Abstract
Ослабленных вирусов Западного Нила (WNV), неструктурных (NS), 4B-P38G мутант, индуцированной выше врожденную цитокинов и Т-клеточный ответ, чем дикого типа у мышей WNV. Недавно миелоидной фактор дифференциации 88 (MyD88) сигналов было показано, что важно для первоначального грунтовки Т-клеток и развитие Т-клеток памяти во WNV NS4B-P38G мутантного инфекции. В этом исследовании две течь методы, основанные на цитометрии - в пробирке Т-клеток грунтовки анализа и внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) - были использованы для оценки дендритные клетки (DC) и функции Т-клеток. В Т-клетки заливной анализа, пролиферации клеток анализировали с помощью проточной цитометрии после совместного культуры ДК с обеих группах мышей с карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) - помечены CD4 + Т-клетки OTII трансгенных мышей. Такой подход обеспечил точное определение процента пролиферирующих лимфоцитов CD4 + Т-клеток со значительно улучшилось общее чувствительность, чем традицииаль-анализов с радиоактивными реагентами. Система микроцентрифужных трубки был использован как в культуре клеток, и цитокин окрашивания процедур протокола ICS. По сравнению с традиционной системой пластины на основе культуры ткани, этот модифицированный порядок проще было выполнить на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов. Кроме того, WNV- инфицированные клетки обрабатывали параформальдегидом в обоих анализах, которые позволили дальнейшего анализа за пределами BL3 объектов. В целом, эти в пробирке иммунологические анализы могут быть использованы для оценки эффективного клеточно-опосредованные иммунные ответы в течение WNV инфекции.
Introduction
Вирус Западного Нила (ЛЗН), нейротропные, плюс зондирования флавивирус, является новым угрозу для здоровья населения. В настоящее время нет вакцины не были одобрены для использования человеком 1. Ослабляется WNV штамма, который имеет замену P38G в неструктурного (NS) 4B белка, как известно, не вызывают не летальность у мышей, но выше, врожденные цитокинов и Т-клеточный ответ у мышей, чем дикого типа штамма WNV NY99 2. Мышей, иммунизированных мутантом NS4B-P38G все были защищены от вторичного заражения летальной дикого типа WNV. Это говорит о том, что мутант NS4B-P38G имеет соответствующие возможности для кандидата в идеальном вакцины. Механизмы, посредством которых мутант NS4B-P38G индуцирует высокие защитные адаптивного иммунитета не ясно еще понял. Toll-подобные рецепторы (TLRs), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, играют важную роль в инициации врожденного иммунитета к вирусной инфекции. Сигнальный путь TLR ядро использует миелоидный дифференциация первичного ответа GENE 88 (MyD88) в качестве основного адаптера 3,4. В недавнем исследовании, сигнализация MyD88 было показано, играют важную роль в развитии клеточный иммунитет во время ЛЗН NS4B- P38G мутанта инфекции у мышей 5. Dentritic клетки (ДК) являются одним из наиболее важных антиген-представляющих клеток, обладающих уникальной способности инициировать реакцию первичного Т-клеток при вирусной инфекции 6,7. CD4 + и CD8 + Т-клетки и способствуют длительной защитного иммунитета и имеют важное значение для выживания хозяина после дикого типа ЛЗН инфекции 8,9. Два иммунологические анализы были использованы в данном исследовании для оценки функции этих клеток у мутантных мышей, инфицированных NS4B-P38G.
Во-первых, грунтовки анализа в пробирке Т-клеток использовали для сравнения антиген-представляющих возможность ДКС WNV-инфицированных дикого типа и MyD88 - / - мышей. Для повышения чувствительности анализа, наивный CD4 <SUP> + Т-клетки были выделены из OTII трансгенных мышей, которые выражают специфику Vα2 / Vβ5 TCR для курицы яичного белка (OVA) пептид 323 - 339. ДК ЛЗН инфицированных мышей были очищены, и совместно культивировали с карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый Пасхи (CFSE ) меченных CD4 + Т-клетки в присутствии пептида OVA. После 5 дней совместного культивирования клетки собирали и фиксировали параформальдегидом (PFA) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Пролиферативные анализы традиционно осуществляется посредством включения 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) или тритием тимина deoxyriboside (3) 10 HTdr. Тем не менее, эти анализы либо радиоактивных и / или нуждаются в специальных оборудования на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов, где WNV исследования, проведенного. Анализ проточной цитометрии пролиферации лимфоцитов путем последовательного сокращения вдвое интенсивности флуоресценции витальным красителем CFSE стала более широко используется в иммунологических анализах, как краситель является более стабильнои равномерно включены в клетках, обнаруживается легко с помощью проточной цитометрии, и нерадиоактивных 11. Анализ также имеет возможность оценить количество клеточных делений. Одно из главных преимуществ использования этого теста в исследованиях ЛЗН, что фиксация инфицированных клеток с 1-2% PFA может инактивировать ЛЗН 12, что позволит приобретение пример с проточной цитометрии в BL2 лаборатории.
