בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

Abstract

וירוס מוחלש הנילוס המערבי (WNV), (NS) 4B-P38G מוטציה nonstructural, מושרה ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T מסוג wild-WNV בעכברים. לאחרונה, גורם בידול מיאלואידית 88 איתות (MyD88) הוצגה להיות חשוב ליחול תא T ראשוני ופיתוח תא T הזיכרון במהלך זיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. במחקר זה, שני לזרום שיטות מבוססות cytometry - במבחנה assay תא T תחול ומכתים ציטוקינים תאיים (ICS) - נוצלו כדי להעריך תאים דנדריטים (DCS) ופונקציות תא T. בתא T תחול assay, התפשטות תאים נותחה על ידי זרימת cytometry הבא שיתוף התרבות של DCs משני הקבוצות של עכברים עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) - שכותרתו תאי CD4 ⁺ T של עכברים הטרנסגניים OTII. גישה זו סיפקה קביעה מדויקת של שיעור מתרבים תאי CD4 ⁺ T עם שיפור ברגישות לכללית מאשר המסורת באופן משמעותיאל מבחנים עם ריאגנטים רדיואקטיביים. מערכת צינור microcentrifuge הייתה בשימוש בשני הליכי תרבית התאים ומכתים ציטוקינים של פרוטוקול ICS. בהשוואה למערכת מבוססת צלחת תרבית רקמה המסורתית, הליך שינוי זה היה קל יותר לביצוע ברמת בטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים. יתר על כן, טופלו תאים נגועים WNV- עם paraformaldehyde בשני מבחני, שאפשרו ניתוח נוסף מחוץ מתקני BL3. בסך הכל, ניתן להשתמש במבחנה מבחני אימונולוגיים אלה כדי להעריך ביעילות מערכת חיסונית בתיווך תא במהלך זיהום WNV.

Introduction

וירוס הנילוס המערבי (WNV), neurotropic, בתוספת חש-flavivirus, הוא איום על בריאות ציבור מתעורר. נכון לעכשיו, אין חיסונים אושרו לשימוש בבני אדם ^1. זן WNV מוחלש, שבו יש תחלופה P38G בחלבון 4B nonstructural (NS), ידוע לגרום לא קטלני בעכברים אבל ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T בעכברים מאשר wild-type WNV NY99 זן ^2. עכברים שחוסנו עם המוטציה NS4B-P38G היו מוגנים מפני כל אתגר המשני עם wild-type הקטלני WNV. הדבר מצביע על כך שיש המוטציה NS4B-P38G תכונות מתאימות למועמד אידיאלי חיסון. המנגנונים שבאמצעותם המוטציה NS4B-P38G גורמת חסינות אדפטיבית מגן גבוהה לא ברור הם הבינו עדיין. קולטנים כמו אגרה (TLRs), אשר מכירים הבקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, ממלאים תפקיד חיוני בייזום של חסינות מולדת לזיהום נגיפי. מסלול איתות TLR ליבה מנצל תגובה הראשונית בידול מיאלואידית gene 88 (MyD88) כמתאם הראשי ^3,4. במחקר שנערך לאחרונה, איתות MyD88 הוצגה לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של חסינות תא בתיווך בזיהום המוטציה WNV NS4B- P38G בעכברי ^5. תאי Dentritic (DC) הם אחד מתאי מציגי אנטיגן החשובים ביותר מציגים היכולת הייחודית ליזום תגובות תא T העיקרי בזיהום ויראלי ^6,7. CD4 ⁺ CD8 ⁺ ותאי T הן לתרום לחסינות לטווח ארוכה וחשובים להישרדות מארח בעקבות זיהום WNV wild-type ^8,9. שני מבחני אימונולוגיים שמשו במחקר זה להעריך את הפונקציות של תאים אלה בעכברים שעברו מוטציה נגועה NS4B-P38G.

