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Immunology and Infection

वेस्ट नील वायरस उत्परिवर्ती तनाव संक्रमण को Myd88 की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इन विट्रो विश्लेषण में

Published: November 27, 2014 doi: 10.3791/52121
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology & Immunology, The University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, The University of Texas Medical Branch, 3Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Sealy Center for Vaccine Development, The University of Texas Medical Branch

Abstract

चूहों में जंगली प्रकार WNV की तुलना में अधिक सहज साइटोकाइन और टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित एक तनु वेस्ट नील वायरस (WNV), एक nonstructural (एन एस) 4 बी-P38G उत्परिवर्ती। हाल ही में, माइलॉयड भेदभाव कारक 88 (MyD88) संकेतन WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान प्रारंभिक टी सेल भड़काना और स्मृति टी सेल के विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया था। इस अध्ययन में, दो cytometry आधारित विधियों प्रवाह - एक में इन विट्रो टी सेल भड़काना परख और एक intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) - वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) और टी सेल कार्यों का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया। OTII ट्रांसजेनिक चूहों की सीडी 4+ टी कोशिकाओं में लेबल - परख भड़काना टी सेल में, सेल प्रसार Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ चूहों के दोनों समूहों से DCs के सह-संस्कृति निम्न प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था। काफी परंपरा से समग्र संवेदनशीलता में सुधार के साथ इस दृष्टिकोण सीडी 4+ टी कोशिकाओं proliferating का प्रतिशत का सही निर्धारण प्रदान कीअल रेडियोधर्मी अभिकर्मकों के साथ assays। एक microcentrifuge ट्यूब प्रणाली आईसीएस प्रोटोकॉल के दोनों सेल संस्कृति और साइटोकाइन धुंधला प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया गया था। पारंपरिक टिशू कल्चर प्लेट आधारित प्रणाली की तुलना में, इस संशोधित प्रक्रिया जैव सुरक्षा स्तर (बीएल) 3 सुविधाओं में प्रदर्शन करने के लिए आसान था। इसके अलावा, WNV- संक्रमित कोशिकाओं BL3 सुविधाएं बाहर आगे के विश्लेषण सक्षम है, जो दोनों assays के, में paraformaldehyde के साथ इलाज किया गया। कुल मिलाकर, इन में इन विट्रो प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के कुशलतापूर्वक WNV संक्रमण के दौरान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

वेस्ट नील वायरस (WNV), एक neurotropic, प्लस-लगा flavivirus, एक उभरती हुई सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा है। वर्तमान में, कोई टीके मानव उपयोग के 1 के लिए अनुमोदित किया गया है। Nonstructural (एन एस) 4 बी प्रोटीन में एक P38G प्रतिस्थापन है, जो एक तनु WNV तनाव, जंगली प्रकार WNV NY99 तनाव 2 से चूहों में कोई चूहों में मारक लेकिन उच्च जन्मजात साइटोकिन्स और टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। NS4B-P38G उत्परिवर्ती साथ प्रतिरक्षित चूहों सभी घातक जंगली प्रकार WNV के साथ एक उच्च माध्यमिक चुनौती से संरक्षित किया गया। इस NS4B-P38G उत्परिवर्ती एक आदर्श टीका उम्मीदवार के लिए उपयुक्त सुविधाओं है कि पता चलता है। NS4B-P38G उत्परिवर्ती उच्च सुरक्षा अनुकूली उन्मुक्ति लाती तंत्र है जिसके द्वारा स्पष्ट रूप से अभी तक समझ नहीं रहे हैं। रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न पहचान जो टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), वायरल संक्रमण के लिए सहज उन्मुक्ति की दीक्षा में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। कोर TLR संकेतन मार्ग माइलॉयड भेदभाव प्राथमिक प्रतिक्रिया जीई का इस्तेमालप्राथमिक एडाप्टर 3,4 के रूप में पूर्वोत्तर के 88 (MyD88)। हाल के एक अध्ययन में, MyD88 संकेतन चूहों 5 में WNV NS4B- P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान सेल की मध्यस्थता उन्मुक्ति के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था। Dentritic कोशिकाओं (DCs) वायरल संक्रमण 6,7 के दौरान प्राथमिक टी सेल प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए अद्वितीय क्षमता का प्रदर्शन सबसे महत्वपूर्ण प्रतिजन पेश कोशिकाओं में से एक हैं। सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं को लंबे समय तक चलने वाले सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा करने के लिए योगदान और जंगली प्रकार WNV संक्रमण 8,9 निम्नलिखित मेजबान अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं दोनों। दो प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमित चूहों में इन कोशिकाओं के कार्यों का आकलन करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया।