Далее, процедура модифицированного внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) был использован для изучения роли MyD88 сигнализации в регуляции ЛЗН конкретных ответов Т-клеток в NS4B-P38G мутантных-инфицированных мышей. В этом анализе спленоцитов, выделенных из инфицированных мышей обрабатывали в пробирке с WNV конкретных пептидов. Брефелдин был добавлен, чтобы сохранить цитокинов в клетке. После 5 ч инкубации клетки собирали, промывали и окрашивали на Т-клеток подмножеств. Затем клетки фиксировали в PFA, проницаемыми и окрашивали в течение интерферона (IFN) -γ и анализировали с помощью проточной цитометрии.Как и в другом потоке анализа на основе цитометрии, когда клетки обрабатывают с фиксацией и пермеабилизации буфере, содержащем PFA, инфицированные образцы могут быть переданы в BL2 лаборатории для дальнейшей обработки и анализа. В нескольких опубликованных исследований, мы использовали ICS для измерения Т клеточных функций эффекторных в WNV-инфицированных мышей 13,14. Хотя это хорошо известно, один главный недостаток данного метода является то, что процедура очень длительная и может быть более трудоемким, когда выполняются внутри BL3 объектов. Здесь метод ИКС микро-центрифужные пробирки на основе было показано, что более реально, проще, чтобы продолжить и меньше времени, когда выполняется в BL3 лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены уходу и использованию комитета животных в университете штата Техас медицинского отделения мимо.
1. Выделение домена от не-инфицированных и ЛЗН-инфицированных мышей
- По возрасту и полу матч 6-10-недельных дикого типа C57BL / 6 (В6) и MyD88 - / - мышей. Привить внутрибрюшинно (IP) с 500 бляшкообразующих единицы (БОЕ) ЛЗН NS4B- P38G мутанта. В 3-й день после заражения, усыпить B6 и MyD88 - / - мышей с CO 2. Используйте неинфицированных мышей обеих групп в качестве контроля. Использование трех мышей из каждой группы.
- Мокрый мех на левой стороне жертву мыши, используя 70% этанола и срезать шерсть с левой стороны мыши, примерно на полпути между передней и задней ноги. Разрежьте полость тела. Удалить селезенки с помощью пинцета. Поместите селезенки в чашке Петри с RPMI.
- Изолировать селезенки РС с помощью анти-CD11c магнитных шариков в соответствии синструкции завода-изготовителя.
2. Очистка и маркировка Т-клетки OTII трансгенных мышей
- Урожай один селезенки от наивных OTII мыши, как описано в этапе 1.2 выше, и гомогенизации селезенки между матовыми концами на двух слайдов. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку, добавить RPMI среду до 14 мл. Пусть подвеска сидеть в течение 5 мин и передать 13 мл этом новом 15 мл коническую трубку.
- Изолировать селезенки CD4 + Т-клеток с использованием набора изоляторе CD4 + T в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Передача клеток в 50 мл коническую трубку, дважды промывали PBS. Ресуспендируют клеток в PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1 × 10 6 клеток на мл, и добавить 0,5 мкмоль / мл CFSE. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин в защищенном от света.
- Добавить 5 мл холодного полной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1/100 обантибиотики / противогрибковые, 1/100 т L-глутамина и 1/1000 об из 1000 х 2-меркаптоэтанола).
- Инкубируют на льду в течение 5 мин. Промывают клетки один раз PBS, фиксируют 0,2 × 10 6 меченных CD4 + Т-клеток в 2% PFA и приобрести на проточном цитометре. Используйте этот образец, чтобы определить исходный уровень CFSE. Re-приостановить отдых меченых клеток в полной среде.
