Summary
במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.
Abstract
המשלוח אקסוגני של קידוד RNA שליח סינטטי (mRNA) לזירוז סינתזה של חלבונים בתאים רצויים יש פוטנציאל עצום בתחומים של רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה של תא בסיסי, טיפול במחלות, ותכנות מחדש של תאים. כאן, אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור של mRNA שונה עם פוטנציאל מופחת חיסוני הפעלה ויציבות מוגברת, בקרת איכות של ה- mRNA מיוצר, transfection של תאים עם mRNA ואימות של ביטוי חלבון הנגרם על ידי זרימת cytometry. עד 3 ימים לאחר transfection יחיד עם eGFP mRNA, HEK293 תאי transfected לייצר eGFP. במאמר זה וידאו, הסינתזה של eGFP mRNA מתוארת כדוגמא. עם זאת, ההליך יכול להיות מיושם לייצור של ה- mRNA הרצוי האחר. שימוש בסינטטי שונה mRNA, יכולים להיגרם תאים לבטא את החלבונים הרצויים, שבו הם בדרך כלל לא מביעים זמניים.
Introduction
בתאים, השעתוק של RNA שליח (mRNA) והתרגום הבא של ה- mRNA לחלבונים רצויים להבטיח את התפקוד התקין של תאים. הפרעות גנטיות תורשתיות או נרכשות יכולות להוביל לסינתזה מספיקה ולא מתפקדת של חלבונים וגורמות למחלות קשות. כך, גישה טיפולית חדשה ללעורר את הייצור של חלבונים חסרים או פגומים הוא המשלוח אקסוגני של סינטטי שונה mRNA לתאים, שקודים לחלבון הרצוי. וכך, תאים מופעלים לסנתז חלבונים פונקציונליים, שבו הם בדרך כלל לא יכולים לייצר או באופן טבעי לא צריכים. שימוש בגישה זו, ניתן לתקן הפרעות גנטיות על ידי הקדמה של mRNA שמקודד לחלבון הפגום או חסר 1. גם טיפול mRNA יכול לשמש לחיסון לאנטיגנים synthetize חלבון, אשר באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול או פתוגנים. ובכך, מערכת חיסונית מארח יכולה להיות מופעלת כדי לחסל ביעילות תאים סרטניים או למנוע infections 2,3. יתר על כן, בשנים האחרונות, mRNA היה בהצלחה המשמש לייצור תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). לצורך כך, fibroblasts היה transfected עם mRNAs לגרום הביטוי של תכנות מחדש גורמי 4-6 ולהמיר אותם בiPSCs עם פוטנציאל עצום ברפואת רגנרטיבית.
בעבר, השימוש בmRNA הקונבנציונלי היה קשור ביציבות נמוכה וחיסוני חזקים. כך, יישומים קליניים של mRNAs הקונבנציונלי היו מוגבלים. עם זאת, החלפת cytidine וuridine על ידי 5-methylcytidine וpseudouridine בתוך מולקולת mRNA על ידי Kariko ועמיתים שניתנו מולקולות mRNA יציבים בנוזלים ביולוגיים והפחתה דרמטית בהפעלת מערכת חיסונית 7-10, אשר כעת מאפשרת יישום הקליני של mRNAs שונה.
באמצעות מיוצר באופן סינטטי mRNAs שונה, תמלילי גן רצויים יכולים להיות מועברים באופן זמני בvivo 11או במבחנה כדי לגרום לביטוי חלבון. MRNA הציג מתורגם בתנאים פיסיולוגיים על ידי מכונות תרגום הסלולריות. בשל חוסר האינטגרציה לתוך הגנום של התא הפונדקאי לעומת וקטורי ריפוי גנטי נגיפיים, הסיכון של oncogenesis נמנע 12,13. כך, טיפול באמצעות mRNA הסינתטי שונה יקבל קבלה קלינית טובה יותר בעתיד.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור של ה- mRNA שונה, transfection של תאים עם mRNA וההערכה של ביטוי חלבון בתאי transfected (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הגדלת של פלסמידים המכילים נדרש קידוד רצפי DNA (CDS)
- בינוני טרום חם SOC, הנכלל בערכת השינוי, לטמפרטורת חדר והצלחות אגר LB המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין עד 37 מעלות צלזיוס. לאזן את האמבטיה במים עד 42 מעלות צלזיוס.
