Abstract
فيروس غرب النيل الموهن (بحمى غرب النيل)، وابنيوي (NS) 4B-P38G متحولة، التي يسببها خلوى أعلى الفطري واستجابات الخلايا T من النوع البري بحمى غرب النيل في الفئران. في الآونة الأخيرة، النخاعي عامل التمايز 88 تم عرض (MyD88) يشير إلى أن تكون مهمة لالأولي فتيلة الخلايا T والتنمية خلية ذاكرة T خلال بحمى غرب النيل NS4B-P38G العدوى متحولة. في هذه الدراسة، وهما تتدفق على أساس أساليب الخلوي - في المختبر T خلية فتيلة فحص وتلطيخ خلوى داخل الخلايا (ICS) - استخدمت لتقييم الخلايا الجذعية (DCS) وظائف الخلايا التائية. في الخلية T فتيلة الفحص، تم تحليل تكاثر الخلايا التدفق الخلوي التالية ثقافة مشتركة من البلدان النامية من كلا المجموعتين من الفئران مع استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) - وصفت خلايا CD4 + T OTII من الفئران المعدلة وراثيا. قدم هذا النهج تحديد دقيق لنسبة تكاثر الخلايا CD4 + T مع تحسن كبير في الحساسية الشاملة من التقليدآل المقايسات مع الكواشف الإشعاعية. تم استخدام نظام أنبوب microcentrifuge في كل إجراءات زراعة الخلايا وتلطيخ خلوى البروتوكول ICS. بالمقارنة مع النظام القائم على لوحة زراعة الأنسجة التقليدية، وكان هذا الإجراء تعديل أسهل للأداء على المستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق. وعلاوة على ذلك، تم علاج WNV- الخلايا المصابة مع امتصاص العرق في كل من المقايسات، والتي مكنت مزيد من التحليل خارج مرافق BL3. عموما، هذه المقايسات المناعية في المختبر يمكن استخدامها لتقييم كفاءة الاستجابات المناعية الخلوية خلال العدوى بحمى غرب النيل.
Introduction
فيروس غرب النيل (بحمى غرب النيل)، وهو موجه للعصب، بالإضافة إلى لمست-الفيروسة المصفرة، يشكل تهديدا للصحة العامة الناشئة. حاليا، وقد تمت الموافقة على أي لقاحات للاستخدام البشري 1. سلالة بحمى غرب النيل الموهن، التي لديها إجراء تبديل P38G في ابنيوي (NS) البروتين 4B، ومن المعروف للحث على أي الفتك في الفئران ولكن السيتوكينات أعلى الفطرية واستجابات الخلايا T في الفئران من النوع البري بحمى غرب النيل NY99 سلالة 2. تحصين الفئران مع متحولة NS4B-P38G كانت كلها محمية من التحدي الثانوي مع قاتلة من النوع البري بحمى غرب النيل. وهذا يوحي بأن متحولة NS4B-P38G لديها ميزات مناسبة لمرشح اللقاح المثالي. الآليات التي متحولة NS4B-P38G يدفع عالية على التكيف الحصانة الواقية ليست مفهومة بشكل واضح حتى الان. تول مثل مستقبلات (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، وتلعب دورا أساسيا في الشروع في المناعة الفطرية للعدوى الفيروسية. مسار الأساسية TLR إشارات يستخدم استجابة التمايز الابتدائي الدم النخاعي جنرال الكتريكشمال شرق 88 (MyD88) كما محول الأساسي 3،4. في دراسة حديثة، تبين MyD88 الإشارات للعب دورا هاما في تطوير خلايا مناعة بوساطة خلال العدوى بحمى غرب النيل متحولة NS4B- P38G في الفئران 5. خلايا تغصنية (DCS) هي واحدة من الخلايا العارضة للمستضد أهم واظهار قدرة فريدة لبدء T الأساسي استجابات الخلايا خلال العدوى الفيروسية 6،7. CD4 + CD8 + T والخلايا على حد سواء يساهم في مناعة وقائية طويلة الأمد ومهمة من أجل البقاء المضيف التالية من النوع البري الإصابة بحمى غرب النيل 8،9. واستخدمت اثنين من المقايسات المناعية في هذه الدراسة لتقييم وظائف هذه الخلايا في NS4B-P38G متحولة إصابة الفئران.