3. Сотрудничество культуры OTII Т-клеток ДК ЛЗН-инфицированных мышей
- Культура 2 х 10 5 очищенных CD4 + Т-клетки мышей OTII в одиночку или с очищенной ДК дикого типа или MyD88 - / - мышей (2 х 10 4) в 24-луночного планшета с или без OVA остатка 323-339 (1 г / мл) в 1 мл полной среды на лунку.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 дней. Урожай клетки, мыть два раза в FACS буфере (PBS с 1% FBS) и зафиксировать в 0,25 мл 2% PFA. Vortex немедленно.
4. проточной цитометрии в пробирке </ EM> Т-клеток Грунтовка
- Для приобретения, дважды щелкните проточной цитометрии значок программного обеспечения. Для плотности участка линейного FSC-против линейного SSC-А, выберите каналы от 0 до 200000 на FSC-A и от 0 до 200000 на SSC-А. Затем создайте ворота на живые клетки (P2; рис 1а).
- Для анализа интенсивности флуоресценции CFSE, открыть гистограмму для канала FL1 и приобрести 20000 событий на закрытом населения. Настройка маркер на образцах для OTII клеток, культивируемых в одиночку (Рисунок 1А).
- Приобретение образцы для OTII клеток, культивируемых совместно с ДК дикого типа (фиг.1В) или MyD88 - / - DCS (рисунок 1c) аналогичным образом.
5. Выделение и стимуляция спленоцитах для анализа на цитокины
- Infect B6 и MyD88 - / - мышей с WNV NS4B-P38G мутанта с использованием той же процедуры, как описано в STEр 1,1. В 30-й день после инфицирования, повторно задача выживших мышей с 2000 БОЕ дикого типа WNV штамма ИС на 8 дней и 21 после первичной инфекции WNV или на 4 день после вторичной инфекции, эвтаназии мышей с CO 2 для сбора селезенки ,
Примечание: Мы использовали 2-3 мышей на группу для каждой временной точки. - Сделать суспензии отдельных клеток спленоцитов, как описано выше в стадии 1,2 & 2,2 шага. Граф клеток с использованием гемоцитометра и вновь приостановить их в 10 мл полной среды.
- Развести клетки с полной среде до 2,5 × 10 6 клеток / мл. Добавить 1 мл спленоцитов в 1,5 мл микро-центрифужную пробирку.
- Для моделирования CD8 + Т-клеток, разбавленные WNV конкретных NS4B и Е пептиды (SSVWNATTA и IALTFLAV) до 1 мг / мл в ДМСО. Для стимуляции CD4 + Т-клеток, разбавленные WNV конкретных NS3 и Е пептиды (RRWCFDGPRTNTILE и PVGRLVTVNPFVSVA) до 1 мг / мл в ДМСО. Добавить 10 мкл пептидов к клеткам followed по 1 мкл раствора брефелдин A. Использование клеток без обработки пептидов в качестве контрольной группы. Смешайте клетки.
- Удар два отверстия с помощью 18 G иглы в крышке пробирки. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 часов.
6. Внутриклеточные окрашивание цитокинов
- Передача клетки к новому микро-центрифуги трубы. Спин клетки в течение 5 мин при температуре 300-400 мкг и слейте супернатант. Добавить 1 мл FACS буфера, спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и вновь приостановить клеток с помощью пипетки с 120 мкл FACS буфера.
- Добавить 2 мкл Fc блокатор и инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую пробирку. Спин 5 мин при 300 - 400 х г.
- Повторное приостановить клеток в 300 мкл FACS буфера и разделить их на три трубки (около 0,8 х 10 6 клеток на пробирку). Как показано в таблице 1, резервировать первую трубку каждого условия культивирования для крыс IgG-PE окрашивания. Для второй трубы, добавляют 3 мкл анти-CD4 APC с CD4 пептидов-обработанные клетки, 3 μл анти-CD8 FITC с CD8 пептиды-обработанных клеток или обоих антител к клеткам без пептидов лечения. Используйте третий трубку для окрашивания компенсации. Для каждого состояния культуры, используют три трубки клеток, окрашенных APC-сопряженных CD4, FITC-конъюгированного CD8 или ПЭ меченых CD3 только антител (3 мкл на пробирку), как контроль компенсации за FL1, FL2 и FL4 каналов.
- Вихревые клетки кратко. Оставьте на льду в течение 20 мин и защищать от света. Добавить 1,4 мл FACS буфера. Спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и слейте супернатант.