/ - - चूहों सबसे पहले, एक में इन विट्रो टी सेल भड़काना परख WNV संक्रमित जंगली प्रकार और MyD88 की DCs के प्रतिजन पेश क्षमता तुलना करने के लिए उपयोग किया गया था। परख, भोले सीडी 4 <की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिएCFSE (WNV संक्रमित चूहों के 339. DCs शुद्ध थे, और Carboxyfluorescein succinimidyl ईस्टर के साथ सह सुसंस्कृत - समर्थन> + टी कोशिकाओं 323 (ओवीए) पेप्टाइड चिकन ovalbumin के लिए एक Vα2 / Vβ5 TCR विशिष्ट व्यक्त जो OTII ट्रांसजेनिक चूहों से अलग थे ओवीए पेप्टाइड की उपस्थिति में) -labeled सीडी 4+ टी कोशिकाओं। सह संस्कृति के 5 दिनों के बाद, कोशिकाओं को काटा गया और paraformaldehyde (पीएफए) के साथ तय की और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया। Proliferative assays के पारंपरिक रूप से पाँच-ब्रोमो-2'- deoxyuridine (BrdU) या tritiated थाइमिन deoxyriboside (3 HTdr) 10 के समावेश के माध्यम से बाहर किया गया है। फिर भी, इन assays रेडियोधर्मी और / या WNV अध्ययनों का आयोजन कर रहे हैं, जहां जैव सुरक्षा स्तर (बीएल) 3 की सुविधा है, पर विशेष उपकरणों की जरूरत में या तो कर रहे हैं। CFSE अधिक सामान्यतः बन प्रतिरक्षाविज्ञानी assays में इस्तेमाल किया गया है महत्वपूर्ण डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता के धारावाहिक संयोग से लिम्फोसाइट प्रसार के प्रवाह cytometric विश्लेषण डाई अधिक है stably है के रूप मेंऔर समान रूप से, कोशिकाओं में शामिल प्रवाह cytometry द्वारा आसानी से पता लगाया है, और 11 nonradioactive है। परख भी कोशिका विभाजन की संख्या का आकलन करने की क्षमता है। WNV अध्ययन में इस परख का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ 1-2% पीएफए ​​के साथ संक्रमित कोशिकाओं का निर्धारण एक BL2 प्रयोगशाला में एक प्रवाह cytometer के साथ नमूना अधिग्रहण सक्षम हो जाएगा जो WNV 12, निष्क्रिय कर सकता है।

इसके बाद, एक संशोधित intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) प्रक्रिया MyD88 NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमित चूहों में WNV विशेष टी सेल प्रतिक्रिया के नियमन में संकेत की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस परख में, संक्रमित चूहों से अलग splenocytes WNV विशिष्ट पेप्टाइड्स के साथ इन विट्रो में इलाज किया गया। Brefeldin एक कोशिका के भीतर साइटोकिन्स बनाए रखने के लिए जोड़ा गया है। 5 घंटा ऊष्मायन के बाद, सेल, काटा धोया और टी सेल सबसेट के लिए दाग रहे थे। कोशिकाओं तो, पीएफए ​​में तय permeabilized और इंटरफेरॉन (IFN) -γ के लिए दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया।कोशिकाओं निर्धारण और पीएफए ​​युक्त permeabilization के बफर के साथ व्यवहार कर रहे हैं एक बार अन्य फ्लो आधारित परख के साथ के रूप में, संक्रमित नमूने आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के लिए एक BL2 प्रयोगशाला को हस्तांतरित किया जा सकता है। कई प्रकाशित अध्ययन में, हम WNV संक्रमित चूहों 13,14 में टी सेल प्रेरक कार्यों को मापने के लिए आईसीएस का इस्तेमाल किया है। यह अच्छी तरह से स्थापित है, हालांकि, इस परख की एक बड़ी खामी प्रक्रिया बहुत लंबी है और BL3 सुविधाओं के अंदर प्रदर्शन किया जब खपत अधिक समय हो सकता है। इधर, एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब आधारित आईसीएस विधि अधिक संभव आसान आगे बढ़ने के लिए और कम समय एक BL3 प्रयोगशाला के भीतर किया जब खपत होना दिखाया गया था।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों टेक्सास चिकित्सा शाखा के विश्वविद्यालय में पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

