Summary
I denna video artikeln beskriver vi syntesen av modifierade mRNA in vitro för induktion av proteinuttryck i celler.
Abstract
Den exogena leverans av kodning syntetisk budbärar-RNA (mRNA) för induktion av proteinsyntes i önskade celler har en enorm potential inom regenerativ medicin, grundläggande cellbiologi, behandling av sjukdomar, och omprogrammering av celler. Här beskriver vi en steg för steg-protokoll för alstring av modifierade mRNA med nedsatt immunaktivering potential och ökad stabilitet, kvalitetskontroll av producerat mRNA, transfektion av celler med mRNA och verifiering av den inducerade proteinexpression med flödescytometri. Upp till 3 dagar efter en enda transfektion med eGFP mRNA, de transfekterade HEK293 celler producerar eGFP. I denna video artikeln, är syntesen av eGFP mRNA beskrivs som ett exempel. Däremot kan förfarandet tillämpas för tillverkning av andra önskade mRNA. Med användning av den syntetiska modifierade mRNA kan celler induceras att transient uttrycka de önskade proteinerna, som de normalt inte skulle uttrycka.
Introduction
I celler, transkriptionen av budbärar-RNA (mRNA) och följande translation av mRNA till önskade proteiner säkerställa en väl fungerande celler. Ärftliga eller förvärvade genetiska sjukdomar kan leda till otillräcklig och dysfunktionella syntes av proteiner och orsaka allvarliga sjukdomar. Således, en ny terapeutisk strategi för att inducera produktionen av saknade eller defekta proteinerna är den exogena leverans av syntetiskt modifierat mRNA i celler, som kodar för det önskade proteinet. Därigenom celler aktiveras för att syntetisera funktionella proteiner, vilket de normalt inte kan producera eller skulle naturligtvis inte behöver. Genom att använda denna metod, kan genetiska sjukdomar korrigeras genom införande av mRNA som kodar för defekta eller saknas protein 1. MRNA Terapi kan också användas för vaccination för att syntetisera proteinantigener, som uttrycks av tumörceller eller patogener. Därigenom kan värdens immunsystem aktiveras för att effektivt eliminera tumörceller eller förhindra infesfunktione r 2,3. Dessutom, under de senaste åren, mRNA med framgång för att generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För detta ändamål har fibroblaster transfekterade med mRNA för att inducera uttryck av omprogrammering faktorer 4-6 och omvandla dem i iPSCs med en enorm potential inom regenerativ medicin.
Tidigare användning av konventionella mRNA förknippad med låg stabilitet och stark immunogenicitet. Således var kliniska tillämpningar av konventionella mRNA begränsad. Men byte av cytidin och uridin med 5-metylcytidin och pseudouridine inom mRNA-molekylen från Kariko och kollegor gjort mRNA-molekyler stabila i biologiska vätskor och dramatiskt minskad immunaktivering 7-10, som nu gör den kliniska tillämpningen av modifierade mRNA.
Använda syntetiskt framställda modifierade mRNA, kan önskade gentranskript tillfälligt levereras in vivo 11eller in vitro för att inducera proteinexpression. Den introducerade mRNA översätts under fysiologiska förhållanden av det cellulära översättningen maskiner. På grund av bristande integration i värdcellens genom jämförelse med virala genterapivektorer, är risken för onkogenesen förhindras 12,13. Således kommer terapi med modifierad syntetisk mRNA få bättre klinisk acceptans i framtiden.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för framställning av modifierat mRNA (Figur 1), transfektion av celler med mRNA och utvärdering av proteinuttryck i transfekterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ökning av plasmider innehållande Obligatorisk Coding DNA-sekvenser (CDS)
- Pre-varmt SOC-medium, som ingår i omvandlingssats, till rumstemperatur och de LB-agarplattor innehållande 100 pg / ml ampicillin till 37 ° C. Ekvilibrera vattenbadet på 42 ° C.
- Tina en flaska kemiskt komponent E. coli på is.
- Lägg 1-5 pl av plasmiden (10 pg till 100 ng) som innehåller CDS i flaskan med kemiskt komponent E. coli och blanda försiktigt. Blanda inte cellerna genom pipettering. Efter att ha lagt plasmider, blanda genom att knacka på röret försiktigt.