ראשית, assay תחול במבחנה תא T נוצל כדי להשוות את יכולת מציגי אנטיגן של DCs של נגוע WNV wild-type וMyD88 ^{- / -} עכברים. כדי להגביר את הרגישות של assay, CD4 הנאיבי <sup> + תאי T היו מבודדים מעכברים מהונדסים OTII, המבטאים ספציפי Vα2 / Vβ5 TCR לovalbumin העוף פפטיד (OVA) 323 - 339. DCs של עכברים נגועים WNV היה מטוהרים, ושיתוף תרבותי עם carboxyfluorescein succinimidyl פסחא (CFSE ) תאי CD4 ⁺ T שכותרתו בנוכחות פפטיד OVA. לאחר 5 ימים של התרבות המשותפת, תאים נקצרו וקבוע עם paraformaldehyde (PFA) ונותחו על ידי הזרימה cytometry. מבחני שגשוג בוצעו באופן מסורתי באמצעות שילוב של 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) או deoxyriboside tritiated הטימין ⁽³ HTdr) ^10. עם זאת, מבחני אלה הם או רדיואקטיביים ו / או בצורך של ציוד מיוחד ברמת הבטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים, שבו מחקרי WNV מתבצעים. ניתוח התזרים cytometric של שגשוג לימפוציטים ידי halving הסידורי של עוצמת הקרינה של הצבע החיוני CFSE הפך נפוץ יותר במבחנים חיסוניים כצבע הוא יותר ביציבותושולב באופן שווה לתאים, זוהה בקלות על ידי cytometry זרימה, והוא nonradioactive ^11. Assay יש גם את היכולת להעריך את מספר חלוקות תא. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay זה במחקרי WNV הוא שקיבוע של התאים הנגועים ב1-2% PFA יכול להשבית ¹² WNV, אשר יאפשר רכישת מדגם עם cytometer זרימה במעבדה BL2.

בשלב הבא, הליך מכתים ציטוקינים תאיים שונה (ICS) שימש כדי ללמוד את התפקיד של MyD88 איתות ברגולציה של תגובות תא T הספציפיות WNV בעכברים הנגוע במוטציה NS4B-P38G. ב assay זה, טופלו splenocytes מבודד מעכברים נגועים במבחנה עם פפטידים ספציפיים WNV. Brefeldin התווסף ללשמור ציטוקינים בתוך התא. אחרי 5 שעות דגירה, תאים נקצרו, שטפו ומוכתמים עבור תת תא T. תאים אז היו קבועים בPFA, permeabilized ומוכתמת לאינטרפרון -γ (IFN) ונותחו על ידי זרימת cytometry.כמו עם assay זרימה אחר מבוסס cytometry, פעם אחת מטופלות התאים עם קיבעון וחיץ permeabilization מכיל PFA, ניתן להעביר דגימות נגועות למעבדה BL2 לעיבוד וניתוח נוספים. במספר מחקרים שפורסמו, השתמשנו ICS למדוד פונקציות מפעיל סלולארי T בעכברים נגוע WNV ^13,14. למרות שזה מבוסס היטב, חסרון עיקרי אחד של assay זה הוא שההליך הוא ארוך מאוד ויכול להיות זמן רב יותר כאשר היא מבוצעת בתוך מתקני BL3. כאן, שיטה מבוססת ICS צינור מיקרו צנטריפוגות הוצגה להיות יותר ריאלי, קל יותר להמשיך ופחות זמן רב כאשר היא מבוצעת בתוך מעבדה BL3.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טקסס רפואית הסניף.