- להפשיר בקבוקון אחד של א 'כימי מרכיב coli על קרח.
- להוסיף 1-5 μl של פלסמיד (10 עמ '100 ng) המכיל את ה- CDS לתוך הבקבוקון של א' כימי מרכיב coli ומערבבים בעדינות. אין לערבב את התאים על ידי pipetting. לאחר הוספת פלסמידים, לערבב על ידי הקשה על הצינור בעדינות.
- דגירה את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
- חום הלם E. coli למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס באמבט מים בלי לרעוד.
- מניחים את הצנצנת על קרח במשך 2 דקות.
- הוסף 250 μl בינוני SOC מחומם מראש לE. coli ולנער את החיידקים אופקיים ב 300 סל"ד עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס חממת חיידקים.
- מורחים 100 μl ו -150 μl מתערובת הטרנספורמציה על צלחות אגר LB מראש חימם, להפוך את הצלחות ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.
- לאחר המושבות להיות גלויות, לחסן מושבה אחת מכל צלחת לתוך צינור תרבות 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירה אותם בן לילה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב300 סל"ד עד התרבות היא ביומן מאוחר או שלב נייח.
- לאחסון לטווח הארוך של א 'הפכה coli, pipet 75 μl של גליצרול 100% לcryovial. להוסיף 225 μl של תרבות החיידקים (המניה קפוא תכיל 25 גליצרול%), מערבב היטב ולאחסן cryovial ב -80 מעלות צלזיוס.
- לבודד את פלסמידים המכילים את ה- CDS הנדרש באמצעות ערכת טיהור פלסמיד על פי הוראות יצרן.
- קבע את ריכוז פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר.
- הכן aliquots של 20 μl ולאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס לזמן ממושך.
- הערה: לקבלת תבנית ה- DNA לשעתוק במבחנה (IVT), CDS של עניין, כאן eGFP, מוגבר באמצעות PCR. במקביל, פולי T-זנב של 120 thymidines (T) הוא הוסיף להוספה באמצעות פריימר הפוכה עם סיומת T 120. וכך, mRNAs שנוצר להשיג זנב פולי עם אורך מוגדר לאחר IVT.
- הכן תערובת PCR כמפורט בטבלה המס '1.
- מערבבים את תערובת התגובה ביסודיות. הערה: מוצר ה- PCR יכול לשמש ב4-5 תגובות IVT. כדי להגדיל את כמות תבנית ה- DNA לIVT, ניתן להגדיל נפח כולל של תערובת PCR. צינורות PCR כמה כל תערובת PCR 100 μl מכילה יכולים לשמש כדי להשיג תשואה מספקת של מוצר ה- PCR.
- מניחים את צינורות PCR ב thermocycler ולהפעיל PCR באמצעות פרוטוקול PCR הרכיבה על אופניים (טבלת 2).
- לנקות Pתגובת CR באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות יצרן וelute את ה- DNA באמצעות 20 nuclease ללא מים μl.
- למדוד את הריכוז של ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. הערה: ריכוז ה- DNA שזוהה הוא כ 300 מיקרוגרם / מיליליטר. לפיכך, הסכום הכולל הצפוי להיות ~ 6 מיקרוגרם. כמות ה- DNA לחלבונים אחרים יכולה להשתנות בהתאם לאורכו של CDS, הסכום של פלסמיד המשמש לPCR, חישול בטמפרטורה של פריימרים, ומספר מחזור.
- להקפיא את ה- DNA ב -20 מעלות צלזיוס במשך זמן רב או להשתמש בו באופן ישיר לIVT.
3. בקרת שלב: איכות של מוצר ה- PCR
- בדוק את האיכות של מוצר ה- PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה DNA.
- מערבבים את הכמות הרצויה של agarose עם TBE 1x בבקבוק. לג'ל agarose 1%, מוסיף 0.5 גרם של agarose 50 מיליליטר של TBE 1x.
