Abstract
减毒西尼罗河病毒（WNV），非结构（NS）的4B-P38G突变，诱发较高先天细胞因子和T细胞应答比野生型WNV小鼠。近日，髓样分化因子88（MyD88的）信号被证明在WNV NS4B-P38G突变感染是初始T细胞吸和记忆性T细胞的发育很重要。在这项研究中，2流式细胞术为基础的方法- 在体外的T细胞引发测定和胞内细胞因子染色（ICS） -被用于评估树突细胞（DC）和T细胞的功能。标记OTII转基因小鼠的CD4 + T细胞-在T细胞吸试验中，细胞增殖通过流式细胞仪从两组小鼠羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）的下列DC的共培养物进行分析。这种方法提供了一种准确测定增殖的CD4 + T细胞的百分比与显著改进比传统的整体灵敏度人检测放射性试剂。微量离心管系统被用来在ICS协议的细胞培养和细胞因子染色程序。相较于传统的组织培养板为基础的系统，这个修改过程是比较容易在生物安全水平（BL）3设施进行。此外，WNV-感染的细胞与多聚甲醛在两种测定中，这使BL3设施以外进一步分析处理。总之，这些体外免疫学测定法可以用来有效地评估WNV感染期间细胞介导的免疫反应。
Introduction
西尼罗河病毒（WNV），神经营养，加黄病毒检测到，是一个新兴的公共健康威胁。目前，还没有疫苗已被批准供人类使用1。减毒WNV菌株，其具有P38G取代的非结构（NS）蛋白4B，被称为诱导小鼠没有杀伤力但较高先天细胞因子和T细胞应答的小鼠比野生型WNV NY99菌株2。免疫小鼠的NS4B-P38G突变均免受致命野生型WNV次要挑战。这表明，NS4B-P38G突变体具有合适特征的理想的候选疫苗。通过该NS4B-P38G突变导致的高保护性免疫机制尚不清楚呢。 toll样受体（TLR），其识别病原体相关分子模式，发挥在先天免疫病毒感染的启动中起重要作用。核心TLR信号通路利用骨髓分化初级反应GENE 88（MyD88的）作为主适配器3,4。在最近的一项研究中，MyD88信号被证明在小鼠5 WNV NS4B- P38G突变感染在细胞介导的免疫发展具有重要作用。树突状细胞（DC）是最重要的抗原呈递细胞表现出病毒感染6,7中以引发初级T细胞反应的独特能力之一。 CD4 +和CD8 + T-细胞既有助于长期的保护性免疫，并且下面的野生型WNV感染8,9-重要寄宿存活。两种免疫测定法在本研究中使用，以评估这些细胞在NS4B-P38G突变感染的小鼠的功能。
首先， 在体外 T细胞吸测定用于比较的DC西尼罗病毒感染的野生型和MyD88的的抗原呈递能力- / -小鼠。为了提高检测，天真CD4 <灵敏度SUP> + T细胞从OTII的转基因小鼠，其表达Vα2/Vβ5TCR特异性鸡卵白蛋白（OVA）肽323分离- 339.议会西尼罗病毒感染小鼠进行纯化，并共培养以羧基琥珀酰亚胺复活节（CFSE ）标记的CD4 + T细胞在OVA肽存在下进行。经过5天共培养，收获细胞并固定用多聚甲醛（PFA）和通过流式细胞术分析。增殖测定法已被传统上进行的，通过将5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记或氚化胸腺嘧啶脱氧核苷（3 HTdr）10掺入。然而，这些测定是要么放射性和/或需要在生物安全等级（BL）的3设施，其中，西尼罗病毒的研究进行的专用设备。的淋巴细胞增殖的活体染料CFSE标记已经变得更加普遍的免疫学测定法中使用的荧光强度的串行减半的流式细胞仪分析的染料更稳定地并均匀地掺入到细胞中，用流式细胞容易检测仪，并且非放射性11。该测定法还具有以评估细胞分裂的数目的能力。使用这种测定法中的WNV研究的一个主要优点是，感染的细胞以1-2％的PFA的固定可以灭活西尼罗病毒12，这将使样品采集在一个BL2实验室流式细胞仪。