- Перемешивайте, чтобы сорвать осадок клеток (или, коротко вихрь). Повторное приостановить осадок клеток в 250 мкл фиксации / пермеабилизации solutionby пипетки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин и защищать от света.
- Добавить 1,2 мл FACS буфера. Спин 5 мин при 300-400 мкг в и ресуспендирования клеток в 300 мкл FACS буфера.
Примечание: В этот момент клетки могут быть переданы в лабораторию BL2 для дальнейшей обработки или хранить в холодильнике и защищен от света для ир до трех дней. - Добавить 500 мкл FACS буфера. Спин 5 мин при 300-400 мкг в и ресуспендирования клеток в 500 мкл 1x буфер пермеабилизации / стирки. Спин 5 мин при температуре 300-400 х г.
- Повторное приостановить клеток в 100 мкл 1x Пермский край / штат Вашингтон, добавить 3,5 мкл анти-IFN,-PE к трубе ранее добавленного с антителами для CD4 и / или CD8 Т-клеточных маркеров в шаге 6.3 и 3.5 мкл крысы IgG-PE в трубке защищены для контроля IgG в течение 25 мин на льду и защищать от света. Вымойте клеток путем добавления 1,4 мл 1x пермеабилизации / промывочного буфера. Спин 5 мин при температуре 300-400 х г. Повторите этап промывки путем добавления 1,4 мл 1x пермеабилизации / промывочного буфера.
- Спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и переливать супернатант. Промыть клеток путем добавления 1,4 мл FACS буфера и вновь приостановить в 400 мкл FACS буфера для окончательного сбора.
7. проточной цитометрии внутриклеточного окрашивание цитокинов
- Используйте те же настройки сбора, как в шаге 4.1. Creaте ворота на живые клетки (P2; рис 2а). Отрегулируйте напряжение с помощью компенсационных трубы для каждой группы.
- Открыть два новых точек участки, один для отображения данных, собранных для FL1 против. FL2 (CD8 против. IFN-γ), а другой для отображения данных, собранных для FL4 против. FL2 (CD4 против. IFN-γ). Приобретать 50000 мероприятий для закрытого населения каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В Т-клеток заливной анализа, CFSE меченые CD4 + Т-клетки культивировали с очищенными ДК из NS4B-P38G мутантного-инфицированных дикого типа и MyD88 - / - мышей в присутствии или в отсутствие OVA пептидов. Меченые Т-клеток, культивируемых в одиночку или без OVA в течение 5 дней были использованы в качестве отрицательного контроля. Как показано на фиг.1А, всего Т-клетки закрытого для анализа интенсивности флуоресценции по каналу FL1. Маркер был создан на основе свежей меченых CD4 + Т-клеток на день 0, чтобы определить скорость пролиферации без совместного культивирования ДК. Был низкий уровень скорости пролиферации (1,6%) при этом условии культуры. То же маркер был использован для определения скорости пролиферации CD4 + Т-клеток, культивируемых совместно с ДК в соотношении 10: 1. Из-за их высокого коэффициента в совместной культуре и их пролиферативную природе, Т-клетки могут быть закрытого на смешанных популяций без дополнительной фенотипической STAIНин. Как показано на фиг.1В, было скорость пролиферации 87,0% в дикого типа группы, как показано на один представитель из трех образцов, обработанных при тех же условиях. Кроме того, CFSE меченных Т-клетки совместно культивируют с ДКС MyD88 - / - мышей в присутствии OVA была 74,5% скорость пролиферации (1в). Таким образом, скорость пролиферации OT II CD4 + Т-клеток культивируют совместно с ДК NS4B-P38G мутант-инфицированных MyD88 - / - мышей был ниже, чем у тех, кто сокультивировали с ДК из мышей дикого типа. Эти результаты показывают, что дефицит в MyD88- сигнального пути приводит к нарушению антигенпрезентирующей потенциала РС во NS4B-P38G мутанта инфекции.