- מיקרוגל עד agarose הוא נמס. אל תתנו לזה לרתוח. ודא שagarose הוא לחלוטין בפתרון.
- הוסף 5 μl כתם ג'ל חומצות גרעין 50 מיליליטר ג'ל agarose.
- יוצקים את הג'ל לתוך תיבת agarose ג'ל, להגדיר את המסרק, ולהמתין כ 1 שעה עד ג'ל הקרושה.
- הסר את המסרק ולמקם את תיבת ג'ל במגש ג'ל.
- מערבבים 2 μl (200 ng) של ה- DNA סולם 80-10,000 נ"ב ו -200 ng של מוצר ה- PCR כל אחד עם 2 מאגר טעינת μl 6x בהיקף כולל של 12 μl.
- לטעון דגימות DNA בזהירות לתוך הבארות של ג'ל agarose.
- באמצעות 1x TBE כחיץ פועל, הפעל את הג'ל agarose ב -100 V עבור שעה 1.
- דמיינו את להקות ה- DNA על מערכת הדמיה (איור 2).
4. שעתוק במבחנה (IVT)
- הערה: לאחר PCR, מוסיף פלסמיד הן מוגברות ופולי T-זנב הוא הוסיף. במהלך IVT, מידע גנטי הוא עיבד מ- DNA ל- RNA. תמליל mRNA שנוצר משמש לייצור חלבונים בתאים.
- נקה את אזור העבודה וטפטפות עם ד RNaseפתרון econtamination. טיפים פיפטה כפול מסנן הנקי וסטרילי השימוש PCR ולעתים קרובות לשנות כפפות כדי למזער את הזיהום של תגובה מתערבבת עם RNases.
- מכין את התערובת האנלוגית NTP / כובע, כמתואר בטבלה 3.
- מערבבים את התערובת האנלוגית NTP / כובע ביסודיות על ידי vortexing וספין למטה בקצרה.
- להרכיב את תערובת תגובת IVT כפי שמתואר בטבלה 4.
- מערבבים את תערובת תגובת IVT ביסודיות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. אז צנטריפוגות צינור PCR בקצרה לאסוף את התערובת על התחתית של התחתית.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות בthermomixer.
הערה: זמן הדגירה האופטימלי תלוי באורך של מוסיף ויעילות תעתיק של תבנית נתונה. למוסיף קצר (<500 NT), זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות יתרון. ניסוי זמן כמובן ניתן לעשות על מנת לקבוע את זמן דגירה האופטימלי לתשואה מקסימלי. לכן, הקים תגובות IVT, לexamplדואר, עבור 1, 2, 3, 4, 6 שעות, ודגירת הלילה ולקבוע את כמות ה- mRNA. קינטיקה של השעתוק במבחנה לדור של eGFP mRNA מוצגת באיור 3. - כדי להסיר את תבנית ה- DNA, להוסיף 1 μl של DNase (2 U / μl) לתערובת תגובת IVT, מערבב היטב ודגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לטהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA על פי הוראות manufacturer's. Elute mRNA שונה מקרום טור הספין פעמיים עם 40 nuclease ללא מים μl. הערה: ריכוז RNA שזוהה הוא כ -1,500 מיקרוגרם / מיליליטר. לפיכך, הסכום הכולל הצפוי להיות ~ 120 מיקרוגרם. כמות ה- mRNA מסונתז עבור חלבונים אחרים יכולה להשתנות בהתאם לאורכו של CDS ואת הסכום של מוצר ה- PCR משמש לIVT.
5. טיפול מזוקק mRNA עם אנטארקטיקה phosphatase
- תלת 'mRNA שנוצר טופל בphosphatase כדי להסיר 5: הערהפוספטים, אשר יכול להיות מוכר על ידי RIG-אני ולהוביל להפעלת מערכת חיסונית. יתר על כן, טיפול phosphatase מונע מחדש circularization בתגובת קשירה עצמית.