- Inkubera blandningen på is under 30 min.
- Heat-shock E. coli för 30 sek vid 42 ° C i ett vattenbad utan skakning.
- Placera flaskan på is i 2 min.
- Lägg 250 l av förvärmda SOC-medium till E. coli och skaka bakterierna horisontellt vid 300 rpm under 1 h vid 37 ° C i en bakteriell inkubator.
- Sprid 100 l och 150 l från transformationsmixen på förvärmda LB-agarplattor, vänd plattorna och inkuberas över natten vid 37 ° C.
- Efter kolonierna blir synliga, ympa en enda koloni från varje platta till ett 15 ml odlingsrör innehållande 5 ml LB-medium med 100 | ig / ml ampicillin. Inkubera dem över natten vid 37 ° C med skakning vid 300 rpm tills kulturen är i sen log eller stationär fas.
- För långtidslagring av transformerad E. coli, pipett 75 ul 100% glycerol till cryovial. Lägg 225 pl av bakteriekulturen (frusen lager kommer att innehålla 25% glycerol), blanda väl och förvara cryovial vid -80 ° C.
- Isolera plasmider som innehåller de erforderliga CDS med användning av en plasmid-reningskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Bestämma plasmiden koncentration med användning av en spektrofotometer.
- Preparera delprover på 20 ^ och förvara dem vid -20 ° C under längre tid.
- OBS: För att få DNA-mall för in vitro-transkription (IVT), CDS av intresse, här EGFP, amplifieras med hjälp av PCR. Samtidigt, är en poly-T-svansen av 120 tymidiner (T) sattes till insatsen med hjälp av en omvänd primer med en T 120 förlängning. Därmed de genererade mRNA få en poly A-svans med en definierad längd efter IVT.
- Bered PCR-blandning som beskrivs i tabell 1.
- Blanda reaktionsblandningen grundligt. OBSERVERA: PCR-produkt kan användas i 4-5 IVT reaktioner. För att öka DNA-templat beloppet för IVT, kan ökas totala volymen av PCR-blandningen. Flera PCR-rör var och en innehållande 100 | il PCR-blandning kan användas för att erhålla ett tillräckligt utbyte av PCR-produkt.
- Placera PCR-rören i en termocykler och köra PCR med användning av PCR-cykling protokollet (Tabell 2).
- Städa upp PCR reaktion med användning av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens instruktioner och eluera DNA med användning av 20 pl nukleasfritt vatten.
- Mäta koncentrationen av DNA: t med användning av en spektrofotometer. OBS: Den detekterade DNA-koncentrationen är ca 300 pg / ml. Därför bör den förväntade totala beloppet vara ~ 6 mikrogram. Mängden DNA för andra proteiner kan variera beroende på längden av CDS, mängd plasmid användes för PCR, glödgningstemperatur av primers och cykelnummer.
- Frys DNA vid -20 ° C under en längre tid eller använda den direkt för IVT.
3. Kontroll Steg: Kvalitet på PCR-produkt
- Kontrollera kvaliteten av PCR-produkten genom DNA-gelelektrofores.
- Blanda den önskade mängden av agaros med 1x TBE i en kolv. För en 1% agarosgel, tillsätt 0,5 g agaros till 50 ml 1x TBE.
- Mikrovågsugn tills agarosen upplöses. Låt det inte koka. Se till att agarosen är helt i lösning.
- Tillsätt 5 l nukleinsyra gel fläcken till 50 ml agarosgel.
- Häll gelen i en agarosgel ruta, ställa kammen, och vänta ca 1 timme tills gelén stelnat.
- Ta kammen och placera gelen lådan i en gel bricka.
- Blanda 2 | il (200 ng) av 80-10,000 bp DNA-stege och 200 ng av PCR-produkten med vardera 2 | il 6x laddningsbuffert i en total volym av 12 | il.
- Noggrant läsa in DNA-prover i brunnarna i agarosgelen.
- Använda 1x TBE som löpbuffert kör agarosgel vid 100 V under 1 timme.
- Visualisera DNA-banden på ett avbildningssystem (figur 2).
4. in vitro-transkription (IVT)
- OBS: Efter PCR, är plasmiden insatserna förstärks och en poly T-tail tillsätts. Under IVT, är genetiska information som transkriberas från DNA till RNA. Den genererade mRNA-transkript användes för att framställa proteiner i celler.