أولا، تم استخدام وفتيلة فحص في المختبر T الخلية لمقارنة قدرة العارضة للمستضد من البلدان النامية من المصابين بحمى غرب النيل من النوع البري وMyD88 - / - الفئران. لزيادة حساسية الفحص، ساذج CD4 <سوب> + تم عزل خلايا T OTII من الفئران المعدلة وراثيا والتي تعبر محددة Vα2 / Vβ5 TCR للألبومين البيض والدجاج (OVA) الببتيد 323 - 339. وتنقيته من البلدان النامية بحمى غرب النيل الفئران المصابة، وشارك في تربيتها مع carboxyfluorescein succinimidyl عيد الفصح (CFSE ) -labeled خلايا CD4 + T في وجود OVA الببتيد. بعد 5 أيام من شارك في الثقافة، وكان حصاد الخلايا وثابتة مع بارافورمالدهيد (PFA) وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد أجريت فحوصات التكاثري تقليديا من خلال إدماج 5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) أو معالج بالتريتيوم ديوكسي ريبوزيد الثايمين (3 HTdr) 10. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات إما المشعة و / أو في حاجة إلى معدات خاصة على مستوى السلامة الأحيائية (BL) 3 المرافق، حيث يتم إجراء دراسات بحمى غرب النيل. تحليل تدفق cytometric من انتشار الخلايا اللمفاوية التي كتبها بمقدار النصف التسلسلي للكثافة مضان من صبغ الحيوي أصبح CFSE أكثر شيوعا المستخدمة في المقايسات المناعية كما أن الصبغة هي أكثر ثابتوأدرجت بالتساوي في الخلايا، والكشف بسهولة عن طريق التدفق الخلوي، وغير امشع 11. لديه الفحص أيضا القدرة على تقييم عدد من انقسامات الخلية. واحد الميزة الرئيسية لاستخدام هذا الاختبار في الدراسات بحمى غرب النيل هو أن تثبيت للخلايا المصابة 1-2٪ PFA يمكن إبطال مفعول بحمى غرب النيل 12، مما سيمكن الحصول على عينة مع تدفق عداد الكريات في مختبر BL2.
وبعد ذلك، تم استخدام إجراء تعديل الخلايا تلطيخ خلوى (ICS) لدراسة دور MyD88 الإشارات في تنظيم بحمى غرب النيل استجابات الخلايا T محددة في NS4B-P38G الفئران المصابة متحولة. في هذا الاختبار، وعولج splenocytes معزولة عن الفئران المصابة بحمى غرب النيل في المختبر مع الببتيدات محددة. وأضيف Brefeldin والإبقاء على السيتوكينات داخل الخلية. بعد 5 ساعة الحضانة، تم حصاد الخلايا، وغسلها وملطخة للT مجموعات فرعية الخلية. تم خلايا ثم ثابتة في PFA، permeabilized وملطخة للفيروسات (IFN) -γ وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.كما هو الحال مع غيرها من تدفق الفحص القائمة على الخلوي، مرة واحدة يتم التعامل مع الخلايا مع تثبيت وعازلة permeabilization تحتوي على PFA، والعينات المصابة يمكن نقلها إلى مختبر BL2 لمزيد من المعالجة والتحليل. في العديد من الدراسات المنشورة، وقد استخدمنا ICS لقياس وظائف T المستجيب الخلايا في الفئران المصابة بحمى غرب النيل 13،14. على الرغم من انها راسخة، عيب رئيسي واحد من هذا الاختبار هو أن هذا الإجراء هو طويل جدا ويمكن أن يكون أكثر استهلاكا للوقت عندما يؤديها داخل مرافق BL3. هنا، تبين وجود طريقة ICS أساس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة لتكون أكثر جدوى، وأسهل على المضي قدما وأقل استهلاكا للوقت عندما تتم داخل مختبر BL3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة تكساس الفرع الطبي.