- הוסף 9 μl של 10x מאגר תגובת phosphatase אנטארקטיקה 79 μl של פתרון ה- mRNA המטוהר. בהמשך לכך, להוסיף 2 μl של phosphatase אנטארקטיקה (5 U / μl) ולערבב בעדינות את הדגימה. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לטהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA על פי הוראות manufacturer's. Elute mRNA שונה מקרום טור הספין פעמיים עם 50 nuclease ללא מים μl.
- למדוד את הריכוז של mRNA שונה באמצעות ספקטרופוטומטר. בדוק שהיחס של הספיגה ב 260 ננומטר / 280 ננומטר (260/280) הוא ≥ 1.8 והיחס של 260/230 הוא 2.0, דבר שמצביע על טוהר.
הערה: התשואה הכוללת הצפויה להיות כ 90 מיקרוגרם, שהוא sufficieNT כ 36 transfections mRNA. - התאם את הריכוז של mRNA 100 ng / μl על ידי הוספת מים nuclease חינם.
- Aliquot mRNA שונה לaliquots שימוש יחיד הנדרשים לtransfections ולאחסן ב -80 ° C. הימנע מחזורי הקפאה והפשרה מרובים. הוכן כראוי ומאוחסן mRNA יציב במשך שנים רבות. במהלך עבודה, תמיד לשמור על mRNA שונה על קרח.
6. בקרת שלב: איכות המסונתזת mRNA השתנה
- בדוק את האיכות של ה- mRNA שונה על ידי ג'ל אלקטרופורזה RNA.
- מערבבים את הכמות הרצויה של agarose עם TBE 1x בבקבוק. לג'ל agarose 1%, מוסיף 0.5 גרם של agarose 50 מיליליטר של TBE 1x.
- מיקרוגל עד agarose הוא נמס. אל תתנו לזה לרתוח. ודא שagarose הוא לחלוטין בפתרון.
- הוסף 5 μl כתם ג'ל חומצות גרעין 50 מיליליטר ג'ל agarose.
- יוצקים את הג'ל לתוך תיבת agarose ג'ל, להגדיר את המסרק, ולהמתין כ 1 שעה עד ג'ל הוא סוליdified.
- הסר את המסרק ולמקם את תיבת ג'ל במגש ג'ל.
- לערבב 3 μl (3 מיקרוגרם) של סולם RNA .5-10 kb ו -200 ננוגרם של מסונתז שונה mRNA כל אחד עם מאגר טעינה 7 μl בהיקף כולל של 10 μl. הרכב למאגר הטעינה מתואר בלוח 5.
- לפגל סולם ודגימות ה- mRNA על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לטעון בזהירות בסולם ודגימות ה- mRNA על 1% agarose ג'ל.
- לבצע אלקטרופורזה ב -100 V עבור שעה 1 באמצעות 1x TBE כחיץ פועל.
- דמיינו את הסולם ולהקות mRNA על transilluminator UV ותצלום באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (איור 4).
7. הכנה של תאים לTransfection
- 5 תאי פלייט 2 x10 (HEK293 תאים) לכל טוב של 12 גם צלחת.
- דגירה תאי הלילה בשעה 37 ° C בתא חממה. הערה: ביום transfection, התאים צריכים reacהד 80-90 מפגש%.
8. ביצוע mRNA Transfection של תאים
- להפשיר את ה- mRNA שונה.
- צור lipoplexes לtransfection.
- הוסף 25 μl (2.5 מיקרוגרם) של mRNA שונה ו -2 μl של מגיב transfection שומנים בדם קטיוני 473 μl Opti-MEM (בינוני חיוני מינימאלי) אני מופחת בינוני בסרום כדי ליצור את תערובת transfection לtransfection באר אחת של צלחת 12 גם. בהיקף של עד הכרכים לפי מספר הבארות להיות transfected. כביקורת שלילית, להכין תערובת transfection ללא mRNA.
- מערבבים את המרכיבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה את תערובת transfection בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לייצר lipoplexes לtransfection.
הערה: תערובת transfection לא מכילה אנטיביוטיקה. כך, לדאוג ולהבטיח סטריליות בעת טיפול בתאים. - שטוף תאים עם 500 DPBS μl / טוב.
- הוסף 500 μl תערובת transfection לאחד היטב PLA 12 גםte.