- Rengör arbetsområdet och pipetter med en RNas decontamination lösning. Använd PCR rena och sterila dubbla filter pipettspetsar och ofta byta handskar för att minimera kontaminering av reaktion blandas med RNaser.
- Förbered NTP / cap-analog blandning som beskrivs i tabell 3.
- Blanda NTP / cap analog blandningen omsorgsfullt genom skakning och spinn ner en kort stund.
- Montera IVT reaktionsblandningen såsom beskrivits i tabell 4.
- Blanda IVT reaktionsblandningen grundligt genom att försiktigt pipettera upp och ned. Centrifugera sedan PCR-röret en kort stund för att samla upp blandningen på botten av röret.
- Inkubera vid 37 ° C under 3 h i en Thermomixer.
OBS: Den optimala inkubationstiden beror på längden av insatserna och transkriptions effektivitet given mall. För korta inlägg (<500 nt), kan en längre inkubationstid vara fördelaktigt. En tidsförlopp experiment kan göras för att bestämma den optimala inkubationstiden för maximal avkastning. Därför inrättades IVT reaktioner, för example, för en, två, tre, fyra, sex timmar, och inkubation över natten och bestämma mRNA-mängden. Kinetiken för transkription in vitro för generering av EGFP-mRNA visas i Figur 3. - För att ta bort templat-DNA, tillsätt 1 pl av DNas (2 U / | il) till IVT reaktionsblandningen, blanda väl och inkubera 15 minuter vid 37 ° C.
- Rena den reaktionsblandning med användning av en RNA-reningskit enligt tillverkarens anvisningar. Eluera den modifierade mRNA från den spinnkolonn membranet två gånger med 40 pl nukleasfritt vatten. OBS: Den detekterade RNA-koncentrationen är ca 1500 | ig / ml. Därför bör den förväntade totala beloppet bli ~ 120 mikrogram. Mängden syntetiserade mRNA för andra proteiner kan variera beroende på längden av CDS och mängden PCR-produkt som används för IVT.
5. Behandling av renat mRNA med Antarctic Phosphatase
- OBS! Den genererade mRNA behandlas med fosfatas för att avlägsna 5 'trifosfater, som kan erkännas av RIG-I och leda till immunaktivering. Dessutom förhindrar fosfatasbehandling åter cirkularisering i en själv ligeringsreaktion.
- Lägg 9 pl 10x fosfatas reaktionsbuffert Antarktis till 79 pl renat mRNA lösning. Därefter tillsätt 2 pl Antarktis fosfatas (5 U / l) och blanda försiktigt provet. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 30 min.
- Rena den reaktionsblandning med användning av en RNA-reningskit enligt tillverkarens anvisningar. Eluera den modifierade mRNA från den spinnkolonn membranet två gånger med 50 pl nukleasfritt vatten.
- Mäta koncentrationen av de modifierade mRNA med användning av en spektrofotometer. Kontrollera att förhållandet av absorbans vid 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) är ≥ 1,8 och förhållandet mellan A 260 / A 230 är 2,0, vilket tyder på renhet.
OBS: Det förväntade totala avkastningen bör vara ungefär 90 mikrogram, vilket är sufficient för cirka 36 mRNA transfektioner. - Justera koncentrationen av mRNA till 100 ng / | j, l genom tillsats av nukleasfritt vatten.
- Alikvotera den modifierade mRNA till engångs portioner som behövs för transfektioner och förvara vid -80 ° C. Undvik flera frysa och upptiningscykler. Väl förberedda och lagras mRNA är stabil under många år. Under arbetet, håll alltid den modifierade mRNA på is.
6. Kontroll Steg: Kvaliteten på Syntetiserad Modified mRNA
- Kontrollera kvaliteten på modifierat mRNA av RNA-gelelektrofores.
- Blanda den önskade mängden av agaros med 1x TBE i en kolv. För en 1% agarosgel, tillsätt 0,5 g agaros till 50 ml 1x TBE.
- Mikrovågsugn tills agarosen upplöses. Låt det inte koka. Se till att agarosen är helt i lösning.
- Tillsätt 5 l nukleinsyra gel fläcken till 50 ml agarosgel.