संक्रमित-गैर और WNV संक्रमित चूहों से DCs 1. अलगाव

  1. उम्र और sex- मैच 6-10 सप्ताह पुरानी, ​​जंगली प्रकार C57BL 6 / (बी -6) और MyD88 - / - चूहों। Intraperitoneally (आईपी) WNV NS4B- P38G उत्परिवर्ती के 500 पट्टिका गठन इकाई (pfu) के साथ टीका लगाना। / - - सीओ 2 के साथ चूहों 3 दिन के बाद संक्रमण से कम, बी -6 और MyD88 euthanize। नियंत्रण के रूप में दोनों समूहों के गैर संक्रमित चूहों का प्रयोग करें। प्रत्येक समूह से तीन चूहों का प्रयोग करें।
  2. गीले 70% इथेनॉल का उपयोग का बलिदान माउस के बाईं ओर फर और सामने और पीछे के पैरों के बीच आधे रास्ते के बारे में, माउस के बाएं ओर के साथ फर दूर काटा। शरीर गुहा खुले में कटौती। संदंश का उपयोग करके तिल्ली निकालें। RPMI के साथ एक पेट्री डिश में तिल्ली रखें।
  3. के अनुसार विरोधी CD11c चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके प्लीहा DCs पृथकनिर्माता के निर्देशों।

2. शोधन और OTII ट्रांसजेनिक चूहों की टी कोशिकाओं की लेबलिंग

  1. एक भोले OTII माउस से हार्वेस्ट एक तिल्ली से ऊपर 1.2 चरण में वर्णित है और दो ​​स्लाइड के पाले सेओढ़ लिया सिरों के बीच तिल्ली homogenize के रूप में। 14 मिलीलीटर RPMI मध्यम जोड़ने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण। निलंबन 5 मिनट के लिए बैठते हैं और एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को इसके बारे में 13 मिलीलीटर हस्तांतरण करते हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सीडी 4+ टी सेल अलगाव किट का उपयोग करके प्लीहा सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग।
  3. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, पीबीएस के साथ दो बार धो लें। Resuspend मिलीलीटर प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं में 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पीबीएस में कोशिकाओं, और CFSE के 0.5 μmol / मिलीलीटर जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ 5 मिलीलीटर ठंड पूरा मध्यम (RPMI-1640 जोड़ें, 1/100 वॉल्यूमएंटीबायोटिक दवाओं / antimycotics, 1/100 वॉल्यूम एल glutamine और 1000 एक्स 2-मर्केप्टोइथेनाल के 1/1000 खंड)।
  5. 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। धो कोशिकाओं एक बार पीबीएस के साथ, 2% पीएफए ​​में 0.2 एक्स 10 6 में लेबल सीडी 4+ टी कोशिकाओं को ठीक करने और एक प्रवाह cytometer पर अधिग्रहण। CFSE के बेसल स्तर निर्धारित करने के लिए इस नमूने का प्रयोग करें। पूरा मध्यम में लेबल कोशिकाओं के बाकी फिर से निलंबित।

WNV संक्रमित चूहों की DCs के साथ 3. सह संस्कृति OTII टी कोशिकाओं

  1. संस्कृति 2 एक्स 10 OTII चूहों के 5 शुद्ध सीडी 4+ टी कोशिकाओं अकेले या जंगली प्रकार या MyD88 का शुद्ध DCs के साथ - / - के साथ या ओवीए अवशेषों 323-339 के बिना एक 24 अच्छी तरह से थाली में चूहों (2 एक्स 10 4) (1 ग्राम अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पूरा मध्यम में / एमएल)।
  2. 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। हार्वेस्ट कोशिकाओं (1% FBS के साथ पीबीएस) FACS बफर में दो बार धोने और 0.25 मिलीग्राम 2% पीएफए ​​में तय कर लो। भंवर तुरंत।

इन विट्रो में 4. फ्लो विश्लेषण </ Em> टी सेल भड़काना

  1. अधिग्रहण के लिए, डबल सॉफ्टवेयर आइकन प्रवाह cytometry क्लिक करें। एसएससी-ए पर 200,000 FSC-ए पर दो लाख और 0 के लिए रेखीय FSC-ए बनाम रैखिक एसएससी-ए के एक घनत्व साजिश, चुनिंदा चैनलों 0 के लिए। (; चित्रा 1 ए देख p2) तब जीवित कोशिकाओं पर एक गेट बनाने के लिए।
  2. CFSE की प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए, FL1 चैनल के लिए हिस्टोग्राम खुला और gated जनसंख्या पर 20,000 घटनाओं के अधिग्रहण। अकेले सुसंस्कृत (चित्रा 1 ए) OTII कोशिकाओं के लिए नमूनों पर एक मार्कर सेट करें।
  3. जंगली प्रकार DCS (चित्रा 1 बी) या MyD88 साथ सह सुसंस्कृत OTII कोशिकाओं के लिए नमूने हासिल - / - DCS (चित्रा 1C) एक समान तरीके से।

