-образным оперением добавляется. В бесступенчатой, генетическая информация транскрибируется с ДНК на РНК. Сгенерированный мРНК транскрипта используется для получения белков в клетках.
- Очистите рабочую зону и пипетки с РНКазы гecontamination решение. Использование ПЦР чистые и стерильные двойного фильтра наконечники и часто менять перчатки, чтобы свести к минимуму загрязнение из реакции смешивается с РНКаз.
- Подготовьте NTP / шапка аналоговый смеси, как описано в таблице 3.
- Смешайте NTP / шапка аналоговый смесь тщательно встряхиванием и спином вниз кратко.
- Сборка реакционной смеси IVT, как описано в таблице 4.
- Смешайте реакции IVT смесь тщательно, осторожно пипеткой вверх и вниз. Затем центрифугировать ПЦР-пробирку для сбора кратко смеси в нижней части трубки.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 3 ч в термомиксер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации зависит от длины вставок и транскрипции эффективности данного шаблона. Для коротких вставок (<500 нт), больше времени инкубации может быть выгодным. Эксперимент времени курс может быть сделано, чтобы определить оптимальное время инкубации для получения максимального урожая. Таким образом, созданы IVT реакции, для examplе, 1, 2, 3, 4, 6 ч, и инкубации в течение ночи, и определить количество мРНК. Кинетика транскрипции в пробирке для генерации EGFP мРНК показана на рисунке 3. - Для удаления ДНК-матрицы, добавить 1 мкл ДНКазы (2 U / мкл) к реакционной смеси IVT, хорошо перемешать и инкубировать 15 мин при 37 ° С.
- Очищают реакционной смеси с использованием очищающего РНК Набор по указания производителя. Элюции модифицированный мРНК из раздела мембраны спин дважды 40 мкл нуклеазы без воды. ПРИМЕЧАНИЕ: обнаружена концентрация РНК составляет около 1500 мкг / мл. Таким образом, ожидается, общая сумма должна быть ~ 120 мкг. Количество синтезированного мРНК для других белков может отличаться в зависимости от длины CDS и количество продукта ПЦР использовали для IVT.
5. Лечение очищенной мРНК с антарктической фосфатазы
- ПРИМЕЧАНИЕ: генерируется мРНК обрабатывают фосфатазы удалить 5 'трифосфаты, которые могут быть признанные RIG-I и приводят к активации иммунной системы. Кроме того, лечение фосфатазы предотвращает повторное рассылке в реакции самолигирования.
- Добавить 9 мкл 10х буфера антарктической реакции фосфатазы в 79 мкл очищенного раствора мРНК. Впоследствии, добавить 2 мкл антарктической фосфатазы (5 U / мкл) и аккуратно перемешайте пробу. Инкубируют реакционную смесь при 37 ° С в течение 30 мин.
- Очищают реакционной смеси с использованием очищающего РНК Набор по указания производителя. Элюции модифицированный мРНК из раздела мембраны спин дважды 50 мкл нуклеазы без воды.
- Измерение концентрации модифицированных мРНК с использованием спектрофотометра. Проверьте, что отношение оптической плотности при 260 нм / 280 нм (260/280) является ≥ 1,8 и отношение А / 260 230 2,0, что указывает на чистоту.
ПРИМЕЧАНИЕ: ожидается валовой сбор должен быть приблизительно 90 мкг, что sufficieнт примерно 36 мРНК трансфекций. - Регулировка концентрации мРНК до 100 нг / мкл добавлением нуклеазы без воды.
- Алиготе модифицированный мРНК в одноразовых аликвоты, необходимых для трансфекции и хранить при -80 ° С. Избегайте нескольких замораживания и оттаивания циклов. Должным образом подготовлен и сохранен мРНК стабилен в течение многих лет. Во время работы, всегда держите модифицированный мРНК на льду.
6. Контроль Шаг: Качество синтезированного модифицированной мРНК
- Проверка качества модифицированной мРНК РНК-гель-электрофореза.
- Смешайте требуемое количество агарозы с 1x КЭ в колбе. Для 1% агарозном геле, добавить 0,5 г агарозы с 50 мл 1х КЭ.
- Микроволновая печь до растворения агарозы. Не позволяйте ему закипеть. Убедитесь, что в агарозном полностью в растворе.
- Добавить 5 мкл геля кислоты пятно нуклеиновой до 50 мл в агарозном геле.
- Вылейте гель в коробку агарозном геле, установить гребень, и подождите примерно 1 час, пока гель не является солнечноdified.