- דגירה התאים עבור 4 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- לשאוב את תערובת transfection ולהוסיף 1 מיליליטר מדיום תרבות תא שלם לתאים.
- דגירה התאים למשך 24 שעות בתא החממה.
- בצע מיקרוסקופי הקרינה ניתוחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 5). הערה: כדי לבחון את הביטוי של חלבונים אחרים בתאים, המיוצרים על ידי transfection עם mRNA האחר מאשר eGFP קידוד mRNA, ניתן לטפח את התאים על coverslips. אז transfection יכול להתבצע ויכולים להיות מוכתם התאים עם נוגדנים מתאימים ונותחו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
9. ניתוח תזרים Cytometric ביטוי eGFP בתאים
- הסר בינוני תרבית תאים מהבארות ולשטוף היטב עם כל DPBS 1 מיליליטר (ללא סידן ומגנזיום). הוסף 500 טריפסין μl / EDTA לכל גם לנתק את התאים מפני שטח של צלחות תרבית תאים. בהמשך לכך, להוסיף 500μl TNS לכל טוב כדי להשבית טריפסין.
- צנטריפוגה התאים המנותק למשך 5 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant ומשאיר רק את גלולה. Resuspend התא גלולה ב 150 פתרון קיבוע תא μl ולהעביר את ההשעיה התא לתוך cytometry זרימת הצינור.
- לנתח את אחוז התאים לבטא eGFP ועוצמת הקרינה באמצעות Geo Mean (ממוצע גיאומטרי של עוצמת הקרינה) (איור 6).
10. מדידה של ביטוי חלבון לאורך זמן
- בצע transfection mRNA של תאים ב 3 בארות של צלחת 12 גם כמתואר בשלב 8. בנוסף, דגירה 3 בארות של תאי HEK293 עם תערובת transfection ללא התוספת של mRNA.
- מדוד את הביטוי של 1 eGFP, 2, ו -3 ימים לאחר transfection כדי להעריך את משך הזמן של ביטוי חלבון (איור 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פלסמיד pcDNA 3.3 המכיל את ה- CDS של eGFP, הסינתזה של eGFP mRNA שונה הוקמה (איור 1). לאחר הגברה להוסיף על ידי PCR ופולי T-עוקב, להקה ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב הוא זוהה (איור 2). הגדלת זמן IVT Augmented התשואה של mRNA (איור 3). לאחר IVT, להקת mRNA ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב זוהתה, אשר תואמת את אורכו של eGFP mRNA שיופק (איור 4).
הפונקציונליות של mRNA eGFP שנוצר נבדקה על ידי transfection של תאי HEK293. לצורך כך, מתחמי transfection (lipoplexes) היו שנוצרו באמצעות מגיב transfection שומנים בדם קטיוני. Transfection בוצע עם 2 x 10 5 תאים לכל טוב של 12 גם צלחת. הייצור של eGFP בתאים התגלה 24 שעות לאחר transfection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Figuמחדש 5) וcytometry זרימה (איור 6).
HEK293 תאים היו transfected עם eGFP mRNA. ביטוי eGFP נקבע 1, 2, ו -3 ימים לאחר transfection כדי להעריך את משך הזמן של ביטוי חלבון בתאים (איור 7). לאחר 24 שעות, ביטוי החלבון היה הגבוה ביותר בתאים. הסכום הופחת 1.6 פי כל למחרת. גם לאחר 3 ימים, התאים הכילו eGFP.
איור 1:. סקירה של תהליך ייצור mRNA שונה קידוד רצפי DNA (CDS) עם רצפי איגוף ידועים, מועצמים על ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים. מוצר ה- PCR הוא מטוהר והאיכות של ה- DNA שנוצר נקבעה. MRNA שנוצר ממוצר ה- DNA באמצעות בתהליך השעתוק במבחנה. המוצר הוא purifie ד וטופל בphosphatase להסיר 5'-triphosphates. לאחר הטיהור נוספת ובקרת איכות של ה- mRNA שנוצר, ניתן לבצע transfections mRNA.