5. अलगाव और cytokine Assays के लिए Splenocytes की उत्तेजना

  1. काएं में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती साथ चूहों - / - बी -6 और MyD88 संक्रमितपी 1.1। दिन में 30 के बाद संक्रमण से कम, फिर से चुनौती दिनों 8 और माध्यमिक संक्रमण के बाद 21 के बाद प्राथमिक WNV संक्रमण या 4 दिन में कम से जंगली प्रकार WNV तनाव आईपी के 2000 pfu के साथ चूहों जीवित, spleens के संग्रह के लिए सीओ 2 के साथ चूहों euthanize ।
    नोट: हम हर समय बिंदु के लिए समूह के प्रति 2-3 चूहों का इस्तेमाल किया।
  2. कदम 1.2 और 2.2 कदम में ऊपर वर्णित के रूप में splenocytes की एक एकल कक्ष निलंबन बनाओ। एक hemocytometer और का उपयोग कोशिकाओं की गणना 10 एमएल पूरा मध्यम में उन्हें फिर से निलंबित।
  3. 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पूरा मध्यम के साथ कोशिकाओं पतला। एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में splenocytes के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. DMSO में 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर WNV-विशिष्ट NS4B और ई पेप्टाइड्स (SSVWNATTA और IALTFLAV), सीडी 8 + टी कोशिकाओं अनुकरण पतला करने के लिए। सीडी 4+ टी कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए, DMSO में 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर WNV-विशिष्ट NS3 और ई पेप्टाइड्स (RRWCFDGPRTNTILE और PVGRLVTVNPFVSVA) पतला। Followe कोशिकाओं को पेप्टाइड्स के 10 μl जोड़ेंBrefeldin एक समाधान की एक μl द्वारा डी। नियंत्रण के रूप में पेप्टाइड्स इलाज के बिना कोशिकाओं का प्रयोग करें। कोशिकाओं मिलाएं।
  5. ट्यूब की टोपी में एक 18 जी सुई के साथ दो छेद पंच। 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।

6. Intracellular Cytokine धुंधला

  1. एक नया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण। 300-400 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन और सतह पर तैरनेवाला बंद डालना। 300-400 XG पर 1 मिलीलीटर FACS बफर, स्पिन 5 मिनट जोड़ें और 120 μl FACS बफर के साथ pipetting द्वारा कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं।
  2. 2 μl एफसी अवरोधक जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं सेते हैं। प्रत्येक ट्यूब 1 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें। स्पिन 300 पर 5 मिनट - 400 x जी।
  3. 300 μl FACS में कोशिकाओं से निलंबित पुन बफर और तीन ट्यूब (ट्यूब प्रति के बारे में 0.8 x 10 6 कोशिकाओं) में उन्हें विभाजित। तालिका 1 में दिखाया गया है, चूहा आईजीजी पीई धुंधला के लिए प्रत्येक संस्कृति हालत की पहली ट्यूब सुरक्षित रखते हैं। दूसरी ट्यूब के लिए, सीडी 4 के लिए विरोधी सीडी 4 एपीसी के 3 μl जोड़ने पेप्टाइड्स इलाज कोशिकाओं, 3 μसीडी 8 पेप्टाइड्स इलाज कोशिकाओं या पेप्टाइड्स इलाज के बिना कोशिकाओं को दोनों एंटीबॉडी के लिए विरोधी सीडी 8 FITC के एल। मुआवजा धुंधला के लिए तीसरे ट्यूब का प्रयोग करें। प्रत्येक संस्कृति हालत के लिए, एपीसी संयुग्मित सीडी 4, FITC संयुग्मित सीडी 8 या FL1, FL2 और FL4 चैनलों के लिए मुआवजा नियंत्रण के रूप में अकेले पीई लेबल किया CD3 एंटीबॉडी (ट्यूब प्रति 3 μl) के साथ दाग कोशिकाओं के तीन ट्यूब का उपयोग करें।
  4. संक्षेप में भंवर कोशिकाओं। 20 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दो और प्रकाश से रक्षा करते हैं। 1.4 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें। 300-400 XG पर 5 मिनट के स्पिन और सतह पर तैरनेवाला बंद डालना।
  5. सेल गोली (या संक्षेप में भंवर) को बाधित करने के लिए आंदोलन। 250 μl निर्धारण / permeabilization के solutionby pipetting में सेल गोली फिर से निलंबित। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और प्रकाश से रक्षा करते हैं।
  6. 1.2 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें। 300 μl FACS बफर में 300-400 XG और resuspend कोशिकाओं पर स्पिन 5 मिनट।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं यू के लिए प्रकाश से आगे की प्रक्रिया के लिए एक BL2 प्रयोगशाला को हस्तांतरित या संग्रहीत एक फ्रिज में और संरक्षित किया जा सकता हैतीन दिनों के लिए पी।
  7. 500 μl FACS बफर जोड़ें। स्पिन 1x permeabilization / धो बफर के 500 μl में 300-400 XG और resuspend कोशिकाओं पर 5 मिनट। स्पिन 300-400 x जी पर 5 मिनट।
  8. पहले से आरक्षित ट्यूब में कदम 6.3 और 3.5 μl चूहा आईजीजी पीई में सीडी 4 के लिए एंटीबॉडी और / या CD8 टी सेल मार्कर के साथ जोड़ा ट्यूब के लिए 3.5 μl विरोधी IFNγ पीई जोड़ने के लिए, 100 μl 1x पेर्म / धो में कोशिकाओं पुनः निलंबित और बर्फ पर 25 मिनट के लिए आईजीजी नियंत्रण के लिए प्रकाश से रक्षा करते हैं। 1x permeabilization / धो बफर के 1.4 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। स्पिन 300-400 x जी पर 5 मिनट। 1.4 मिलीलीटर 1x permeabilization / धो बफर जोड़कर धोने कदम दोहराएँ।
  9. 300-400 XG पर 5 मिनट के स्पिन और सतह पर तैरनेवाला छानना। FACS बफर के 1.4 मिलीलीटर जोड़ने और अंतिम अधिग्रहण के लिए FACS बफर के 400 μl में फिर से निलंबित द्वारा कोशिकाओं को धो लें।