1. عزل البلدان النامية من الفئران غير المصابة والمصابين بحمى غرب النيل
- مباراة السن ونوع الجنس 6-10 أسابيع من العمر، من النوع البري C57BL / 6 (B6) وMyD88 - / - الفئران. تطعيم داخل الصفاق (IP) مع 500 لوحة تشكيل وحدة (PFU) من بحمى غرب النيل NS4B- P38G متحولة. في يوم 3 بعد العدوى، الموت ببطء MyD88 B6 و- / - الفئران مع CO 2. استخدام الفئران غير المصابة من كلا الفريقين والضوابط. استخدام ثلاثة الفئران من كل مجموعة.
- الفراء الرطب على الجانب الأيسر من الماوس ضحى باستخدام الايثانول 70٪ وخفض بعيدا الفراء على طول الجانب الأيسر من الفأرة، حوالي منتصف الطريق بين الأمام والخلف الساقين. قطع فتح تجويف الجسم. إزالة الطحال باستخدام ملقط. وضع الطحال في طبق بيتري مع RPMI.
- عزل البلدان النامية الطحال باستخدام حبات مغناطيسية مكافحة CD11c وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
2. تنقية ووسمها T خلايا من الفئران المعدلة وراثيا OTII
- حصاد الطحال واحدة من الماوس OTII السذاجة كما هو موضح في الخطوة 1.2 أعلاه والتجانس الطحال بين طرفي بلوري من شريحتين. نقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة RPMI متوسطة تصل إلى 14 مل. السماح للتعليق الجلوس لمدة 5 دقائق ونقل 13 مل منه إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
- عزل خلايا CD4 + T الطحال باستخدام CD4 + T العزلة خلية عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- نقل الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني مع ألبومين المصل البقري 0.5٪ (BSA) في 1 × 10 6 خلايا لكل مل، وإضافة 0.5 ميكرومول / مل من CFSE. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ومحمية من الضوء.
- إضافة 5 مل المتوسطة كاملة البارد (RPMI-1640 مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني، 1/100 المجلدالمضادات الحيوية / antimycotics، 1/100 المجلد L-الجلوتامين و 1 / 1،000 المجلد 1،000 × 2-المركابتويثانول).
- احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وتحديد 0.2 × 10 6 المسمى خلايا CD4 + T في 2٪ PFA والحصول على تدفق عداد الكريات. استخدام هذه العينة لتحديد مستوى القاعدية من CFSE. إعادة تعليق ما تبقى من الخلايا المسمى في المتوسط كاملة.
3. المشارك الثقافة OTII الخلايا التائية مع البلدان النامية من المصابين بحمى غرب النيل الفئران
- ثقافة 2 × 10 5 تنقية خلايا CD4 + T من الفئران OTII وحدها أو مع البلدان النامية المنقى من النوع البري أو MyD88 - / - الفئران (2 × 10 4) في 24 لوحة جيدا مع أو بدون OVA بقايا 323-339 (1 ز / مل) في 1 مل المتوسطة الكامل لكل بئر.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام. حصاد الخلايا، ويغسل مرتين في FACS العازلة (PBS مع 1٪ FBS) وإصلاح في 0.25 مل 2٪ PFA. دوامة فورا.
4. تحليل تدفق الخلوي في المختبر </ م> T خلية الاشعال
- لشراء، انقر نقرا مزدوجا فوق الرمز التدفق الخلوي البرمجيات. لمؤامرة الكثافة الخطي FSC-A مقابل الخطي SSC-A، قنوات مختارة 0 إلى 200،000 في FSC-A و0 إلى 200،000 في SSC-A. ثم إنشاء بوابة على الخلايا الحية (P2؛ انظر الشكل 1A).