איור 2:. ניתוח של מוצר ה- DNA לאחר PCR סולם DNA ומוצר ה- PCR היה לרוץ על 1% agarose ג'ל. להקת DNA ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב צריכה להיות מזוהה.
איור 3:. קינטיקה של שעתוק במבחנה לדור של מוצרי סולם RNA mRNA 1) וIVT eGFP אחרי 2) 0 דקות, 3) 10 דקות, 4) 30 דקות, 5) 180 דקות, 6) 360 דקות, ו -7) תבנית ה- DNA לבד היו לרוץ על 1% agarose ג'ל.
איור 4:. ניתוח של מוצר ה- mRNA לאחר IVT מוצר סולם RNA וIVT היה לרוץ על 1% agarose ג'ל. להקת mRNA ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב צריכה להיות מזוהה.
איור 5: ניתוחים מיקרוסקופיים הקרינה של HEK293 תאים 24 שעות לאחר transfection eGFP mRNA. תמונת שלב () ניגודיות של התאים בהגדלה של 100X. (ב) תמונות הקרינה של התאים בהגדלה של 100X.
איור 6: תזרים cytometric מנתח ביטוי eGFP בHEK293 תאים 24 שעות לאחר transfection eGFP mRNA הקו הוורוד מייצג תאים ללא transfection mRNA והקו הכחול מייצג תאים חיוביים eGFP לאחר transfection eGFP mRNA.. לאחר transfection eGFP mRNA, 93.91% מכלל התאים הנמדדים הם חיוביים וגיאו Mean (הממוצע גיאומטרי של עוצמת הקרינה) הוא 720.16.
איור 7: תזרים cytometric מנתח ביטוי eGFP בHEK293 תאים 1, 2, ו -3 ימים לאחר transfection eGFP mRNA ביטוי החלבון הוא גבוהה ביותר 24 שעות לאחר transfection mRNA.. לאחר מכן, את הסכום מופחת 1.6 פי כל יום (n = 3).
טבלה 1: הרכב של תערובת PCR.
| רכיב | ריכוז סופי | הסכום (μl) |
| קדימה פריימר | 0.7 מיקרומטר | 7 |
| פריימר ההפוך | 0.7 מיקרומטר | 7 |
| 5x Q-פתרון | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity PCR מאגר | 1x | 20 |
| פלסמיד דנ"א | 50 ng / 100μl | משתנה |
| HotStar HiFidelity DNA פולימראז (2.5 U / μl) | 2.5 U | 1 |
| nuclease ללא מים | משתנה | |
| נפח כולל | 100 |
טבלה 1: הרכב של תערובת PCR.
| מספר מחזור | זמן | טמפרטורה (° C) | |
| צעד denaturation ראשוני | 1 | 5 דקות | 95 |
| רכיבה על אופניים 3 שלבים | 2-25 | ||
| · Denaturation | 45 שניות | 95 | |
| · חישול | 1 דקות | 55 | |
| · הארכה | 1 דקות | 72 | |
| צעד ארכה סופי | 26 | 10 דקות | 72 |
| סוף הרכיבה על אופניים PCR | ללא הגבלת זמן | 4 |
טבלה 2: יחסי ציבור רכיבה על אופניים PCR otocol.
| רכיב | ריכוז מניות (מ"מ) | ריכוז סופי (מ"מ) | נפח (μl) |
| ATP (מMEGAscript T7 ערכה) | 75 | 7.5 | 4 |
| GTP (מMEGAscript T7 ערכה) | 75 | 1.875 | 1 |
| שלי-CTP (מTrilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| פסאודו-UTP (מTrilink) | 100 | 7.5 | 3 |
| 3'של-O-Me-מ '7 G (5') ppp אנלוגי מבנה כובע RNA G (5') | 10 | 2.5 | 10 |
| נפח כולל | 23 |
= "תמיד"> לוח 3: הרכב התערובת אנלוגית NTP / כובע.
| רכיב | ריכוז סופי | הסכום (μl) |
| nuclease ללא מים | משתנה | |
| RNase מונעי | 40 U | 1 |
| NTP / תערובת אנלוגית כובע (משלב 4.3) | 23 | |
| מוצר ה- PCR | 1 מיקרוגרם | משתנה |
| מאגר תגובת 10x | 1x | 4 |
| תמהיל אנזים פולימראז 10x T7 RNA | 1x | 4 |
| נפח כולל | 40 |
לוח 4: הרכב השעתוק במבחנה (אניVT) תערובת תגובה.