Intracellular Cytokine धुंधला की 7. फ्लो विश्लेषण

  1. कदम 4.1 के रूप में ही अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें। बनाने की प्रक्रियाते जीवित कोशिकाओं पर एक गेट (p2; 2A चित्रा देखें)। प्रत्येक समूह के लिए मुआवजा ट्यूब का उपयोग voltages के समायोजित करें।
  2. ओपन दो नए डॉट भूखंडों, एक बनाम FL1 के लिए एकत्र डेटा प्रदर्शित करने के लिए। FL2 (सीडी 8 बनाम। IFN-γ), और अन्य एक बनाम FL4 के लिए एकत्र डेटा प्रदर्शित करने के लिए है। FL2 (सीडी 4 बनाम। IFN-γ)। प्रत्येक नमूने की gated आबादी के लिए 50,000 घटनाओं मोल।

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Representative Results

/ - - ओवीए पेप्टाइड्स की उपस्थिति या अनुपस्थिति में चूहों टी सेल भड़काना परख में, CFSE लेबल वाली सीडी 4+ टी कोशिकाओं NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमित जंगली प्रकार और MyD88 से शुद्ध DCs के साथ सुसंस्कृत थे। 5 दिनों के नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया के लिए लेबल टी कोशिकाओं के साथ या ओवीए बिना अकेले सुसंस्कृत। चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, कुल टी कोशिकाओं FL1 चैनल पर प्रतिदीप्ति तीव्रता के विश्लेषण के लिए gated थे। मार्कर DCs के सह-संस्कृति के बिना प्रसार दर निर्धारित करने के लिए दिन शून्य पर हौसले से लेबल सीडी 4+ टी कोशिकाओं के आधार पर स्थापित किया गया था। इस संस्कृति शर्त के तहत प्रसार की दर (1.6%) का स्तर कम हो गई थी। : 1 के अनुपात में एक ही मार्कर एक 10 पर DCs के साथ सह सुसंस्कृत सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रसार की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। कारण सह संस्कृति में अपने उच्च अनुपात और उनके प्रफलन प्रकृति के कारण, टी कोशिकाओं अतिरिक्त प्ररूपी stai के बिना मिश्रित आबादी पर gated किया जा सकता हैनिंग। चित्रा 1 बी में दिखाया गया है एक ही परिस्थितियों में इलाज तीन नमूनों में से एक प्रतिनिधि के रूप में दिखाया गया, जंगली प्रकार के समूह में एक 87.0% प्रसार दर वहां गया था। / - - इसके अलावा, टी MyD88 की DCs के साथ सह-संवर्धित कोशिकाओं CFSE लेबल ओवीए की उपस्थिति में चूहों एक 74.5% प्रसार दर (चित्रा 1C) था। इस प्रकार, NS4B-P38G की DCs उत्परिवर्ती संक्रमित MyD88 साथ सह सुसंस्कृत ओटी द्वितीय सीडी 4+ टी कोशिकाओं के प्रसार दर - / - चूहों उन सह सुसंस्कृत जंगली प्रकार चूहों से DCs के साथ की तुलना में कम थी। इन परिणामों के MyD88- संकेतन मार्ग में एक कमी NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान DCs की क्षमता पेश एक बिगड़ा प्रतिजन की ओर जाता है कि सलाह देते हैं।