- Снимите гребень и разместить коробку геля в лоток гель.
- Смешайте 3 мкл (3 мкг) 0,5-10 кб РНК лестнице и 200 нг синтезируемых мРНК модифицированного друг с 7 мкл буфера для загрузки в общем объеме 10 мкл. Состав буфера для загрузки, описан в таблице 5.
- Денатурации по лестнице и образцы мРНК при 70 ° С в течение 10 мин.
- Тщательно загрузки по лестнице и образцы мРНК на 1% агарозном геле.
- Выполните электрофорез при 100 V в течение 1 часа с использованием 1x КЭ как работает буфер.
- Представьте лестницу и мРНК полос на УФ трансиллюминаторе и фотографии с помощью системы гель документации (рисунок 4).
7. Подготовка клеток для трансфекции
- Пластина 2 x 10 5 клеток (клеток НЕК293) на лунку 12-луночного планшета.
- Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С в клеточной инкубаторе. Примечание: В день трансфекции клетки должны иметь REACHed 80-90% слияния.
8. Выполнение мРНК трансфекции клеток
- Оттепель модифицированный мРНК.
- Генерирование lipoplexes для трансфекции.
- Добавить 25 мкл (2,5 мкг) модифицированной мРНК и 2 мкл катионного липида реагента для трансфекции в 473 мкл Opti-MEM (минимальной поддерживающей среде) Я пониженном сыворотки среду для генерации трансфекции смесь для трансфекции одну лунку 12-луночного планшета. Масштабирование объемы в зависимости от количества скважин для трансфекции. Как отрицательного контроля, подготовить трансфекции смесь без мРНК.
- Смешайте компоненты мягко с помощью пипетки. Инкубируйте трансфекции смесь при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы генерировать lipoplexes для трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для трансфекции не содержит антибиотиков. Таким образом, необходимо обеспечить стерильность при работе клетки. - Вымойте клеток с 500 мкл DPBS / хорошо.
- Добавить 500 мкл смеси для трансфекции одну лунку PLA 12-луночногоТе.
- Инкубируйте клетки в течение 4 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Аспирируйте трансфекции смесь и добавьте 1 мл в комплекте клеток культуральной среды для клеток.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч в клеточной инкубаторе.
- Выполните флуоресценции микроскопических анализов с помощью флуоресцентного микроскопа (рисунок 5). Примечание: Чтобы исследовать экспрессию других белков в клетках, которые производятся путем трансфекции с другом мРНК, чем EGFP кодирования мРНК, клетки можно культивировать на покровных стеклах. Затем трансфекции может быть выполнена, и клетки могут быть окрашены с соответствующими антителами и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии.
9. Цитометрический Анализы EGFP экспрессии в клетках
- Удалить клеточную культуральную среду из лунок и промыть каждую лунку с 1 мл DPBS (без кальция и магния). Добавить 500 мкл трипсина / EDTA на лунку, чтобы отделить клетки от поверхности клеток культуральных планшетах. Впоследствии, добавить 500мкл TNS за хорошо для инактивации трипсина.
- Центрифуга отдельные клетки в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант, оставляя только осадок. Ресуспендируют осадок клеток в 150 мкл раствора фиксации клеток и передачи клеточной суспензии в пробирку проточной цитометрии.
- Проанализируйте процент EGFP экспрессирующих клеток и интенсивность флуоресценции, используя Geo среднего (среднее геометрическое интенсивности флуоресценции) (рисунок 6).
10. Измерение экспрессии белка с течением времени
- Выполнение мРНК трансфекцию клеток в 3 лунках 12-луночного планшета с, как описано в шаге 8. Кроме того, инкубировать 3 лунки НЕК293 с трансфекции смеси без добавления мРНК.
- Измерить экспрессию EGFP 1, 2, и 3 дня после трансфекции, чтобы оценить продолжительность экспрессии белка (фиг.7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование pcDNA 3,3 плазмиды, содержащей СДУ из EGFP, был создан синтез модифицированных EGFP мРНК (рисунок 1). После вставки амплификации ПЦР и поли Т-хвостохранилище, ясно полоса длиной около 1100 пар оснований обнаруживается (рисунок 2). Увеличение времени IVT Дополненная выход мРНК (рис 3). После бесступенчатой, ясно мРНК полоса длиной около 1100 пар оснований был обнаружен, что соответствует длине EGFP мРНК для производства (рисунок 4).