1. בידוד של DCs מעכברים נגועים ללא ונגוע WNV

1. התאמה לגיל ושיסוד פעילות המינית 6-10 בן שבוע, wild-type C57BL / 6 (B6) וMyD88 ^{- / -} עכברים. לחסן intraperitoneally (IP) עם 500 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) של המוטציה WNV NS4B- P38G. ביום 3 לאחר פגיעה, להרדים MyD88 B6 ^{ו-- / -} עכברים עם CO _2. השתמש בעכברים שאינם נגועים בשתי הקבוצות שולטת. השתמש בשלושה עכברים מכל קבוצה.
2. פרווה רטובה על צד השמאלי של עכבר הקריב באמצעות אתנול 70% וחתכה את הפרווה בצד השמאלי של העכבר, כמחצית דרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות. גזור לפתוח את חלל הגוף. הסר את הטחול באמצעות המלקחיים. מניחים את הטחול בצלחת פטרי עם RPMI.
3. לבודד DCs טחול באמצעות חרוזים מגנטיים אנטי-CD11c פיהוראות היצרן.

2. טיהור ותיוג של תאי T של עכברים הטרנסגניים OTII

1. קציר טחול אחד מעכבר OTII נאיבי כמתואר בשלב 1.2 לעיל וhomogenize הטחול בין הקצוות החלבית של שתי שקופיות. מעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף בינוני RPMI עד 14 מיליליטר. בואו ההשעיה לשבת במשך 5 דקות ולהעביר 13 מיליליטר של אותו צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש.
2. בודד תאי CD4 ⁺ T טחול באמצעות ערכת בידוד תא CD4 ⁺ T על פי הוראות היצרן.
3. העברת תאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר, לשטוף פעמיים עם PBS. תאים גלולים בPBS עם אלבומין 0.5% בסרום שור (BSA) בשעה 1 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר, ולהוסיף 0.5 μmol / מיליליטר של CFSE. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מוגנות מפני אור.
4. הוסף 5 מיליליטר בינוני מלא קר (RPMI-1640 עם 10% בסרום שור עוברי חום מומת, כרך 1/100אנטיביוטיקה / antimycotics, 1/100 כרך L-גלוטמין ו 1/1000 כרך של 1000 x 2-mercaptoethanol).
5. דגירה על קרח למשך 5 דקות. לשטוף את תאי פעם עם PBS, לתקן 0.2 x 10 ⁶ תאי CD4 ⁺ T שכותרתו ב 2% PFA ולרכוש על cytometer זרימה. השתמש בדוגמה זו כדי לקבוע את הרמה הבסיסית של CFSE. מחדש להשעות את שאר תאים שכותרתו במדיום מלא.

3. תאים Co-תרבות OTII T עם DCs של עכברים נגועים WNV

1. תרבות 2 x 10 ⁵ תאים של עכברי OTII CD4 ⁺ T מטוהרים לבד או עם DCs המטוהר של wild-type או MyD88 ^{- / -} עכברים (2 x 10 ⁴⁾ בצלחת גם 24 עם או בלי שאריות OVA 323-339 (ז 1 / מיליליטר) ב 1 מיליליטר בינוני מלא בכל טוב.
2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים. קציר תאים, לשטוף פעמיים במאגר FACS (PBS עם 1% FBS) ולתקן ב0.25 מיליליטר 2% PFA. מערבולת באופן מיידי.

4. ניתוח תזרים Cytometry של במבחנה </ Em> תא T לקרקע

1. לרכישה, לחץ לחיצה כפולה על סמל תוכנת cytometry הזרימה. עבור חלקת צפיפות של יניארי FSC-מול SSC-ליניארי, ערוצים בחרו 0 עד 200,000 בFSC-ו0 עד 200,000 על SSC-. ואז ליצור שער על תאי חיים (P2, ראה איור 1 א).
2. כדי לנתח את עוצמת הקרינה של CFSE, לפתוח את ההיסטוגרמה עבור ערוץ FL1 ולרכוש 20,000 אירועים על האוכלוסייה מגודרת. הגדר את סמן על דגימות תאים בתרבית OTII לבד (איור 1 א).
3. לרכוש דוגמאות לתאי OTII שיתוף תרבותיים עם DCs wild-type (איור 1) או MyD88 ^{- / -} DCS (איור 1 ג) באופן דומה.