आईसीएस परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, हम दिन 8 के बाद संक्रमण (2A चित्रा) में जंगली प्रकार चूहों से अलग कुल splenocytes, डबल सकारात्मक आबादी के प्रतिशत पर gated (सीडी 4 <समर्थन> + IFNγ + और ​​एक प्रतिनिधि नमूने में सीडी 8 + IFNγ +) क्रमश: 0.4% और 1.7% थे। सीडी 4 + IFNγ + और ​​का प्रतिशत सीडी 8 + IFNγ + MyD88 का एक प्रतिनिधि नमूने में gated कुल splenocytes की - चूहों क्रमशः 0.2% और 0.6% थे (चित्रा 2B) - /। कोई मतभेद पेप्टाइड्स इलाज के बिना splenocytes के दो समूहों के डबल सकारात्मक आबादी में विख्यात थे (डेटा) नहीं दिखाया। / - - चूहों (आंकड़े -2 सी और 2 डी) इसी प्रकार के विश्लेषण गैर संक्रमित, जंगली प्रकार और MyD88 से अलग splenocytes के साथ प्रदर्शन किया गया। डबल सकारात्मक आबादी का प्रतिशत (सीडी 4 + IFNγ + और ​​सीडी 8 + IFNγ +) को दो समूहों में अलग नहीं थे के बीच। सीडी 4 की इसके अलावा, चित्रा 2A में, एक सकारात्मक आबादी+ और CD8 + टी कोशिकाओं को 21% और कुल gated splenocytes की 13.3% थे। / - - Splenocytes (चित्रा 2B) जबकि, वे 15.9% और MyD88 की 11.2% होना दिखाया गया। संक्रमित समूहों की तुलना में, दो गैर संक्रमित जंगली प्रकार और MyD88 के बीच एक सकारात्मक आबादी के प्रतिशत के मतभेद - / - चूहों 19.1% बनाम 15.7% बनाम सीडी 4+ टी कोशिकाओं के लिए 18.4%, (बहुत कम थे। सीडी 8 + टी कोशिकाओं के लिए 13.3%)। / - - 8 दिन के बाद NS4B- P38G उत्परिवर्ती संक्रमण में जंगली प्रकार के समूह की तुलना में चूहों को एक साथ संयुक्त, सीडी 4 + और ​​CD8 + टी दोनों सेल प्रतिक्रिया MyD88 में कम हो गई थी। इसी प्रकार का एक विश्लेषण 21 दिन के बाद संक्रमण पर एकत्र नमूनों के लिए प्रदर्शन किया था। चित्रा 3 ए व 3 बी, MyD88 में कुल splenocytes की सीडी 4 + IFNγ + <के प्रतिशत के रूप में दिखायासमर्थन> - / - समूह (0.1%) जंगली प्रकार के समूह (0.2%) की तुलना में थोड़ा कम था। / - - MyD88 में सीडी 4 + टी कोशिकाओं की एक सकारात्मक जनसंख्या समूह (17%) जंगली प्रकार के समूह (20.6%) की तुलना में भी कम थी। इसकी तुलना में, सीडी 8 का प्रतिशत न तो + IFNγ + और ​​न ही सीडी 8 + टी कोशिकाओं की एक सकारात्मक जनसंख्या का प्रतिशत दो समूहों के बीच अलग था। 4 दिन बाद माध्यमिक संक्रमण में, डबल सकारात्मक आबादी का प्रतिशत (सीडी 4 + IFNγ + और ​​सीडी 8 + IFNγ +) जंगली प्रकार के समूह में से एक प्रतिनिधि नमूने क्रमशः 0.3% और 0.5% थे में (चित्रा -4 ए)। के प्रतिशत सीडी 4 + IFNγ + और ​​सीडी 8 + IFNγ + MyD88 का एक प्रतिनिधि नमूने में gated कुल splenocytes की - / - समूह में 0.1% और 0.2% थे (4B चित्रा)। इसके अलावा, सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं की एक सकारात्मक जनसंख्या 18.7% और जंगली प्रकार चूहों की कुल splenocytes की 15.8% थी। / - - चूहों (4B चित्रा) जबकि, यह प्रतिशत 12.1% और MyD88 में 12.3% के रूप में कम हो गया था। इन परिणामों के सारांश में, MyD88 संकेतन दोनों आबादी के प्रारंभिक टी सेल सक्रियण में शामिल है और संक्रमण के बाद के चरण में सीडी 4 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए योगदान देता है। यह भी स्मृति सीडी 4 + और ​​CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया में शामिल है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। डीसी प्रतिजन पेश जंगली प्रकार और MyD88 में क्षमता - / - NS4B- P38G संक्रमण के दौरान चूहों CFSE लेबल वाली सीडी 4+ टी कोशिकाओं अकेले (ए) के सह सुसंस्कृत या WNV-एन एस के DCs के साथ थे/ - - चूहों (सी) ओवीए 323-339 की उपस्थिति में 4 बी-P38G संक्रमित जंगली प्रकार (बी) और MyD88 mutant-। प्रकोष्ठों FSC / एसएससी पर आधारित टी कोशिकाओं पर gated, 5 दिन में काटा गया (पैनल बाएं) और उनके प्रसार दर (सही पैनल) के लिए विश्लेषण किया। प्रत्येक समूह में तीन नमूनों में से एक प्रतिनिधि दिखाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
। चित्रा 2: - / - Splenocytes WNV NS4B-P38G से अलग थे WNV NS4B-P38G संक्रमण का एक प्रारंभिक चरण में टी सेल प्रतिक्रिया जंगली प्रकार (ए) और MyD88 संक्रमित mutant- नियंत्रण के रूप में दिन 8. में चूहों (बी), splenocytes गैर से काटा गया-infected जंगली प्रकार (सी) और MyD88 - / - चूहों (डी)। कोशिकाओं काटा, और IFNγ और सीडी 4 या सीडी 8 के लिए दाग, 5 घंटा के लिए WNV पेप्टाइड्स के साथ विवो पूर्व सुसंस्कृत थे। प्रत्येक समूह से कुल splenocytes (p2) gated और विश्लेषण किया गया। दिखाया डॉट भूखंडों प्रत्येक समूह में तीन नमूनों में से एक प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
। चित्रा 3: - / - Splenocytes WNV NS4B-P38G से अलग थे WNV NS4B-P38G संक्रमण के अंतिम चरण में टी सेल प्रतिक्रिया जंगली प्रकार (ए) और MyD88 संक्रमित mutant- दिन 21. कोशिकाओं को चूहों (बी) थे सुसंस्कृत पूर्व WNV साथ vivo5 घंटे के लिए पेप्टाइड्स, काटा, और IFN-γ और सीडी 4 या सीडी 8 के लिए दाग। प्रत्येक समूह से कुल splenocytes (p2) gated और विश्लेषण किया गया। प्रत्येक समूह में तीन नमूनों में से एक प्रतिनिधि दिखाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। जंगली प्रकार WNV के एलडी 100 के साथ फिर से संक्रमित थे WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती के साथ एक प्राथमिक संक्रमण से बच गया है कि जंगली प्रकार WNV चूहों के साथ माध्यमिक चुनौती दौरान टी सेल के हिमायती हैं। / - - चूहों (बी) के 4 दिन बाद माध्यमिक संक्रमण में, splenocytes WNV NS4B-P38G से अलग थे जंगली प्रकार (ए) और MyD88 संक्रमित mutant-। कोशिकाओं 5 घंटा, harve के लिए WNV पेप्टाइड्स के साथ विवो पूर्व सुसंस्कृत थेSTED, और IFN-γ और सीडी 4 या सीडी 8 के लिए दाग। प्रत्येक समूह से कुल splenocytes (p2) gated और विश्लेषण किया गया। प्रत्येक समूह में तीन नमूनों में से एक प्रतिनिधि दिखाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