- لتحليل كثافة مضان من CFSE، فتح الرسم البياني للقناة FL1 والحصول على 20،000 الأحداث على السكان بوابات. انشاء علامة على عينات لخلايا OTII مثقف وحدها (الشكل 1A).
- الحصول على عينات لخلايا OTII شارك في تربيتها مع من النوع البري البلدان النامية (الشكل 1B) أو MyD88 - / - البلدان النامية (الشكل 1C) بطريقة مشابهة.
5. عزل وتحفيز Splenocytes لخلوى فحوصات
- تصيب B6 وMyD88 - / - الفئران مع بحمى غرب النيل NS4B-P38G متحولة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الظريفص 1.1. في يوم 30 بعد الإصابة، وإعادة التحدي على قيد الحياة الفئران بعام 2000 PFU من النوع البري بحمى غرب النيل السلالة الملكية الفكرية وفي أيام 8 و 21 إصابة بحمى غرب النيل في مرحلة ما بعد الأساسي أو في يوم 4 التالية العدوى الثانوية، الموت ببطء الفئران مع CO 2 لجمع الطحال .
ملاحظة: استخدمنا 2-3 الفئران في كل مجموعة عن كل نقطة زمنية. - جعل تعليق خلية واحدة من splenocytes كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2 و 2.2 خطوة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وإعادة تعليق عليها في 10 مل المتوسطة كاملة.
- تمييع الخلايا مع المتوسطة كاملة إلى 2.5 × 10 6 خلية / مل. إضافة 1 مل من splenocytes في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة.
- لمحاكاة خلايا CD8 + T، وتمييع NS4B وE الببتيدات بحمى غرب النيل محددة (SSVWNATTA وIALTFLAV) إلى 1 ملغ / مل في DMSO. لتحفيز خلايا CD4 + T، وتمييع NS3 وE الببتيدات بحمى غرب النيل محددة (RRWCFDGPRTNTILE وPVGRLVTVNPFVSVA) إلى 1 ملغ / مل في DMSO. إضافة 10 ميكرولتر من الببتيدات على الخلايا اتباعها!د بنسبة 1 ميكرولتر من Brefeldin حل. استخدام الخلايا من دون علاج الببتيدات والضوابط. مزيج من الخلايا.
- لكمة اثنين من الثقوب مع G إبرة 18 في الحد الأقصى من الأنبوب. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة.
6. بين الخلايا تلطيخ خلوى
- نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي الجديد. تدور خلايا لمدة 5 دقائق على 300-400 x ج وتصب قبالة طاف. إضافة 1 مل FACS العازلة، وتدور 5 دقائق على 300-400 x ج واعادة تعليق الخلايا قبل pipetting مع 120 ميكرولتر FACS العازلة.
- إضافة 2 ميكرولتر التيسير مانع واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة 1 مل FACS العازلة لكل أنبوب. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س.
- اعادة تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة وتقسيمها إلى ثلاثة أنابيب (حوالي 0.8 × 10 6 خلايا في أنبوب). كما هو مبين في الجدول رقم 1، نحتفظ أنبوب الأول من كل شرط الثقافة لالفئران مفتش-PE تلطيخ. لأنبوب الثاني، إضافة 3 ميكرولتر من مكافحة CD4 APC إلى CD4 الببتيدات المعالجة الخلايا، 3 μلتر من مكافحة CD8 FITC إلى الخلايا المعالجة الببتيدات CD8 أو كليهما الأجسام المضادة لخلايا من دون علاج الببتيدات. استخدام أنبوب ثالث لتعويض تلطيخ. لكل حالة والثقافة، واستخدام ثلاثة أنابيب الخلايا ملطخة APC-مترافق CD4، CD8 FITC مترافق أو PE- المسمى الأجسام المضادة CD3 وحده (3 ميكرولتر في أنبوب) والضوابط التعويض عن FL1، FL2 وقنوات FL4.