5. בידוד וגירוי של Splenocytes לציטוקין מבחני

1. להדביק B6 וMyD88 ^{- / -} עכברים עם המוטציה WNV NS4B-P38G באותו האופן כפי שתואר בSTEp 1.1. ביום 30 לאחר פגיעה, מחדש אתגר ששרד עכברים עם 2000 PFU של ip הזן הפראי סוג WNV בימים 8 ו -21 זיהום על-יסודי WNV או ביום 4 הבאים זיהום משני, להרדים עכברים עם CO ₂ לאוסף של טחולים .
   הערה: השתמשנו 2-3 עכברים בכל קבוצה לכל נקודת זמן.
2. הפוך השעיה תא בודדת של splenocytes כמתואר לעיל בשלב 1.2 ושלב 2.2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer מחדש להשעות אותם ב 10 מיליליטר בינוני שלם.
3. לדלל תאים עם מדיום מלא ל -2.5 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. הוסף 1 מיליליטר של splenocytes בצינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
4. כדי לדמות תאי CD8 ⁺ T, לדלל פפטידים WNV הספציפי NS4B וE (SSVWNATTA וIALTFLAV) ל1 מ"ג / מיליליטר בDMSO. לגירוי של תאי CD4 ⁺ T, לדלל פפטידים WNV הספציפי ns3 ו- E (RRWCFDGPRTNTILE וPVGRLVTVNPFVSVA) ל1 מ"ג / מיליליטר בDMSO. הוסף 10 μl של פפטידים לתאים followeד על ידי 1 μl של פתרון Brefeldin. השתמש בתאים ללא טיפול פפטידים כפקדים. מערבבים את התאים.
5. אגרוף שני חורים עם מחט G 18 בכובע של הצינור. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.

6. תאיים ציטוקין מכתים

1. העברת תאי צינור מיקרו צנטריפוגות חדשה. ספין תאים 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ, ספין 5 דקות ב300-400 XG מחדש להשעות תאים על ידי pipetting עם 120 μl FACS חיץ.
2. הוסף 2 μl חוסם Fc דגירה תאים בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. הוסף 1 מיליליטר FACS חיץ על צינור אחד. ספין 5 דקות ב300-400 x ז.
3. להשעות מחדש תאים ב300 μl FACS חיץ ולפצל אותם לשלושה צינורות (כ -0.8 x 10 ⁶ תאים לכל צינור). כפי שניתן לראות בטבלה 1, שומרים לעצמנו את הצינור הראשון של כל מצב תרבות לחולדת צביעת IgG-PE. לצינור השני, להוסיף 3 μl של אנטי-CD4 APC לCD4 תאי פפטידים שטופלו, 3 μl אנטי CD8 FITC לתאים שטופלו-פפטידים CD8 או שניהם הנוגדנים לתאים ללא טיפול פפטידים. השתמש בצינור השלישי לצביעת פיצוי. עבור כל מצב תרבות, להשתמש בשלושה צינורות של תאי CD4 מוכתמים בAPC-מצומדות, CD8 FITC- מצומדות או נוגדני PE- כותרת CD3 לבד (3 μl לכל צינור) כפקדי פיצוי על FL1, fl2 וערוצי FL4.
4. תאים בקצרה מערבולת. השאר על קרח למשך 20 דקות ולהגן מפני אור. להוסיף 1.4 מיליליטר חיץ FACS. ספין 5 דקות ב300-400 XG ויוצקים את supernatant.
5. להתסיס לשבש תא גלולה (או בקצרה מערבולת). מחדש להשעות תא גלולה ב250 pipetting solutionby הקיבעון / permeabilization μl. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ולהגן מפני אור.
6. להוסיף 1.2 מיליליטר חיץ FACS. דקות ספין 5 ב300-400 תאי XG וגלולים במאגר FACS 300 μl.
   הערה: בשלב זה, ניתן להעביר תאים למעבדה BL2 לעיבוד נוסף או לאחסן במקרר ומוגן מפני אור לup לשלושה ימים.
7. הוסף 500 μl FACS חיץ. ספין 5 דקות ב300-400 תאי XG וגלולים ב500 μl של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר 'x.
8. להשעות מחדש תאים ב100 μl 1x פרם / לשטוף, להוסיף 3.5 אנטי-IFNγ-PE μl לצינור הוסיף בעבר עם נוגדנים לCD4 ו / או סמני תא CD8 T בשלב 6.3 ועכברוש μl 3.5 IgG-PE בצינור שמורות לשליטת IgG במשך 25 דקות על קרח ולהגן מפני אור. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ permeabilization / לשטוף 1x. ספין 5 דקות ב300-400 גר 'x. חזור על שלב הכביסה על ידי הוספת 1.4 מיליליטר 1x חיץ permeabilization / לשטוף.
9. ספין 5 דקות ב300-400 XG ולמזוג supernatant. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.4 מיליליטר של חיץ FACS מחדש להשעות ב400 μl של חיץ FACS לרכישה סופית.