Функциональность генерируемого EGFP мРНК была проверена путем трансфекции клеток НЕК293. Для этой цели трансфекции комплексов (lipoplexes) были получены с использованием катионного липида реагента для трансфекции. Трансфекции проводили с 2 х 10 5 клеток на лунку 12-луночного планшета. Производство EGFP в клетках был обнаружен 24 ч после трансфекции с использованием флуоресцентной микроскопии (FIGUповторное 5) и проточной цитометрии (рисунок 6).
HEK293-клетки трансфицировали EGFP мРНК. Выражение EGFP определяли 1, 2, и 3 дня после трансфекции, чтобы оценить продолжительность экспрессии белка в клетках (фиг.7). После 24 часов, экспрессия белка был высоким в клетках. Сумма была уменьшена в 1,6 раза каждый следующий день. Даже после 3-х дней, клетки содержали EGFP.
Рисунок 1:. Обзор модифицированного мРНК производственного процесса кодирования последовательности ДНК (CDS) с известными боковых последовательностей усиливаются с использованием специфических праймеров с помощью ПЦР. Продукт ПЦР очищают и качество генерируемого ДНК определяется. МРНК образуется из продукта ДНК с помощью экстракорпорального процесс транскрипции в. Продукт purifie d и обрабатывали фосфатазой, чтобы удалить 5'-трифосфатов. После дополнительной очистки и контроля качества генерируемого мРНК, мРНК трансфекции может быть выполнена.
На рисунке 2:. Анализ продукта ДНК после ПЦР лестницы ДНК и ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле. Ясно, полоса ДНК длиной примерно 1100 пар оснований должна быть обнаружена.
На рисунке 3:. Кинетика транскрипции в пробирке для генерации EGFP мРНК 1) РНК лестничных и IVT продуктов через 2 мин) 0, 3) 10 мин, 4) 30 мин, 5) 180 мин, 6) 360 мин, и 7) одна матричной ДНК подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле.
Рисунок 4: Анализ. МРНК продукта после IVT РНК лестничной и IVT продукта проводили в 1% агарозном геле. Ясно мРНК полоса с длиной приблизительно 1100 пар оснований должна быть обнаружена.
Рисунок 5: Флуоресцентные микроскопические анализы НЕК293 24 ч после EGFP мРНК трансфекции. (А) Фазовый контраст изображения из клеток при увеличении 100х. (Б) Флуоресцентные изображения из клеток при увеличении 100х.
Фигура6: Цитометрический анализирует выражения EGFP в НЕК293 24 ч после EGFP мРНК трансфекции розовая линия представляет клетки без мРНК трансфекции и синяя линия представляет EGFP-положительных клеток после EGFP мРНК трансфекции.. После EGFP мРНК трансфекции, 93,91% всех измеренных клеток являются положительными и Geo Mean (среднее геометрическое интенсивности флуоресценции) является 720,16.
На рисунке 7: проточной цитометрии анализ экспрессии EGFP в клетках НЕК293, 1, 2, и 3 дня после трансфекции EGFP мРНК экспрессии белка является высокая 24 ч после трансфекции мРНК.. После этого стоимость уменьшается в 1,6 раза каждый день (N = 3).
Таблица 1: Состав ПЦР-смеси.
| Компонент | Конечная концентрация | Сумма (мкл) |
| Прямой праймер | 0,7 мкМ | 7 |
| Обратный праймер | 0,7 мкМ | 7 |
| 5x Q-решение | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity ПЦР буфера | 1x | 20 |
| ДНК плазмиды | 50 нг / 100 мкл | Переменная |
| HotStar HiFidelity ДНК-полимеразы (2,5 U / мкл) | 2.5 U | 1 |
| Нуклеазы без воды | Переменная | |
| Общий объем | 100 |
Таблица 1: Состав ПЦР-смеси.
| Цикл Количество | Время | Температура (° С) | |
| Начальная стадия денатурации | 1 | 5 мин | 95 |
| 3-шаг на велосипеде | 2-25 | ||
| · Денатурация | 45 сек | 95 | |
| · Отжига | 1 мин | 55 | |
| · Расширение | 1 мин | 72 | |
| Заключительный шаг расширение | 26 | 10 мин | 72 |
| Конец ПЦР на велосипеде | Неопределенный | 4 |
Таблица 2: ПЦР на велосипеде прotocol.