- خلايا دوامة لفترة وجيزة. ترك على الجليد لمدة 20 دقيقة وحمايتها من الضوء. إضافة 1.4 مل FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج وتصب قبالة طاف.
- تستنهض الهمم لعرقلة بيليه خلية (أو لفترة وجيزة الدوامة). اعادة تعليق الخلية بيليه في 250 ميكرولتر تثبيت / permeabilization solutionby pipetting ل. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، وحماية من الضوء.
- إضافة 1.2 مل FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج و resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر FACS العازلة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، والخلايا يمكن نقلها إلى مختبر BL2 لمزيد من المعالجة أو تخزينها في الثلاجة وحمايتها من الضوء لأجلكp لثلاثة أيام. - إضافة 500 ميكرولتر FACS العازلة. تدور 5 دقائق على 300-400 x ج و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من 1X العازلة permeabilization / غسل. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س.
- اعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر 1X بيرم / غسيل، إضافة 3.5 ميكرولتر مكافحة IFNγ-PE إلى أنبوب أضاف سابقا مع الأجسام المضادة للCD4 و / أو CD8 T علامات خلية في الخطوة 6.3 و 3.5 ميكرولتر الفئران مفتش-PE في أنبوب محفوظة من أجل السيطرة مفتش لمدة 25 دقيقة على الجليد وحماية من الضوء. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1.4 مل من 1X العازلة permeabilization / غسل. تدور 5 دقائق على 300-400 ز س. كرر الخطوة غسل بإضافة 1.4 مل 1X permeabilization / غسل العازلة.
- تدور 5 دقائق على 300-400 x ج وصب طاف. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1.4 مل من العازلة FACS واعادة تعليق في 400 ميكرولتر من العازلة FACS لاقتناء النهائي.
7. تحليل تدفق الخلوي من بين الخلايا تلطيخ خلوى
- استخدام الإعدادات اكتساب نفس كما في الخطوة 4.1. بجمعية العقاراتالشركة المصرية للاتصالات بوابة على الخلايا الحية (P2؛ انظر الشكل 2A). ضبط الفولتية باستخدام أنابيب التعويض عن كل مجموعة.
- فتح اثنين نقطة جديدة المؤامرات، واحدة لعرض البيانات التي تم جمعها لFL1 مقابل. FL2 (CD8 مقابل. IFN-γ)، والآخر هو لعرض البيانات التي تم جمعها لFL4 مقابل. FL2 (CD4 مقابل. IFN-γ). اكتساب 50،000 الأحداث للسكان بوابات من كل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في فحص الخلايا التائية فتيلة، كانت CFSE المسمى خلايا CD4 + T مثقف مع البلدان النامية المنقى من NS4B-P38G المصابة متحولة من النوع البري وMyD88 - / - الفئران في وجود أو عدم وجود الببتيدات OVA. خلايا T وصفت مثقف وحدها مع أو بدون OVA لتم استخدام 5 أيام والضوابط السلبية. كما هو مبين في الشكل 1A، وبوابات مجموع الخلايا T لتحليل كثافة مضان على قناة FL1. تم تعيين علامة حتى على أساس المسمى حديثا خلايا CD4 + T في يوم من 0 إلى تحديد معدل انتشار دون ثقافة مشتركة من البلدان النامية. كان هناك مستوى منخفض من معدل انتشار (1.6٪) تحت هذا الشرط الثقافة. تم استخدام نفس علامة لتحديد معدل انتشار خلايا CD4 + T شارك في تربيتها مع البلدان النامية في 10: 1 نسبة. نظرا لنسبة عالية في الثقافة المشتركة وطبيعة التكاثري، وخلايا T يمكن بوابات على المختلطة السكان دون الفول المظهري إضافيةنينغ. كما هو مبين في الشكل 1B، كان هناك معدل انتشار 87.0٪ في البرية من نوع مجموعة كما هو مبين في ممثل واحد من ثلاث عينات المعالجة في ظل نفس الظروف. وعلاوة على ذلك، CFSE المسمى خلايا T شارك في تربيتها مع البلدان النامية من MyD88 - / - الفئران في حضور OVA كان معدل انتشار 74.5٪ (الشكل 1C). وهكذا، فإن معدل انتشار الخلايا OT II CD4 + T شارك في تربيتها مع البلدان النامية من NS4B-P38G المصابة متحولة MyD88 - كان الفئران أقل من تلك المشارك مثقف مع البلدان النامية من البرية من نوع الفئران - /. وتشير هذه النتائج إلى أن نقص في MyD88- يشير مسار يؤدي إلى ضعف مستضد تقديم قدرة البلدان النامية خلال NS4B-P38G العدوى متحولة.