- Häll gelen i en agarosgel låda, ställa kammen, och vänta ca 1 timme tills gelén är solidified.
- Ta kammen och placera gelen lådan i en gel bricka.
- Blanda 3 il (3 ^ g) av från 0,5 till 10 kb RNA-stege och 200 ng av syntetiserad modifierat mRNA var och en med 7 ^ il laddningsbuffert i en total volym av 10 | il. Sammansättningen av laddningsbuffert beskrivs i tabell 5.
- Denaturera stege och mRNA-prover vid 70 ° C under 10 min.
- Lasta stegen och mRNA-prover på 1% agarosgel.
- Utför elektrofores vid 100 V under 1 timme med användning 1x TBE som löpande buffert.
- Visualisera stegen och mRNA-banden på en UV-transilluminator och fotografi med en gel dokumentationssystem (Figur 4).
7. Förberedelser av celler för transfektion
- Plate 2 x10 5 celler (HEK293-celler) per brunn i 12-brunnars platta.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en cellinkubator. OBS: På dagen för transfektion, bör cellerna har REAChed 80-90% konfluens.
8. Utföra mRNA Transfektion av celler
- Tina den modifierade mRNA.
- Generera de lipoplexes för transfektion.
- Addera 25 pl (2,5 pg) av modifierat mRNA och 2 | il av katjonisk lipid transfektionsreagens till 473 | il Opti-MEM (Minimal Essential Medium) Jag reducerat serummedium för att generera transfektionsblandningen för transfektion av en brunn i en 12-brunnsplatta. Skala upp de volymer enligt antalet brunnar som skall transfekteras. Som negativ kontroll, förbereda en transfektion blandning utan mRNA.
- Blanda komponenterna försiktigt genom pipettering. Inkubera transfektion blandningen vid rumstemperatur under 20 min för att generera lipoplexes för transfektion.
OBS! Transfektionsblandning innehåller ingen antibiotika. Alltså, vara noga med att säkerställa steriliteten vid hantering celler. - Tvätta cellerna med 500 l DPBS / brunn.
- Addera 500 pl transfektion blandning till en brunn i en 12-brunnars plate.
- Inkubera cellerna i 4 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Aspirera transfektion blandningen och tillsätt 1 ml fullständigt cellodlingsmedium till cellerna.
- Inkubera cellerna i 24 timmar i cellinkubator.
- Utför fluorescens mikroskopisk analys med hjälp av ett fluorescensmikroskop (Figur 5). OBS: För att undersöka uttrycket av andra proteiner i celler, som produceras genom transfektion med andra mRNA än eGFP kodning mRNA, kan cellerna odlas på täckglas. Därefter kan utföras transfektionen och cellerna kan färgas med lämpliga antikroppar och analyserades med fluorescensmikroskopi.
9. Flödescytometriska Analyser av eGFP Uttryck i celler
- Ta bort cellkulturmedium från brunnarna och tvätta varje brunn med 1 ml DPBS (utan kalcium och magnesium). Addera 500 pl trypsin / EDTA per brunn för att lossa cellerna från ytan av cellodlingsplattor. Därefter till 500il TNS per brunn för att inaktivera trypsin.
- Centrifugera de lösgjorda cellerna under 5 min vid 300 xg vid rumstemperatur. Avlägsna supernatanten lämnar endast pelleten. Resuspendera cellpelleten i 150 | il cellfixeringslösningen och överför cellsuspensionen till ett flödescytometri rör.
- Analysera den procentuella andelen av EGFP-uttryckande celler och fluorescensintensiteten med användning av Geo Medelvärde (geometriskt medelvärde av fluorescensintensitet) (Figur 6).
10. Mätning av Protein Expression över tid
- Utföra mRNA-transfektion av celler i tre brunnar i en 12-brunnars platta, såsom beskrivits i steg 8. Dessutom inkubera 3 brunnar i HEK293 celler med transfektionsblandningen utan tillsats av mRNA.
- Mäta uttrycket av EGFP 1, 2, och 3 dagar efter transfektion för att utvärdera varaktigheten av proteinuttryck (Figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av en pcDNA 3,3 plasmid innehållande CDS av EGFP ades syntesen av modifierade EGFP mRNA fastställdes (figur 1). Efter insatsen förstärkning med PCR och poly T-tailing, är ett tydligt band med en längd på ca 1.100 bp detekterades (figur 2). Ökning av IVT tiden förstärkt utbytet av mRNA (Figur 3). Efter IVT, var en klar mRNA-band med en längd av cirka 1100 bp detekterades, vilket motsvarar längden av EGFP mRNA som skall tillverkas (fig 4).