| רכיב | הסכום (μl) |
| Formamide | 3.3 |
| פורמלדהיד 37% | 1 |
| חיץ גברים (10x) | 1 |
| חיץ 6x טעינה (מסופק עם ה- DNA סולם peqGOLD טווח Mix) | 1.7 |
| נפח כולל | 7 |
לוח 5: הכנת מאגר טעינת ג'ל אלקטרופורזה RNA.
| תרבית תאים בינוני והצפה | |
| מדיום תרבות תא HEK-293 | להוסיף 25 מיליליטר של FCS, 2.5 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין, 2.5 מיליליטר של L-Glutamine בגלוקוז הגבוהה DMEM 220 מיליליטר. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו בתוך 2 שבועות. |
| מאגר TBE (10x) | לפזר 0.9 בסיס M טריס, חומצה בור 0.9 מ 'ו 20 מ"מ EDTA במי 1 ליטר (Ampuwa). ה- pH של החיץ הוא 8. |
| חיץ גברים (10x) | לפזר 200 מגבי מ"מ, 50 מ"מ NaOAc, 10 mM EDTA במי 1 ליטר (Ampuwa). התאם את ערך ה- pH עם NaOH עד 7. |
לוח 6: תרבית תאים בינוני ומאגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש טיפול mRNA פוטנציאל עצום בתחום של רפואת רגנרטיבית, טיפול במחלות וחיסונים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הייצור של ה- mRNA התייצב, שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיות שנוצר mRNA הרצוי אחר. הסינתזה במבחנה של mRNA שונה מאפשרת transfection של תאים עם mRNAs הרצוי כדי לגרום לביטוי של חלבוני יעד. וכך, החלבון הרצוי בא לידי ביטוי זמני בתנאים פיסיולוגיים עד mRNA מועבר באופן אקסוגני הוא מושפל לחלוטין.
בסרטון הזה, הביטוי של eGFP הודגם במשך 3 ימים לאחר transfection תאים אחת HEK293 עם eGFP mRNA. מולקולות mRNA קידוד חלבונים אחרים יכולות להוביל לתקופת ביטוי חלבון קצרה יותר. הביטוי של החלבון יורד עקב הידרדרות של mRNA מועבר באופן אקסוגני. לכן, ההגבלה של טכניקה זו לסוםיישומי דואר עשויים להיות האינדוקציה החולפת של ביטוי חלבון. לכן, כדי לשמור על ביטוי חלבון בתאים לתקופה ארוכה יותר, נדרש משלוח חוזר ונשנה של mRNA. למרות, transfection mRNA יש את היתרון של אי-השתלבות בגנום המארח, המונע mutagenesis insertional וההתפתחות של הסרטן ולוקמיה בהשוואה לוקטורים ויראליים, in vivo יעילות transfection יכולה להיות פחות מאשר שימוש בוקטורים ויראליים.
הריכוז הנדרש mRNA והסכום של מגיב transfection צריכים להיות מותאם לכל סוג תאים שונה 14, שהם תאי היעד למסירה אקסוגני של mRNA כדי לייצר את החלבון החסר.
יש להימנע הקפאה להפשרה של mRNA חוזרים כדי לשמור על היציבות של mRNA מיוצר. לכן, יכולים להיות מוכנים aliquots עובדים. לאחר PCR וIVT, צריכה רק להיות מזוהה להקה ספציפית אחד. אחרת, מספר מחזורי PCR, annea פריימרטמפרטורה, ו / או כמות ה- DNA פלסמיד לינג צריכה להיות מותאמת להשגת מוצר ה- DNA הספציפי לIVT. יתר על כן, זמן IVT והסכום של תבנית ה- DNA לIVT יכולים להיות מותאם להשגת mRNA של אורך מסוים בכמויות מספיקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי קרנות החברתיות האירופיות באדן-וירטמברג, גרמניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