7. ניתוח תזרים Cytometry של תאיים ציטוקין מכתים

1. השתמש באותן הגדרות כמו בשלב הרכישה 4.1. Create שער על תאי חיים (P2, ראה איור 2 א). התאם את המתח באמצעות צינורות פיצוי לכל אחת מקבוצות.
2. שני מגרשי נקודה חדשים פתוחים, אחד כדי להציג נתונים שנאספו לFL1 vs. Fl2 (CD8 vs. IFN-γ), והשני הוא להציג נתונים שנאספו לFL4 vs. Fl2 (CD4 vs. IFN-γ). לרכוש 50,000 אירועים לאוכלוסייה מגודרת של כל דגימה.

Representative Results

בassay תא T תחול, תאי CD4 ⁺ T CFSE שכותרתו היו בתרבית עם DCs מטוהר מנגוע המוטציה wild-type NS4B-P38G וMyD88 ^{- / -} עכברים בנוכחותו או היעדריו של פפטידים OVA. תאי T שכותרתו בתרבית לבד עם או בלי OVA במשך 5 ימים שמשו כקבוצת ביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 1 א, הכולל תאי T היו סגור לניתוח של עוצמת הקרינה בערוץ FL1. הסמן הוקם על בסיס תאי CD4 ⁺ T שכותרתו הטרי ביום 0 כדי לקבוע את קצב ההתפשטות ללא שיתוף התרבות של DCs. הייתה רמה נמוכה של קצב התפשטות (1.6%) בתנאי התרבות זו. אותו הסמן שימש כדי לקבוע את שיעור ההתפשטות של תאי CD4 ⁺ T שיתוף תרבותיים עם DCs ב-10: יחס 1. בשל היחס הגבוה שלהם בשיתוף התרבות וטבע שגשוגם, יכולים להיות מגודר תאי T על האוכלוסיות המעורבות ללא stai פנוטיפי נוסףנינג. כפי שניתן לראות באיור 1, היה שיעור ריבוי 87.0% בקבוצת wild-type כפי שמוצג בנציג אחד משלוש דגימות שטופלו באותם תנאים. יתר על כן, CFSE שכותרתו תאי T שיתוף תרבותיים עם DCs של MyD88 ^{- / -} עכברים בנוכחות OVA היה שיעור ריבוי 74.5% (איור 1 ג). לפיכך, שיעור ההתפשטות של תאי OT השני CD4 ⁺ T שיתוף תרבותיים עם DCs של NS4B-P38G MyD88 נגוע מוטציה ^{- / -} העכברים היו נמוך מאלה של שיתוף תרבותי עם DCs מעכברי wild-type. תוצאות אלו מצביעות על כך שמחסור במסלול איתות MyD88- מוביל לאנטיגן לקוי הצגת יכולת של DCs במהלך זיהום המוטציה NS4B-P38G.