Funktionaliteten hos den genererade EGFP mRNA testades genom transfektion av HEK293-celler. För detta ändamål gjordes transfektion komplex (lipoplexes) genereras med användning av en katjonisk lipid transfektionsreagens. Transfektionen utfördes med 2 x 10 5 celler per brunn i 12-brunnars platta. Produktionen av EGFP i cellerna detekterades 24 h efter transfektion med användning av fluorescensmikroskopi (Figure 5) och flödescytometri (figur 6).
HEK293 celler med eGFP mRNA. EGFP expression bestämdes 1, 2, och 3 dagar efter transfektion för att utvärdera varaktigheten av proteinuttryck i cellerna (fig 7). Efter 24 h var proteinexpressions högst i cellerna. Beloppet sänktes 1,6 gånger varje nästa dag. Även efter 3 dagar, cellerna innehöll eGFP.
Figur 1:. Översikt av den modifierade mRNA produktionsprocessen Coding DNA-sekvenser (CDS) med kända flankerande sekvenserna amplifieras genom PCR med användning av specifika primrar. PCR-produkten renas och kvaliteten på den genererade DNA bestäms. MRNA genereras från DNA-produkt med hjälp av in vitro-transkriptionen. Produkten är purifie d och behandlas med fosfatas för att avlägsna 5'-trifosfater. Efter ytterligare rening och kvalitetskontroll av genererad mRNA kan mRNA-transfektioner utföras.
Figur 2:. Analys av DNA-produkten efter PCR-DNA-stege och PCR-produkten kördes på en 1% agarosgel. En tydlig DNA-band med en längd på ca 1.100 bp ska upptäckas.
Figur 3:. Kinetik för in vitro-transkription för generering av EGFP mRNA 1) RNA-stege och IVT produkter efter 2) 0 min, 3) 10 min, 4) 30 min, 5) 180 min, 6) 360 min, och 7) Enbart DNA-mall kördes på en 1% agarosgel.
Figur 4:. Analys av mRNA-produkt efter IVT-RNA stege och IVT produkten kördes på en 1% agarosgel. En tydlig mRNA band med en längd på ca 1.100 bp ska upptäckas.
Figur 5: fluorescens mikroskopiska analyser av HEK293-celler 24 h efter eGFP mRNA transfektion. (A) Faskontrast bild av cellerna vid en förstoring av 100X. (B) fluorescensbilder av cellerna vid en förstoring av 100X.
Figur6: Flödescytometriska analyser av EGFP uttryck i HEK293-celler 24 timmar efter eGFP mRNA transfektion Den rosa linjen representerar celler utan mRNA transfektion och den blå linjen representerar EGFP positiva celler efter eGFP mRNA transfektion.. Efter eGFP mRNA transfektion, 93,91% av alla uppmätta cellerna är positiva och Geo Mean (geometriskt medelvärde av fluorescensintensiteten) är 720,16.
Figur 7: Flödescytometrisk analyser av EGFP expression i HEK293-celler 1, 2, och 3 dagar efter EGFP mRNA transfektion Den proteinuttryck är högst 24 h efter mRNA-transfektion.. Därefter belopp minskas 1,6 gånger dagligen (n = 3).
Tabell 1: Sammansättning av PCR-blandning.
| Komponent | Slutlig koncentration | Mängd (^ il) |
| Framåt Primer | 0,7 | iM | 7 |
| Reverse Primer | 0,7 | iM | 7 |
| 5x Q-Solution | 1x | 20 |
| 5x HotStar HiFidelity PCR-buffert | 1x | 20 |
| Plasmid-DNA | 50 ng / 100 ^ il | Variabel |
| HotStar HiFidelity DNA-polymeras (2,5 U / ^ il) | 2,5 U | Ett |
| Nukleasfritt vatten | Variabel | |
| Total volym | 100 |
Tabell 1: Sammansättning av PCR-blandning.