| Компонент | Концентрация Stock (мМ) | Конечная концентрация (мМ) | Объем (мкл) |
| АТФ (от MEGAscript T7 Kit) | 75 | 7,5 | 4 |
| GTP (от MEGAscript T7 Kit) | 75 | 1,875 | 1 |
| Me-CTP (от Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
| Псевдо-UTP (от Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
| 3'-O-Me-м 7 G (5') PPP (5') G РНК структура крышка аналоговый | 10 | 2,5 | 10 |
| Общий объем | 23 |
Таблица 3: Состав NTP / крышки аналогового смеси.
| Компонент | Конечная концентрация | Сумма (мкл) |
| Нуклеазы без воды | Переменная | |
| РНКазы ингибитор | 40 U | 1 |
| NTP / крышка аналоговый смесь (с шага 4.3) | 23 | |
| ПЦР-продукт | 1 мкг | Переменная |
| 10x реакция буфер | 1x | 4 |
| 10x РНК-полимеразы Т7 Смесь ферментов | 1x | 4 |
| Общий объем | 40 |
Таблица 4: Состав транскрипции в пробирке (яVT) реакционную смесь.
| Компонент | Сумма (мкл) |
| Формамид | 3.3 |
| 37% формальдегида | 1 |
| MEN буфера (10x) | 1 |
| 6x загрузки буфера (поставляется с peqGOLD Диапазон Mix ДНК зачёт) | 1,7 |
| Общий объем | 7 |
Таблица 5: Получение загрузочного буфера для РНК гель-электрофореза.
| Клеточной культуральной среды и буфером | |
| НЕК-293 клеток культуральную среду | Добавить 25 мл FCS, 2,5 мл пенициллина / стрептомицина, 2,5 мл L-Glutamine в 220 мл DMEM высокий уровень глюкозы. Хранить среды при 4 ° С и использовать его в течение 2 недель. |
| КЭ буфера (10x) | Растворите 0,9 М Трис базу, 0,9 М борной кислоты и 20 мМ ЭДТА в 1 л воды (Ampuwa). РН буфера составляет 8. |
| MEN буфера (10x) | Растворите 200 мм швабры, 50 ммоль NaOAc, 10 мМ ЭДТА в 1 л воды (Ampuwa). Отрегулируйте значение рН с помощью NaOH до 7. |
Таблица 6: клеточной культуральной среды и буферы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
МРНК терапия обладает огромным потенциалом в области регенеративной медицины, лечения заболеваний и вакцинации. В этом видео мы покажем, производство стабилизированной, модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках. Используя этот протокол, другие желаемые мРНК могут быть сгенерированы. Синтез в пробирке из модифицированной мРНК позволяет трансфекцию клеток с желаемыми мРНК для индукции экспрессии белков-мишеней. Таким образом, желаемый белок экспрессируется временно в физиологических условиях до тех пор, экзогенно доставлен мРНК не будет полностью деградирует.
В этом видео, выражение EGFP была продемонстрирована в течение 3 дней после однократного трансфекции клеток НЕК293 с EGFP мРНК. молекул мРНК, кодирующие другие белки, может привести к более короткого периода экспрессии белка. Экспрессия белка уменьшается из-за деградации мРНК экзогенно доставлены. Таким образом, ограничение этого метода для сомове приложения могут быть переходный индукция экспрессии белка. Таким образом, чтобы поддерживать экспрессию белка в клетках в течение более длительного периода, повторная доставка мРНК требуется. Хотя, мРНК трансфекции имеет то преимущество, что не-интеграции в геном хозяина, который предотвращает инсерционного мутагенеза и развитие рака и лейкоза по сравнению с вирусными векторами, в естественных условиях эффективность трансфекции может быть меньше, чем с использованием вирусных векторов.
Требуемая концентрация мРНК и количество реагента для трансфекции должна быть оптимизирована для каждого типа клеток 14, которые являются клетками-мишенями для экзогенной доставке мРНК для получения недостающего белка.
Повторное замораживание и оттаивание мРНК следует избегать, чтобы сохранить стабильность полученного мРНК. Таким образом, рабочие аликвоты могут быть получены. После ПЦР и IVT, только один конкретный группа должна быть обнаружена. В противном случае, число циклов ПЦР, праймер anneaТемпература лин, и / или количество плазмидной ДНК должны быть оптимизированы, чтобы получить конкретный продукт ДНК для IVT. Кроме того, время IVT и количество ДНК-матрицы для IVT могут быть оптимизированы, чтобы получить мРНК из определенной длины в достаточном количестве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован европейских социальных фондов в земле Баден-Вюртемберг, Германия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