WNV एक BL3 रोगजनक है। कारण सुरक्षा नियमों को, WNV संक्रमित नमूनों के साथ प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के अक्सर BL3 सुविधाओं या प्रदर्शन करने के लिए अधिक लंबा और थकाऊ पर उपकरणों की उपलब्धता के द्वारा प्रतिबंधित कर रहे हैं। हाल के एक अध्ययन में, हम WNV संक्रमण 5 दौरान सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए दो फ्लो आधारित तरीकों का इस्तेमाल किया। दोनों assays में, WNV संक्रमित कोशिकाओं 1-2% पीएफए ​​सीधे या 4% पीएफए ​​युक्त निर्धारण / permeabilization के समाधान के साथ साथ इलाज किया गया। यह वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के 1% पीएफए ​​निर्धारण कुशलता का पता लगाने सीमा 12 से नीचे संक्रामक कणों की संख्या को कम कर सकता है कि जाना जाता है। इसलिए, दोनों तरीकों में काफी BL3 सुविधाओं के अंदर प्रदर्शन के समय को कम कर दिया। BrdU या रेडियोधर्मी thymidine के समावेश के माध्यम से उन सहित टी सेल प्रसार, को मापने के लिए कई स्थापित assays के कर रहे हैं, प्रवाह CFSE mor के प्रदान की गई है OTII टी कोशिकाओं में लेबल का उपयोग कर इन विट्रो टी सेल भड़काना परख में cytometry आधारितकाफी सुधार समग्र संवेदनशीलता के साथ सीडी 4+ टी कोशिकाओं proliferating के प्रतिशत के ई सही निर्धारण। इधर, एक 10: DCS और टी कोशिकाओं के लिए एक अनुपात कुशलतापूर्वक WNV संक्रमण के दौरान प्रतिजन पेश क्षमता को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अनुपात भिन्न हो सकती है के रूप में एक खुराक अनुमापन, एक रोगज़नक़ के साथ संक्रमण के दौरान डीसी कार्यों का अध्ययन करने के लिए सिफारिश की है। आईसीएस प्रतिजन विशेष टी सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए परख आधारित cytometry-एक आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रवाह है। फिर भी, प्रक्रिया लंबी है, और सेल संस्कृति और कपड़े धोने और कोशिकाओं का धुंधला की कई कदम भी शामिल है। BL3 सुविधाओं में प्रदर्शन कर जब यह संभावित रूप से परेशानी है। कोशिकाओं शुरू करने के बजाय एक ऊतक संस्कृति की थाली का एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में WNV विशिष्ट पेप्टाइड्स साथ प्रेरित किया गया है, ताकि हम प्रोटोकॉल को संशोधित किया है। इसके बाद, कोशिकाओं को धोया और बजाय शंक्वाकार ट्यूब की सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर दाग रहे थे। इन संशोधनों के एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर प्रदर्शन किया जा रहा पूरी प्रक्रिया के लिए सक्षम हैजैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर की कोशिकाओं centrifuging के लिए disinfecting के प्रक्रिया समाप्त कर दिया है, जो एक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज मशीन का उपयोग करके। कोशिकाओं को भी एक प्रवाह cytometer द्वारा सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में हासिल किया गया। कुल मिलाकर, सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रणाली पारंपरिक टिशू कल्चर प्लेट आधारित परख की तुलना में आईसीएस में समय और प्रयास (लगभग 2 घंटा) को बचाया था। अन्त में, microcentrifuge ट्यूब विधि आर्थिक है और प्रदर्शन में अधिक लचीलापन प्रदान करता है जो विशेष साधन की आवश्यकता है, नहीं है। इसके अलावा, यह प्रदर्शन और अंततः (डेटा) नहीं दिखाया सेल व्यवहार्यता बढ़ गया था, जो काफ़ी कम समय है, के लिए आसान था। आईसीएस के लिए सेल संस्कृति की स्थापना में 18 जी सुई के उपयोग की वजह से एक नाबालिग सुरक्षा चिंता का विषय नहीं है।

WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती एक प्रतिमान अन्य प्रभावोत्पादक लाइव तनु flavivirus टीके के तर्कसंगत विकास में सहायता करने के लिए के रूप में उच्च सुरक्षात्मक उन्मुक्ति उपयोग किया जा सकता लाती है जिसके द्वारा तंत्र की जांच। आईसी का उपयोग करकेएस और इन विट्रो टी सेल भड़काना assays में, हम उस MyD88 संकेतन से पता चला है WNV NS4B-P38G उत्परिवर्ती संक्रमण के दौरान सेल की मध्यस्थता अनुकूली उन्मुक्ति के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। न तो परख WNV के लिए बनाया गया विशेष है। उन्होंने यह भी साथ DCS और टी सेल कार्यों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता नमूने संक्रमित अन्य BL3 एजेंटों के साथ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Invitrogen 11875 warm up at 37 °C
anti-CD11c magnetic beads Miltenyi Biotec 130-052-001 follow the manufacturer’s instructions
anti-CD4 magnetic beads Miltenyi Biotec 130-095-248 follow the manufacturer’s instructions
CFSE Invitrogen C34554
OVA residue 323-339 Genscript Corporation RP10610
Peptides Proimmune PC0AD-D
Brefeldin A solution BD Bioscience 555029
Mouse Fc Blocker e-Bioscience 14-0161-85
APC-conjugated CD4 e-Bioscience 17-0041-81
FITC-conjugated CD8 e-Bioscience 11-0081-82
Fixation/Permeabilization Solution BD-Bioscience 554722
Permeabilization/wash buffer BD-Bioscience 554723
anti-IFNγ-PE e-Bioscience 12-7311-82
Accuri flow cytometer BD Bioscience

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 93 वेस्ट नील वायरस वृक्ष के समान कोशिकाओं टी कोशिकाओं साइटोकाइन प्रसार,
वेस्ट नील वायरस उत्परिवर्ती तनाव संक्रमण को Myd88 की मध्यस्थता सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के <em>इन विट्रो</em> विश्लेषण <em>में</em>
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Xie, G., Whiteman, M. C., Wicker, J. … More

Xie, G., Whiteman, M. C., Wicker, J. A., Barrett, A. D. T., Wang, T. In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection. J. Vis. Exp. (93), e52121, doi:10.3791/52121 (2014).

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