| Cykel Antal | Tid | Temperatur (° C) | |
| Initial denatureringssteg | Ett | 5 min | 95 |
| 3-stegscykling | 2-25 | ||
| · Denaturering | 45 sek | 95 | |
| · Glödgning | 1 min | 55 | |
| · Förlängning | 1 min | 72 | |
| Slutlig förlängning steg | 26 | 10 min | 72 |
| Slutet av PCR-cykling | Obestämd | 4 |
Tabell 2: PCR-cykling protocol.
| Komponent | Lager koncentration (mM) | Slutlig koncentration (mM) | Volym (^ il) |
| ATP (från MEGAscript T7 Kit) | 75 | 7,5 | 4 |
| GTP (från MEGAscript T7 Kit) | 75 | 1,875 | Ett |
| Me-CTP (från Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
| Pseudo-UTP (från Trilink) | 100 | 7,5 | 3 |
| 3'-O-Me-m 7 G (5') ppp (5 ') G-RNA cap struktur analog | 10 | 2,5 | 10 |
| Total volym | 23 |
Tabell 3: Sammansättning av NTP / cap analog blandning.
| Komponent | Slutlig koncentration | Mängd (^ il) |
| Nukleasfritt vatten | Variabel | |
| RNas-inhibitor | 40 U | Ett |
| NTP / cap analog blandning (från steg 4,3) | 23 | |
| PCR-produkt | 1 ^ g | Variabel |
| 10x reaktionsbuffert | 1x | 4 |
| 10x T7 RNA-polymerasenzymblandning | 1x | 4 |
| Total volym | 40 |
Tabell 4: Sammansättning av transkription in vitro (IVT) reaktionsblandningen.
| Komponent | Mängd (^ il) |
| Formamid | 3,3 |
| 37% formaldehyd | Ett |
| MÄN buffert (10x) | Ett |
| 6x laddningsbuffert (medföljer peqGOLD Range Mix DNA-stege) | 1,7 |
| Total volym | 7 |
Tabell 5: Framställning av laddningsbuffert för RNA gelelektrofores.
| Cellodlingsmedium och buffert | |
| HEK-293-cell-odlingsmedium | Tillsätt 25 ml FCS, 2,5 ml av penicillin / streptomycin, 2,5 ml L-gluTamine i 220 ml DMEM-hög glukos. Förvara medium vid 4 ° C och använd den inom 2 veckor. |
| TBE-buffert (10 x) | Lös 0,9 M Tris-bas, 0,9 M borsyra och 20 mM EDTA i 1 L vatten (Ampuwa). PH för bufferten är åtta. |
| MÄN buffert (10x) | Lös 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc, 10 mM EDTA i 1 L vatten (Ampuwa). Justera pH-värdet med NaOH till 7. |
Tabell 6: Cellodlingsmedium och buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MRNA-behandling har en enorm potential inom området regenerativ medicin, behandling av sjukdomar och vaccination. I denna video visar vi framställning av en stabiliserad, modifierat mRNA för induktion av proteinuttryck i celler. Med hjälp av detta protokoll, kan andra önskade mRNA genereras. In vitro-syntes av modifierade mRNA tillåter transfektion av celler med önskade mRNA för att inducera uttryck av målproteiner. Därigenom är det önskade proteinet uttryckas transient under fysiologiska betingelser till dess att exogent levererad mRNA är helt nedbruten.
I den här videon, var ett uttryck för eGFP visats i 3 dagar efter en enda transfektion av HEK293 celler med eGFP mRNA. mRNA-molekyler som kodar andra proteiner skulle kunna leda till en kortare proteinexpressionsperioden. Expressionen av proteinet minskar på grund av nedbrytning av den exogent levererad mRNA. Därför begränsning av denna teknik för some applikationer kan vara övergående induktion av proteinuttryck. Således, för att upprätthålla proteinuttryck i celler för en längre period, krävs upprepad leverans av mRNA. Även mRNA transfektion har fördelen av icke-integration in i värdgenomet, vilket förhindrar insertionsmutationer och utvecklingen av cancer och leukemi jämfört med virala vektorer, kan in vivo-transfektionseffektiviteten vara mindre än med användning av virala vektorer.
Den erforderliga mRNA koncentrationen och mängden av transfektionsreagens bör optimeras för varje olika celltyp 14, vilka är målcellerna för exogen tillförsel av mRNA för att producera det saknade proteinet.