לנתח את תוצאות ICS, אנחנו מגודרים על splenocytes הכולל מבודד מעכברי wild-type ביום 8 לאחר זיהום (איור 2 א), אחוזי האוכלוסיות דו-חיוביות (CD4 <sup> + ⁺ IFNγ וCD8 ⁺ IFNγ ⁺⁾ במדגם מייצג אחד היו 0.4% ו -1.7% בהתאמה. אחוזי CD4 ⁺ IFNγ ⁺ CD8 ⁺ וIFNγ ⁺ של splenocytes הכולל מגודר במדגם מייצג של אחד MyD88 ^{- / -} עכברים היו 0.2% ו -0.6% בהתאמה (איור 2). לא נמצאו הבדלים באוכלוסיות דו-חיוביות של שתי קבוצות של splenocytes ללא טיפול פפטידים (מידע לא מוצג). ניתוחים דומים בוצעו עם splenocytes מבודד מ, wild-type-נגוע שאינו וMyD88 ^{- / -} עכברים (איורים 2C & 2D). אחוזי הכפול חיובי אוכלוסיות (וCD4 ⁺ IFNγ ⁺ CD8 ⁺ IFNγ ⁺⁾ בין שתי הקבוצות לא היו שונות. יתר על כן, באיור 2 א, האוכלוסיות חיוביות היחידה של CD4+ CD8 ⁺ ותאי T היו 21% ו -13.3% מכלל מגודר splenocytes. ואילו, הם הוצגו להיות 15.9% ו -11.2% מMyD88 ^{- / -} splenocytes (איור 2). בהשוואה לקבוצות נגועות, חילוקי אחוז של אוכלוסיות חיוביות יחידים בין wild-type וMyD88 שני שאינם נגועים ^{- / -} עכברים היו הרבה פחות (לעומת 19.1% 18.4% לתאי CD4 ⁺ T, 15.7% לעומת. 13.3% לתאי CD8 ⁺ T). שילוב יחד, תגובות תא שני CD4 ⁺ CD8 ⁺ T והופחתו בMyD88 ^{- / -} עכברים בהשוואה לקבוצת wild-type ביום 8 זיהום מוטציה הפוסט-NS4B- P38G. ניתוח דומה בוצע על דגימות שנאספו ביום 21 לאחר הפגיעה. כפי שניתן לראות באיור 3 א ו3B, אחוז CD4 ⁺ IFNγ ⁺ של splenocytes כולל בMyD88 <sup> - ^{/ -} קבוצה (0.1%) הייתה נמוכה במעט מקבוצת wild-type (0.2%). האוכלוסייה החיובית היחידה של תאי CD4 ⁺ T בMyD88 ^{- / -} קבוצה (17%) הייתה גם נמוכה מזה של קבוצת wild-type (20.6%). בהשוואה, לא אחוז CD8 ^{+ +} IFNγ ולא אחוז מהאוכלוסייה החיובית יחידה של תאי CD8 ⁺ T היה שונה בין שתי הקבוצות. ביום 4 זיהום על-תיכוני, אחוזי האוכלוסיות חיוביות כפולות (CD4 ⁺ IFNγ ⁺ CD8 ⁺ וIFNγ ⁺⁾ במדגם מייצג אחד מקבוצת wild-type היו 0.3% ו -0.5% בהתאמה (איור 4 א). אחוזי CD4 ⁺ IFNγ ⁺ CD8 ⁺ וIFNγ ⁺ של splenocytes הכולל מגודר במדגם מייצג אחד מMyD88 ^{- / -} קבוצה היו 0.1% ו -0.2% (איור 4). יתר על כן, האוכלוסייה החיובית היחידה של תאי CD4 ⁺ CD8 ⁺ T והייתה 18.7% ו -15.8% מsplenocytes הכולל של עכברי wild-type. ואילו, אחוז זה ירד כ12.1% ו -12.3% בMyD88 ^{- / -} עכברים (איור 4). בסיכום של תוצאות אלו, איתות MyD88 מעורבת בהפעלת תאי T הראשונית של שני האוכלוסיות ותורמת לתגובת תאי CD4 ⁺ T בשלב מאוחר יותר של זיהום. כמו כן הוא מעורב בתגובות תא זיכרון מסוג CD4 ⁺ CD8 ⁺ T ו.