接着，经修饰的细胞内细胞因子染色（ICS）的步骤，用于研究的MyD88的信令中的WNV特异性T细胞应答调节NS4B-P38G突变感染的小鼠中的作用。在该测定中，脾细胞从感染小鼠分离的处理在体外用WNV特异性肽。布雷菲德菌素A加入到保持在细胞内的细胞因子。后5小时温育后，收获细胞，洗涤并染色T细胞亚群。然后将细胞固定在PFA，透化染色对干扰素（IFN）-γ和通过流式细胞术分析。与其他术为基础的流测定，一旦细胞被用固定和含有PFA透化缓冲液处理过的，被感染的样品可以被转移到一个BL2实验室用于进一步处理和分析。在一些发表的研究中，我们使用的ICS测量在WNV感染的小鼠13,14的T细胞的效应子功能。虽然它的确定无疑的，此测定中的一个主要缺点是，该过程是非常冗长并且可能是更多的时间内BL3设施执行时费时。这里，微离心管系的ICS方法被证明是更可行的，更容易进行，以及更短的时间时内BL3实验室进行耗时。
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Protocol
所有的动物实验获得批准的动物护理和使用委员会在得克萨斯大学医疗分支。
来自非感染者和WNV感染的小鼠1.隔离的DC
- 年龄和性别匹配的6-10周龄，野生型C57BL / 6（B6）和MyD88的- / -小鼠。接种腹腔（IP）500空斑形成的WNV NS4B- P38G突变体单元（PFU）。在第3天感染后，安乐死B6和MyD88的- / -小鼠用CO 2。使用这两个群体为对照组的非感染小鼠。使用三只小鼠从每个组。
- 对处死小鼠用70％的乙醇左侧湿毛皮和切去毛发沿着鼠标的左侧，对正面和背面的腿之间中途。剖开体腔。通过使用镊子取出脾脏。将脾脏在培养皿用RPMI。
- 通过根据使用抗CD11c磁珠分离脾DC制造商的说明。
2.纯化及的OTII转基因小鼠T淋巴细胞标签
- 从天真OTII鼠标收获1脾如上面的步骤1.2描述和同质化的两个幻灯片磨砂两端之间的脾脏。细胞悬液转移到15毫升锥形管中，加入RPMI培养基高达14毫升让该悬浮液静置5分钟，并转移13毫升它以一个新的15毫升锥形管中。
- 通过使用根据制造商的说明一个CD4 + T细胞分离试剂盒分离脾CD4 + T细胞。
- 转移细胞到50ml锥形管中，用PBS洗两次。重悬的细胞在PBS中与0.5％牛血清白蛋白（BSA）以每毫升1×10 6个细胞，并加入CFSE 0.5微摩尔/毫升。孵育在37℃进行10分钟，避光。
- 加入5毫升冷的完全培养基（RPMI-1640，用10％热灭活的胎牛血清，1/100体积抗生素/抗真菌剂，1/100体积L-谷氨酰胺和1 / 1,000（体积）的1000×2-巯基乙醇）。
- 在冰上孵育5分钟。洗涤细胞一次，用PBS，固定0.2×10 6个标记的CD4 + T细胞在2％PFA中并获取关于流式细胞仪。使用该样品，以确定CFSE的基础水平。重新暂停标记的细胞在完全培养基中的其余部分。
3.共培养OTII T细胞与WNV感染小鼠树突状
- 培养2×10 OTII小鼠5纯化CD4 + T细胞单独或与野生型或MyD88的纯化的DCs - / -小鼠（2×10 4）在一个24孔板有或没有残余的OVA 323-339（1克/毫升）的1毫升每孔完全培养基。
- 孵育细胞在37℃5天。收获细胞，在FACS缓冲液洗两次（PBS中的1％FBS）和0.25ml的2％PFA固定。涡马上。
体外 4.流式细胞仪分析</ EM> T细胞活化
- 对于收购，双击流式细胞仪软件图标的流量。对于线性FSC-A 与线性SSC-A的密度图，选择通道0到20万FSC-A和0至20万SSC-A。然后创建活细胞上的栅极（P2;参见图1A）。
- 分析CFSE荧光强度，打开直方图为FL1通道并获取关于门控人口20000事件。上设置的样品的标志物OTII细胞单独培养（ 图1A）。
- 以类似的方式的DC（ 图1C） -采集样品OTII细胞共培养与野生型的DC（ 图1B）或MyD88的- /。
5.分离的脾细胞为刺激细胞因子测定
- 如STE描述的小鼠与用同样的步骤西尼罗病毒NS4B-P38G突变体-感染B6和MyD88的- /P 1.1。在第30天感染后，再挑战存活小鼠与2000 PFU野生型WNV菌株的ip在天8和21后的主WNV感染或在4天之后继发感染，安乐死的小鼠用CO 2收集脾脏。