لتحليل النتائج ICS، فإننا بوابات على إجمالي splenocytes معزولة عن البرية من نوع الفئران في يوم 8 بعد الإصابة (الشكل 2A)، والنسب المئوية للسكان المزدوج الموجب (CD4 <سوب> + + IFNγ وكانت CD8 + IFNγ +) في عينة تمثيلية واحدة 0.4٪ و 1.7٪ على التوالي. نسب CD4 + IFNγ + CD8 + وIFNγ + من إجمالي splenocytes بوابات في واحدة عينة تمثيلية من MyD88 - / - كانت الفئران بنسبة 0.2٪ و 0.6٪ على التوالي (الشكل 2B). ولوحظ عدم وجود فروق في السكان المزدوج إيجابية من المجموعتين من splenocytes دون علاج الببتيدات (لا تظهر البيانات). وأجريت تحليلات مماثلة مع splenocytes معزولة عن غير المصابة، من النوع البري وMyD88 - / - الفئران (أرقام 2C و 2D). النسب المئوية للالمزدوج إيجابية السكان (CD4 + IFNγ + CD8 + وIFNγ +) بين المجموعتين كانت لا تختلف. وعلاوة على ذلك، في الشكل 2A، السكان إيجابي واحد من CD4كانت + CD8 + T والخلايا 21٪ و 13.3٪ من إجمالي بوابات splenocytes. في حين، وعرضت عليهم أن يكونوا 15.9٪ و 11.2٪ من MyD88 - / - splenocytes (الشكل 2B). بالمقارنة مع المجموعات المصابة، والاختلافات في نسبة السكان إيجابي واحد بين اثنين من غير المصابين البرية من نوع وMyD88 - / - الفئران كانت أقل بكثير (19.1٪ مقابل 18.4٪ للخلايا CD4 + T، 15.7٪ مقابل. 13.3٪ للخلايا CD8 + T). مجتمعة معا، خفضت كل من CD4 + CD8 + T واستجابات الخلايا في MyD88 - / - الفئران بالمقارنة مع مجموعة من النوع البري في يوم 8 بعد NS4B- P38G العدوى متحولة. تم إجراء تحليل مماثل للعينات التي تم جمعها في يوم 21 بعد العدوى. كما هو مبين في الشكل 3A و 3B، نسبة CD4 + + IFNγ من إجمالي splenocytes في MyD88 <وكانت مجموعة (0.1٪) أقل قليلا من مجموعة من النوع البري (0.2٪) - سوب> - /. كان فريق (17٪) أقل من ذلك أيضا من النوع البري مجموعة (20.6٪) - السكان إيجابي واحد من الخلايا CD4 + T في MyD88 - /. في المقابل، لا نسبة CD8 + + IFNγ ولا كانت نسبة السكان إيجابي واحد من الخلايا CD8 + T المختلفة بين المجموعتين. في يوم 4 عدوى ما بعد الثانوي، والنسب المئوية للسكان إيجابي مزدوج (CD4 + IFNγ + CD8 + وIFNγ +) في واحدة كانت عينة تمثيلية من النوع البري مجموعة 0.3٪ و 0.5٪ على التوالي (الشكل 4A). نسب CD4 + IFNγ + CD8 + وIFNγ + من إجمالي splenocytes بوابات في واحدة عينة تمثيلية من MyD88 - / - كانت مجموعة 0.1٪ و 0.2٪ (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، كان عدد السكان إيجابي واحد من الخلايا CD4 + CD8 + T و18.7٪ و 15.8٪ من إجمالي splenocytes البرية من نوع الفئران. في حين تم تخفيض هذه النسبة كما 12.1٪ و 12.3٪ في MyD88 - / - الفئران (الشكل 4B). في ملخص لهذه النتائج، وتشارك MyD88 الإشارات في تنشيط الخلايا T الأولي كل من السكان ويساهم في استجابة الخلايا CD4 + T في مرحلة لاحقة من العدوى. وتشارك أيضا في الذاكرة CD4 + CD8 + T واستجابات الخلايا.