איור 1:. DC היכולת בwild-type וMyD88 מציגי אנטיגן ^{- / -} עכברים במהלך זיהום NS4B- P38G תאי CD4 ⁺ T CFSE שכותרתו היו שיתוף תרבותי בלבד () או עם DCs של WNV-NS4 ב-P38G mutant- wild-type נגוע (B) וMyD88 ^{- / -} עכברים (C) בנוכחות OVA 323-339. תאים נקצרו ביום 5, מגודר בתאי T המבוססים על FSC / SSC (משמאל פנלים) ונותח לשיעורי התפשטותם (לוחות מימין). נציג אחד משלוש דגימות בכל קבוצה הראה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 2: תגובות תא T בשלב מוקדם של זיהום WNV NS4B-P38G Splenocytes בודדו מWNV NS4B-P38G mutant- נגוע wild-type (A) וMyD88 ^{- / -} עכברים (B) ביום 8. כשולטות, splenocytes נבצרו מאיwild-type -infected (C) וMyD88 ^{- / -} עכברים (D). תאים בתרבית vivo לשעבר עם פפטידים WNV במשך 5 שעות, שנקטפו, ומוכתם עבור IFNγ וCD4 או CD8. סה"כ splenocytes מכל קבוצה היה סגור (P2) ונותח. חלקות dot המוצגות הן נציג אחד משלוש דגימות בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 3: תגובות תא T בשלב מאוחר של זיהום WNV NS4B-P38G Splenocytes בודדו מWNV NS4B-P38G mutant- נגוע wild-type (A) וMyD88 ^{- / -} עכברים (B) בתאים 21. היום היו לשעבר תרבותיים vivo עם WNVפפטידים במשך 5 שעות, שנקטפו, ומוכתם עבור IFN-γ וCD4 או CD8. סה"כ splenocytes מכל קבוצה היה סגור (P2) ונותח. נציג אחד משלוש דגימות בכל קבוצה הראה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: תגובות תא T במהלך אתגר המשני עם wild-type WNV עכברים ששרדו מהדבקה ראשונית עם המוטציה WNV NS4B-P38G היו מחדש נגוע בLD ₁₀₀ של wild-type WNV.. ביום 4 זיהום על-תיכוני, splenocytes בודדו מWNV NS4B-P38G mutant- נגוע wild-type (A) וMyD88 ^{- / -} עכברים (B). תאים בתרבית vivo לשעבר עם פפטידים WNV במשך 5 שעות, הארוויSTED, ומוכתם עבור IFN-γ וCD4 או CD8. סה"כ splenocytes מכל קבוצה היה סגור (P2) ונותח. נציג אחד משלוש דגימות בכל קבוצה הראה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