注意：我们使用每组2-3只小鼠每个时间点。 - 使脾细胞的单细胞悬浮液如在步骤1.2和步骤2.2，如上所述。计数使用血球和细胞在10ml完全培养基中重新悬浮它们。
- 稀释细胞用完全培养基，以2.5×10 6个细胞/ ml。加入1毫升脾细胞在1.5ml微离心管中。
- 以模拟的CD8 + T细胞，稀释的WNV特异性NS4B和E肽（SSVWNATTA和IALTFLAV）至1mg / ml，在DMSO中。对于CD4 + T细胞的刺激，稀的WNV特异性NS3和E肽（RRWCFDGPRTNTILE和PVGRLVTVNPFVSVA）至1mg / ml，在DMSO中。添加10微升肽至followe细胞ð1微升的布雷菲德菌素一个解决方案。用无细胞治疗肽作为对照。的细胞混合。
- 冲两个孔与18G的针头，在管的盖子。孵育细胞在37℃5小时。
6.内细胞因子染色
- 转移细胞到新的微量离心管中。旋转细胞5分钟在300-400 XG和倒出上清液。加入1毫升流式细胞仪缓冲，旋转5分钟在300-400 XG和移液用120微升FACS缓冲液重新悬浮细胞。
- 添加2微升的Fc受体阻滞剂孵育细胞，在室温下放置10分钟。加入1 ml FACS缓冲液到每个管中。旋转5分钟，在300 - 400×g的。
- 在300微升FACS再悬浮细胞缓冲剂和它们分成三个管（每管约0.8×10 6个细胞）。如表1所示，保留的各培养条件大鼠IgG-PE染色第一管。对于第二个管中，加入3微升抗CD4的APC与CD4肽处理的细胞，3μ升抗CD8 FITC对CD8肽处理的细胞，或两种抗体对细胞无肽治疗。使用第三管补偿染色。对于每个培养条件，使用细胞染色与APC结合的CD4，FITC结合的CD8或PE-标记CD3抗体单独（每管3微升）作为FL1，FL2和FL4渠道补偿控制的三级管。
- 涡细胞短暂。置于冰上20分钟，避光。添加1.4毫升FACS缓冲。旋转5分钟在300-400 XG和倒出上清液。
- 煽动扰乱细胞沉淀（或简称涡）。再暂停250微升固定/通透solutionby吹打细胞沉淀。在室温下孵育20分钟，并避光。
- 添加1.2毫升FACS缓冲。旋转5分钟在300-400 XG和悬浮细胞在300微升FACS缓冲。
注意：在这一点上，细胞可以转移到BL2实验室用于进一步处理或贮存在冰箱中和避光为üp来三天。 - 加入500μlFACS缓冲。旋转5分钟在300-400 XG和悬浮细胞在500微升1个通透/洗涤缓冲液中。旋转5分钟在300-400×g的。
- 重新暂停细胞在100微升1个烫发/洗净，加3.5微升抗IFNγ-PE先前与抗体的CD4和/或CD8 + T细胞标记步骤6.3和3.5微升大鼠IgG-PE预留管加管对于IgG对照在冰上25分钟，避光。将1.4毫升1×通透/洗涤缓冲液洗涤细胞。旋转5分钟在300-400×g的。通过加入1.4毫升1X通透/洗涤缓冲液重复洗涤步骤。
- 旋转5分钟在300-400 XG，倒出上清液。将1.4毫升的FACS缓冲液，并重新悬浮于400μlFACS缓冲液进行最后采集洗涤细胞。
内细胞因子染色7.流式细胞仪分析
- 使用相同的采集的设置步骤4.1。 CREA德活细胞上的栅极（P2，参见图2A）。调整使用补偿管的每个组的电压。
- 打开两个新的散点图，一个用于显示收集FL1 VS数据。 FL2（CD8 VS IFN-γ），另一种是显示收集FL4 VS的数据。 FL2（CD4 VS IFN-γ）。获得50,000个事件对于各样品的门控群体。
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Representative Results