Для анализа результатов ICS, мы закрытого на общих спленоцитов, выделенных из мышей дикого типа на 8-й день после заражения (рис 2а), в процентном двойных положительным населения (CD4 <SUP> + IFN & gamma; + и CD8 + IFN & gamma; +) в одном репрезентативной выборки были 0,4% и 1,7% соответственно. Процент CD4 + IFN & gamma; + и CD8 + IFN & gamma; + из общего числа спленоцитов закрытых на одном репрезентативной выборки MyD88 - / - мышей 0,2% и 0,6% соответственно (фиг.2В). Никаких различий не было отмечено в двойных-положительных популяций двух групп спленоцитов без пептидов лечения (данные не показаны). Похожие анализы были выполнены с спленоцитов, выделенных из неинфицированных, дикого типа и MyD88 - / - мышей (рис 2С и 2D). Процент двойной положительный популяций (CD4 + IFN, + и CD8 + IFN, +) между двумя группами не различались. Кроме того, на рисунке 2а, одного положительного популяции CD4+ И CD8 + Т-клетки 21% и 13,3% от общего объема закрытого спленоцитов. Принимая во внимание, что было показано, что 15,9% и 11,2% от MyD88 - / - спленоцитов (фиг.2В). По сравнению с зараженных групп, отличия доля одиноких положительных популяций между двумя не-инфицированной дикого типа и MyD88 - / - мышей были значительно меньше (19,1% против 18,4% за CD4 + Т-клеток, 15,7% против. 13,3% для CD8 + Т-клеток). В сочетании друг с другом, как ответы CD4 + и CD8 + Т-клеток были уменьшены в MyD88 - / - мышей по сравнению с группой дикого типа в день 8 после NS4B- P38G мутантного инфекции. Аналогичный анализ был проведен для образцов, собранных в день 21 после инфекции. Как показано на фиг.3А и 3В, процент CD4 + IFN & gamma; + из общего числа спленоцитов в MyD88 <SUP> - / - группа (0,1%) был немного ниже, чем дикого типа группы (0,2%). Одного положительного население CD4 + Т-клеток в MyD88 - / - группы (17%) был также ниже, чем у дикого типа группы (20,6%). Для сравнения, ни процент CD8 + IFN & gamma; +, ни процент населения одного положительного CD8 + Т-клеток отличается между двумя группами. В 4-й день после вторичной инфекции, проценты двойных положительных популяций (CD4 + IFN, + и CD8 + IFN, +) в один представитель образец дикого типа группы были 0,3% и 0,5% соответственно (рис 4а). Процент CD4 + IFN & gamma; + и CD8 + IFN & gamma; + из общего числа спленоцитов закрытых на одном репрезентативной выборки MyD88 - / - группы были 0,1% и 0,2% (Фиг.4В). Кроме того, одного положительного популяция клеток CD4 + и CD8 + Т-был 18,7% и 15,8% от общего количества спленоцитов мышей дикого типа. В то время как этот процент был снижен в 12,1% и 12,3% в MyD88 - / - мышей (рис 4б). В заключение этих результатов, MyD88 сигнализации принимает участие в активации Т-клеток исходной обеих популяций и способствует ответ CD4 + Т-клеток на более поздней стадии инфекции. Он также принимает участие в памяти CD4 + и CD8 + Т-клеточного ответа.
Рисунок 1:. DC антиген-представляющих способности в дикого типа и MyD88 - / - мышей в течение NS4B- P38G инфекции CFSE помечены CD4 + Т-клетки культивировали в одиночку () или с ДК ЛЗН-НС4B-P38G мутант, зараженный дикого типа (б) и MyD88 - / - мышей (C) в присутствии OVA 323-339. Клетки собирали на 5-й день, закрытый на Т-клетках, основанных на FSC / SSC (слева панели) и анализировали на скорости пролиферации (правая панели). Один из представителей трех образцов в каждой группе было показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
. Рисунок 2: Т-клеточные ответы на ранней стадии ЛЗН NS4B-P38G инфекции Спленоциты, выделенные из ЛЗН NS4B-P38G мутант инфицированных дикого типа (а) и MyD88 - / - мышей (B) на день 8. Как контроля, спленоциты собирали из без-infected дикого типа (C) и MyD88 - / - мышей (D). Клетки культивировали экс виво с WNV пептидов в течение 5 ч, собирали и окрашивали на IFN & gamma; и CD4 или CD8. Всего спленоциты из каждой группы закрытого (Р2) и анализировали. Штрих участки, показанные один представитель из трех образцов в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