WNV הוא פתוגן BL3. בשל תקנות בטיחות, מבחני אימונולוגיים עם דגימות נגועות WNV לעתים קרובות מוגבלים על ידי הזמינות של ציוד במתקנים BL3 או יותר ארוכים ומייגע לבצע. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשתי שיטות מבוססות cytometry זרימה ללמוד תגובות חיסוני בתיווך תא במהלך זיהום WNV ^5. בשני מבחני, טופלו תאים נגועים בWNV עם 1-2% PFA ישירות או עם פתרון הקיבעון / permeabilization המכיל 4% PFA. זה ידוע כי 1% קיבעון PFA של תאים נגועים בנגיף ביעילות יכול להפחית את מספרם של חלקיקים מזהמים להלן מגבלות זיהוי ^12. לכן, שתי השיטות צמצמו באופן משמעותי את זמן ביצועים בתוך מתקני BL3. יש מבחני שנקבעו רבים למדוד התפשטות תאי T, כוללים אלה באמצעות שילוב של BrdU או thymidine רדיואקטיביים, הזרימה מבוססת cytometry בassay תחול מבחנה תא T באמצעות CFSE שכותרתו תאי T OTII סיפק morקביעה מדויקת דואר של אחוז התאים מתרבים CD4 ⁺ T עם רגישות כללית השתפרה באופן משמעותי. כאן, 10: 1 לתאי T DCs ושמש להגדרת קיבולת העולה על פרק אנטיגן במהלך זיהום WNV ביעילות. טיטרציה מינון מומלצת ללמוד פונקציות DC במהלך זיהום עם הפתוגן אחר, כיחס זה עשוי להיות שונה. ICS הוא זרימה נפוץ assay ללמוד תגובות תא אנטיגן ספציפיות T cytometry מבוסס. עם זאת, ההליך הוא ארוך, וכולל תרבית תאים ושלבים מרובים של כביסה וצביעת תאים. זה עלול להיות בעייתי בעת ביצוע במתקני BL3. יש לנו שונה פרוטוקול כך שתאים היו בתחילה מגורה עם פפטידים ספציפיים WNV בצינור מיקרו צנטריפוגות במקום צלחת רקמות תרבות. בשלב הבא, תאים נשטפו ומוכתם בתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות במקום צינורות חרוטי. שינויים אלה אפשרו את התהליך כולו מתבצעים בתוך ארון בטיחות ביולוגיעל ידי שימוש במכונת מיקרו צנטריפוגות, שבטלה את הליך החיטוי לצנטריפוגה תאים מחוץ לארון הבטיחות הביולוגי. תאים גם נרכשו בצינורות מיקרו צנטריפוגות על ידי cytometer זרימה. בסך הכל, מערכת צינור מיקרו צנטריפוגות הצילה זמן ומאמץ (כ 2 שעות) בICS לעומת assay צלחת תרבית רקמה המסורתי המבוסס. לבסוף, שיטת צינור microcentrifuge אין דרישת מכשיר מיוחדת, אשר היא כלכלית ומציעה גמישות רבה יותר בביצועים. בנוסף, זה היה קל יותר לביצוע ופחות זמן רב, שעלה בסופו של כדאיות תא (מידע לא מוצג). קיים חשש אחד קטין בטיחות עקב השימוש של 18 מחט G בהקמת תרבית תאים עבור ICS.

חקירה של המנגנון שבאמצעותו המוטציה WNV NS4B-P38G גורמת חסינות גבוהה יותר יכולה להיות מנוצלת כפרדיגמה כדי לסייע בפיתוח רציונלים של חיסונים אחרים יעילים חיים מוחלשים flavivirus. באמצעות ICS ובמבחנים תחול תא מבחנה T, שהראינו כי איתות MyD88 הוא חשוב להתפתחות של חסינות אדפטיבית תא בתיווך בזיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. לא assay הוא ספציפי המיועד לWNV. הם גם יכולים לשמש כדי להעריך פונקציות תא DCs וT עם עם סוכני BL3 אחרים נגועות בדגימות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875	warm up at 37 °C
anti-CD11c magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-052-001	follow the manufacturer’s instructions
anti-CD4 magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-095-248	follow the manufacturer’s instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA residue 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-conjugated CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-conjugated CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Fixation/Permeabilization Solution	BD-Bioscience	554722
Permeabilization/wash buffer	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri flow cytometer	BD Bioscience