在T细胞吸试验中，CFSE标记的CD4 + T细胞是从NS4B-P38G突变体感染的野生型和MyD88的纯化的DC培养- / -小鼠中OVA肽的存在或不存在。标记的T细胞单独培养有或无OVA 5天用作阴性对照。 如图1A所示 ，总T细胞被门控为荧光强度对FL1通道分析。标记成立基于所述新鲜标记的CD4 + T细胞在第0天以确定细胞增殖速度，而不DC的共培养物。有这种培养条件下增殖率（1.6％）的低的水平。相同的标记用于测定CD4 + T细胞共培养的DCs以10的增殖率：1的比例。由于它们的高比率，在共培养和其增殖的性质，T细胞可以被选通的混合种群，无需额外的表型STAI宁。 如图1B所示 ，有一个87.0％的增殖速率在 野生型组如图1代表相同的条件下处理过的三个样品。此外，CFSE标记的T细胞共培养的MyD88的树突状- / -中的OVA的存在下的小鼠产生了74.5％的增殖速率（ 图1C）。因此，OT II CD4 + T细胞共培养NS4B-P38G的树突状突变感染的MyD88的增殖率- / -小鼠比那些共培养与来自野生型小鼠的DC更低。这些结果表明，在MyD88-信号通路的缺乏导致受损的抗原时NS4B-P38G突变体感染呈递DC的容量。
为了分析的ICS的结果，我们选通分离的野生型小鼠在第8天感染后（ 图2A）的总脾细胞，双阳性群体的百分数（CD4 <SUP> +IFNγ+和CD8 +IFNγ+）在一个代表性的样本分别为0.4％和1.7％。 CD4 +IFNγ+和的比例CD8 +IFNγ+门控MyD88的一个代表性样本总脾- / -小鼠分别为0.2％和0.6％（ 图2B）。没有差异，指出在两组脾细胞的双阳性种群未经肽治疗（数据未示出）。类似分析用脾细胞从非感染，野生型和MyD88的分离- / -小鼠（ 图2C与2D）。双阳性的人口百分比（CD4 +IFNγ+和CD8 +IFNγ+）之间的两组差异不显着。此外，在图2A中，单一阳性的CD4的群体+和CD8 + T细胞分别为21％，总门控脾细胞的13.3％。然而，它们被证明是15.9％和MyD88的11.2％ - / -脾细胞（ 图2B）。相比被感染群体的两个非感染野生型和MyD88的间单阳性群体的百分率的差别- / -小鼠少得多（19.1％对为CD4 + T细胞18.4％，15.7％比。对于CD8 + T细胞13.3％）。结合在一起，CD4 +和CD8 + T细胞应答降低的MyD88 - / -与野生型组在8天后NS4B- P38G突变感染小鼠。进行了类似的分析，对于在21天感染后收集的样品。 如图3A和3B中 ，总脾细胞的CD4 +IFNγ+中MyD88的<百分比SUP> - / -组（0.1％），比野生型组（0.2％）略低。 / - - CD4 + T细胞的MyD88的单阳性人群（17％）明显高于野生型组（20.6％）还低。相比较而言，CD8既不百分比+IFNγ+也不CD8 + T细胞的单阳性群体的百分率是这两个组之间不同。在4天的后继发感染，双阳性人口的百分比（CD4 +IFNγ+和CD8 +IFNγ+）在野生型组的一个代表性样本分别为0.3％和0.5％（ 图4A）。的比例CD4 +IFNγ+和CD8 +IFNγ+门控MyD88的一个代表性样本总脾- / -组分别为0.1％和0.2％（图4B）。此外，CD4 +和CD8 + T细胞的单阳性人口是18.7％和野生型小鼠的总脾细胞的15.8％。然而，这个百分比减少为12.1％，在MyD88的12.3％ - / -小鼠（ 图4B）。在这些结果的汇总，MyD88信号参与两个人群的初始T细胞活化，并有助于在以后的感染阶段的CD4 + T细胞应答。它也参与记忆CD4 +和CD8 + T细胞应答。
图1：直流抗原呈递中的野生型和MyD88的能力- / -中NS4B- P38G感染的小鼠的CFSE标记的CD4 + T细胞共培养单独（A）或与WNV-NS的树突状4B-P38G mutant-感染野生型（B）和MyD88的- / -小鼠（C）的 OVA 323-339的存在。收获细胞在第5天，选通 - 基于FSC / SSC T细胞（左小图）和对它们的增殖率（右图）进行分析。一位代表各组的三个样品的结果显示， 请点击这里查看此图的放大版本。