. Рисунок 3: Т-клеточные ответы на поздней стадии WNV NS4B-P38G инфекции спленоциты, выделенные из WNV NS4B-P38G мутант инфицированных дикого типа (А) и MyD88 - / - мышей (б) по 21-й день клетки культивировали EX Vivo вирусом ЛЗНПептиды в течение 5 ч, собирали и окрашивали в течение IFN-γ и CD4 или CD8. Всего спленоциты из каждой группы закрытого (Р2) и анализировали. Один из представителей трех образцов в каждой группе было показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Т-клеточные ответы в процессе вторичного заражения дикого типа WNV мышей, которые выжили из первичной инфекции WNV NS4B-P38G мутанта были вновь заражен LD 100 дикого типа WNV.. В 4-й день после вторичной инфекции спленоциты выделяли из ЛЗН NS4B-P38G мутант инфицированных дикого типа (а) и MyD88 - / - мышей (б). Клетки культивировали экс естественных вирусом ЛЗН пептидов в течение 5 часов, HarveSTED, и окрашивают для IFN-γ и CD4 или CD8. Всего спленоциты из каждой группы закрытого (Р2) и анализировали. Один из представителей трех образцов в каждой группе было показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЛЗН возбудитель BL3. В соответствии с правилами техники безопасности, иммунологические анализы с образцами WNV-инфицированных часто ограничиваются наличием оборудования на BL3 объектов или более длительным и утомительным для выполнения. В недавнем исследовании мы использовали два цитометрии на основе методов проточной изучать клеточные иммунные ответы во время ЛЗН инфекции 5. В обоих анализах, WNV-инфицированные клетки обрабатывают 1-2% PFA непосредственно или с фиксацией / пермеабилизации раствора, содержащего 4% PFA. Известно, что 1% PFA фиксации клеток, инфицированных вирусом может эффективно уменьшить количество инфекционных частиц ниже предела обнаружения 12. Таким образом, оба метода значительно сократили сроки выполнения внутри BL3 объектов. Есть много установленных анализы для измерения клеточной пролиферации T, в том числе путем включения ВДУ или радиоактивного тимидина, проточной цитометрии основе в заливной анализа пробирке Т-клеток с помощью CFSE помечены OTII Т-клеток при условии, море точное определение процент пролиферирующих лимфоцитов CD4 + Т-клеток со значительно улучшенной общей чувствительности. Здесь соотношение 10: 1 по ДК и Т-клеток был использован, чтобы эффективно определить антиген потенциала представляя при WNV инфекции. Доза титрования рекомендуется для изучения функции постоянного тока во время инфекции с другого патогена, как это отношение может быть различным. ICS является широко используется проточной цитометрии на основе анализа для изучения антиген-специфических Т-клеточные реакции. Тем не менее, эта процедура занимает много времени, и включает в себя культуру клеток и несколько стадий стирки и окрашивания клеток. Это потенциально может вызвать сложности при выполнении на BL3 объектов. Мы модифицировали таким образом, что протокол клетки были первоначально стимулировали WNV конкретных пептидов в микро-центрифужную пробирку вместо ткани культурального планшета. Далее, клетки промывали и окрашивали в микро-центрифужные пробирки вместо конических труб. Эти изменения позволили весь процесс выполняется внутри биозащитойс помощью микро-центрифуги машину, которая, устранив процедуру дезинфицирующим для центрифугирования клетки вне шкафа биобезопасности. Клетки были также приобретены в микро-центрифужные пробирки по проточной цитометрии. В целом, система труба микро-центрифуги спас времени и усилий (около 2 ч), в ICS по сравнению с традиционной анализа, основанного планшета для культуры ткани. Наконец, метод микроцентрифуга трубка не имеет специальных требований прибор, который экономического и обеспечивает большую гибкость в работе. Кроме того, было легче выполнить, и отнимает много меньше времени, которое в конечном итоге увеличить жизнеспособность клеток (данные не показаны). Существует одно небольшое беспокойство безопасности в связи с использованием иглы 18 G в создании клеточной культуры для ICS.
Исследование механизма, с помощью которого WNV NS4B-P38G мутант индуцируют защитный иммунитет выше, можно использовать в качестве парадигмы, чтобы помочь в рациональной разработки других эффективных живых ослабленных вакцин флавивирусов. С помощью ICS и в пробирке Т-клеток грунтования анализов, мы показали, что передача сигналов MyD88 имеет важное значение для развития клеточного адаптивного иммунитета при ЛЗН NS4B-P38G мутанта инфекции. Ни анализа специально разработана для ЛЗН. Они также могут быть использованы для оценки DCS и Т клеточные функции с образцами-инфицированных с другими агентами BL3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