الشكل 1: DC القدرة في البرية من نوع وMyD88 العارضة للمستضد - / - الفئران خلال العدوى NS4B- P38G CFSE المسمى CD4 + T الخلايا وشارك مثقف وحدها (A) أو مع البلدان النامية من بحمى غرب النيل-NS4B-P38G mutant- المصابين من النوع البري (B) وMyD88 - / - الفئران (C) في حضور OVA 323-339. تم حصاد الخلايا في يوم 5، بوابات على خلايا T على أساس FSC / SSC (من اليسار الألواح) وتحليلها لمعدلات انتشارها (لوحات اليمين). وظهر أحد الممثلين من ثلاث عينات في كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 2: استجابات الخلايا T في مرحلة مبكرة من الإصابة بحمى غرب النيل NS4B-P38G تم عزل Splenocytes من بحمى غرب النيل NS4B-P38G mutant- المصابين من النوع البري (A) وMyD88 - / - الفئران (B) في يوم 8. والضوابط، كانت تحصد splenocytes من غير-infected البرية من نوع (C) وMyD88 - / - الفئران (D). كانت الخلايا المستزرعة خارج الحي مع الببتيدات بحمى غرب النيل لمدة 5 ساعة، تحصد، والملون لIFNγ وCD4 أو CD8. تم بوابات مجموع splenocytes من كل مجموعة (P2) وتحليلها. المؤامرات نقطة المبينة لممثل واحد من ثلاث عينات في كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 3: استجابات الخلايا T في مرحلة متأخرة من الإصابة بحمى غرب النيل NS4B-P38G تم عزل Splenocytes من بحمى غرب النيل NS4B-P38G mutant- المصابين من النوع البري (A) وMyD88 - / - الفئران (B) في يوم 21. خلايا كانوا السابقين مثقف فيفو مع بحمى غرب النيلالببتيدات لمدة 5 ساعة، تحصد، والملون لIFN-γ CD4 أو CD8 و. تم بوابات مجموع splenocytes من كل مجموعة (P2) وتحليلها. وظهر أحد الممثلين من ثلاث عينات في كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استجابات الخلايا T خلال التحدي الثانوي مع من النوع البري بحمى غرب النيل الفئران التي نجت من العدوى الأولية مع بحمى غرب النيل NS4B-P38G متحولة أعيد المصابة مع LD 100 من النوع البري بحمى غرب النيل. في يوم 4 عدوى ما بعد الثانوي، تم عزل splenocytes من بحمى غرب النيل NS4B-P38G mutant- المصابين من النوع البري (A) وMyD88 - / - الفئران (B). كانت الخلايا المستزرعة خارج الحي مع الببتيدات بحمى غرب النيل لمدة 5 ساعة، harveSTED، والملون لIFN-γ CD4 أو CD8 و. تم بوابات مجموع splenocytes من كل مجموعة (P2) وتحليلها. وظهر أحد الممثلين من ثلاث عينات في كل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بحمى غرب النيل هو الممرض BL3. بسبب لوائح السلامة والمقايسات المناعية مع عينات المصابة بحمى غرب النيل وغالبا ما تقتصر من قبل توافر المعدات في BL3 مرافق أو أكثر طويلة ومملة لأداء. في دراسة حديثة، استخدمنا طريقتين القائم على التدفق الخلوي لدراسة الخلية بوساطة الاستجابات المناعية أثناء الإصابة بحمى غرب النيل 5. في كل من المقايسات، وعولج الخلايا المصابة بحمى غرب النيل مع 1-2٪ PFA مباشرة أو مع الحل تثبيت / permeabilization تحتوي على 4٪ PFA. ومن