Upprepad frysning och upptining av mRNA bör undvikas för att upprätthålla stabiliteten i det producerade mRNA. Därför kan arbets portioner förberedas. Efter PCR och IVT, bör endast ett enda specifikt band detekteras. Annars, det antal PCR-cykler, primer AnneaLing temperatur och / eller mängden av plasmid-DNA bör optimeras för att erhålla den specifika DNA-produkt för IVT. Vidare kan IVT tid och mängden av DNA-schablon för IVT optimeras för att erhålla mRNA från en specifik längd i tillräckliga mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Projektet har finansierats av Europeiska socialfonden i Baden-Württemberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM, high glucose | PAA | E15-009 | |
| FBS | Life Technologies | 10500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | 100x |
| L-glutamine | PAA | M11-004 | 200 mM |
| DPBS without calcium and magnesium | PAA | E15-002 | |
| 0.04% Trypsin / 0.03% EDTA | Promocell | C-41020 | |
| TNS | Promocell | C-41120 | Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Consumables | |||
| Tissue culture plates, 12-well | Corning | 3512 | |
| Cell culture flask (75 cm2) | Corning | 430641 | |
| DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 121.589 | Safe-Lock, Biopur |
| 15 ml conical tubes | greiner bio-one | 188271 | |
| PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips | Eppendorf | 10 µl: 022491202; 100 µl: 022491237; 1,000 µl: 022491253 | |
| Cryovial | greiner bio-one | 122279-128 | Cryo.s |
| 14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture | BD Falcon | 352059 | |
| Plasmid amplification and purification | |||
| pcDNA 3.3_eGFP Plasmid | Addgene | 26822 | |
| One Shot Top10 chemically component Escherichia coli | Invitrogen | C4040-10 | |
| Sterile water (Ampuwa) | Fresenius Kabi | 1636071 | |
| LB medium (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | Dissolve 25 g L-1 in sterile water. |
| LB agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | Dissolve 40 g L-1 in sterile water. |
| Ampicillin Ready Made Solution | Sigma Aldrich | A5354 | 100 mg/ml |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G2025 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| mRNA production | |||
| HotStar HiFidelity Polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| MEGAscript T7 Kit | Life Technologies | AM1334 | |
| 5-Methylcytidine-5´-triphosphate | Trilink | N1014 | 5-Methyl-CTP |
| Pseudouridine-5´-triphosphate | Trilink | N1019 | Pseudo-UTP |
| 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structure analog | New England Biolabs | S1411L | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 U/µl |
| TURBO DNase | Life Technologies | AM1334 | 2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit) |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | MO289S | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNaseZap solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Transfection | |||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Cationic lipid transfection reagent |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Invitrogen | 11058-021 | Improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows a reduction of Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation |
| Gel electrophoresis | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Gelred Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | 10,000x in water |
| peqGOLD Range Mix DNA-Ladder | Peqlab | 25-2210 | |
| Flow cytometry analyses | |||
| CellFIX (1x) | BD Biosciences | 340181 | 10x concentrate |
| Primer for insert amplification and poly (T) tail PCR | |||
| Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ |
|
| Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM | Ella Biotech | 5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ |
|
| Equipment | |||
| Cell incubator | Binder | CO2 (5%) and O2 (20%) | |
| CASY cell counter | Schärfe System | ||
| Sterile workbench | BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH | ||
| Bacterial incubator | Incutec | ||
| Water bath | |||
| ScanDrop spectrophotometer | Analytic Jena | ||
| PCR thermocycler | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Vortex | peqlab | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Gel apparatus for electrophoresis | Bio-Rad | ||
| Gel documentation system | Bio-Rad | ||
| FACScan System | BD Biosciences | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Phase-contrast microscope | Zeiss | ||
References
- Bangel-Ruland, N., et al. CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis "gene therapy". The journal of gene medicine. , (2013).
- Benteyn, D., et al. Design of an Optimized Wilms" Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134 (2013).
- Petsch, B., et al. Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection. Nature. 30, 1210-1216 (2012).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature protocols. 8, 568-582 (2013).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).
- Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).
- Anderson, B. R., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23, 165-175 (2005).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).
- Avci-Adali, M., et al. Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression. Journal of biological engineering. 8, 8 (2014).