。图2：在WNV NS4B-P38G感染的早期阶段脾细胞从WNV NS4B-P38G分离的T细胞应答 mutant-感染野生型（A）和MyD88的- / -在8天的小鼠（B）作为对照，脾细胞非收获-感染的野生型（C）和MyD88的- / -小鼠（D）的 。细胞与WNV的肽体外培养5小时，收获，并染色IFNγ和CD4或CD8。从各组的总脾细胞进行门控（P2）并进行分析。所示的点图是一个典型每组三个样品。 请点击此处查看该图的放大版本。
。图3：在WNV NS4B-P38G感染后期脾细胞从WNV NS4B-P38G分离的T细胞应答 mutant-感染野生型（A）和MyD88的- / -在第21天的细胞的小鼠（B）中进行培养的前体内与WNV肽5小时，收获，并染色以IFN-γ和CD4或CD8。从各组的总脾细胞进行门控（P2）并进行分析。一位代表各组的三个样品的结果显示， 请点击这里查看此图的放大版本。
图4：在用野生型WNV小鼠次级挑战 ，从与WNV NS4B-P38G突变初次感染存活了再感染野生型WNV的LD 100 的T细胞应答 。在4天的后继发感染，脾细胞从WNV NS4B-P38G隔离mutant-感染的野生型（A）和MyD88的- / -小鼠（B）。细胞与WNV的肽体外培养5小时，harveSTED和染色的IFN-γ和CD4或CD8。从各组的总脾细胞进行门控（P2）并进行分析。一位代表各组的三个样品的结果显示， 请点击这里查看此图的放大版本。
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Discussion
WNV是BL3病原体。由于安全法规，免疫学检测与WNV感染的样本通常是由设备的可用性BL3设施或者更加漫长和繁琐的进行限制。在最近的研究中，我们使用了两种流式细胞仪为基础的方法西尼罗病毒感染5时，研究细胞介导的免疫反应。在这两个试验中，西尼罗病毒感染的细胞用直接或用含有4％PFA固定/透化溶液1-2％的PFA。众所周知，病毒感染的细胞的1％PFA中固定可有效降低到低于检测限12的感染性颗粒的数量。因此，这两种方法都显著降低内部BL3设施的性能时间。有许多建立测定法来测量T细胞增殖，包括那些通过的BrdU或放射性胸苷掺入，所述流式细胞术为基础的体外 T细胞引发法用CFSE标记的OTII T细胞提供了莫尔Ë准确测定的增殖CD4 + T细胞与显著提高了整体的灵敏度的百分比。这里，10：1的比例为DC和T细胞被用来高效地定义WNV感染期间的抗原呈递能力。剂量滴定建议感染另一种病原体时，研究DC功能，这个比例可能会有所不同。 ICS是一种常用的流式细胞术为基础的测定以研究抗原特异性T细胞应答。然而，该过程是冗长，并且包括细胞培养和多步洗涤和细胞的染色。在BL3设施执行时，它可能是麻烦。我们已修改协议使细胞最初刺激WNV特异性肽的微离心管中，而不是组织培养板上。接着，洗涤细胞并在微离心管中，代替锥形管内染色。这些改进都使整个过程中的生物安全柜内正在进行通过用微型离心机机，它排除了所有的消毒过程的生物安全柜外离心细胞。细胞在微离心管中通过流式细胞仪还获得。总体而言，在微离心管中的系统已保存的时间和精力（约2小时）中的ICS相对于传统的组织培养板基测定法。最后，在微量离心管方法并没有特殊的仪器的要求，这是经济，并提供了更大的灵活性在性能。此外，这是更容易执行，耗时更少，这已经最终增加细胞存活率（数据未示出）。有在建立细胞培养物为ICS由于使用为18g针1次要安全的关注。
调查由WNV NS4B-P38G突变导致更高的保护性免疫，可以用作范例的其他有效减毒活疫苗的黄病毒的合理开发援助机制。通过使用ICS和体外 T细胞引发测定法，我们已经表明，MyD88信号是用于细胞介导的适应性免疫中的WNV NS4B-P38G突变体感染的发展非常重要的。无论法是具体针对WNV。它们也可以用来评估与DC和T细胞功能的样品感染与其他BL3剂。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
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