المعروف أن 1٪ PFA تثبيت الخلايا المصابة بالفيروسات يمكن أن تقلل بشكل فعال عدد الجسيمات المعدية أقل من حدود الكشف عن 12. لذلك، على حد سواء أساليب خفضت بشكل كبير من الوقت الأداء داخل مرافق BL3. هناك العديد من المقايسات التي أنشئت لقياس T تكاثر الخلايا، بما في ذلك من خلال إدماج BrdU أو ثيميدين المشعة، وتدفق استنادا الخلوي في المختبر T خلية فتيلة فحص باستخدام CFSE المسمى خلايا T OTII قدمت موره تحديد دقيق لنسبة تكاثر الخلايا CD4 + T مع تحسن كبير في الحساسية بشكل عام. هنا، 10: تم استخدام نسبة 1 للخلايا البلدان النامية وT لتحديد كفاءة القدرة تقديم المستضد خلال العدوى بحمى غرب النيل. ينصح المعايرة جرعة لدراسة وظائف DC خلال العدوى مع الممرض آخر، كما أن هذه النسبة قد تختلف. ICS هو تدفق يشيع استخدامها فحص لدراسة استجابات الخلايا T محددة مستضد الخلوي القائم. ومع ذلك، فإن الإجراء هو مطول، ويشمل زراعة الخلايا وخطوات متعددة من غسل وتلطيخ للخلايا. ومن المحتمل مزعجة عند تنفيذ في مرافق BL3. لقد تعديل البروتوكول بحيث تم تحفيز الخلايا في البداية مع بحمى غرب النيل الببتيدات محددة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة بدلا من لوحة نسيج الثقافة. وبعد ذلك، تم غسلها الخلايا والملون داخل أنابيب الطرد المركزي الصغيرة بدلا من أنابيب مخروطية. وقد مكنت هذه التعديلات العملية برمتها التي يتم تنفيذها داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائيةباستخدام آلة الطرد المركزي الصغيرة، التي قضت على إجراء تعقيم للالطرد المركزي الخلايا خارج مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تم الحصول على خلايا أيضا في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة التي تدفق عداد الكريات. وعموما، كان نظام أنبوب الطرد المركزي الجزئي توفير الوقت والجهد (حوالي 2 ساعة) في ICS مقارنة مع لوحة زراعة الأنسجة فحص التقليدية القائمة. وأخيرا، لا يوجد لديك طريقة أنبوب microcentrifuge شرط أداة خاصة، وهو اقتصادي ويوفر المزيد من المرونة في الأداء. وبالإضافة إلى ذلك، كان من الأسهل على أداء وأقل استهلاكا للوقت، والتي زادت في نهاية المطاف بقاء الخلية (لا تظهر البيانات). وهناك قلق السلامة قاصر واحد بسبب استخدام 18 G إبرة في إنشاء ثقافة الخلية لICS.
التحقيق في الآلية التي بحمى غرب النيل NS4B-P38G متحولة يحرض يمكن استخدامها مناعة وقائية أعلى كنموذج للمساعدة في تطوير الرشيدة للقاحات أخرى الفيروسة المصفرة الموهنة الحية فعالة. باستخدام ICS في المختبر T المقايسات فتيلة الخلية، وأظهرنا أن يشير MyD88 مهم لتطوير الخلية بوساطة الحصانة التكيف خلال بحمى غرب النيل NS4B-P38G العدوى متحولة. لا الاختبار هو محدد مصممة للبحمى غرب النيل. أنها يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم وظائف الخلية البلدان النامية وT مع مع وكلاء BL3 الآخرين المصابين عينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
