Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

Abstract

Farelerde, vahşi tip Batı Nil Virüsü daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini bağlı bir zayıflatılmış Batı Nil virüsü (WNV), bir yapısal olmayan (NS) 4B-P38G mutantı. Son zamanlarda, miyeloid farklılaşma faktörü 88 (MyD88) sinyal Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında, ilk T hücresi uyarılması ve bellek T hücresi gelişimi için önemli olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada iki sitometri tabanlı yöntemler akış - Bir in vitro T hücre prime deneyi ve bir hücre içi sitokin boyama (ICS), - dendritik hücreler (DC) ve T hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılmıştır. OTII transgenik farelerin, CD4 ⁺ T hücreleri etiketli - deneyi emişli T hücresi, hücre çoğalması karboksiflüoresein süksinimidil ester (CFSE) ile farelerin her iki grup DC'lerin ko-kültür, aşağıdaki akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Önemli ölçüde gelenek daha genel duyarlılık geliştirilmiş olan bu yaklaşım, CD4 ⁺ T hücreleri çoğalan yüzdesi doğru belirlenmesi sağlanırark radyoaktif reaktifler ile deneyleri. Bir mikrosantrifüj tüpü sistemi ICS protokolünün iki hücre kültürü ve sitokin boyama prosedürleri kullanılmıştır. Geleneksel doku kültürü plaka tabanlı sisteme kıyasla, bu değiştirilmiş prosedür biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerinde gerçekleştirmek için daha kolay oldu. Ayrıca, WNV- enfekte olmuş hücreler BL3 dışındaki daha sonraki analiz etkin analizlerde içinde paraformaldehit ile işleme tabi tutuldu. Genel olarak, bu in vitro bağışıklık tahlilleri, etkili bir Batı Nil Virüsü enfeksiyonu esnasında hücre-aracılı bağışıklık karşılıklarının değerlendirmek için de kullanılabilir.

Introduction

Batı Nil virüsü (BNV), bir nörotrop, artı-hissedilen flavivirüs, gelişmekte olan bir halk sağlığı tehdidi olduğunu. Şu anda, hiçbir aşı beşeri ¹ için onaylanmıştır. Yapısal olmayan (NS) 4B protein bir P38G yer değişimine bir zayıflatılmış Batı Nil Virüsü soyu, vahşi tip Batı Nil Virüsü NY99 suşu ^2'den farelerde hiçbir farelerde ölümcül bulunmuştur ancak daha yüksek doğal sitokin ve T hücresi tepkilerini teşvik ettiği bilinmektedir. NS4B-P38G mutant ile bağışıklık kazandırılmış fareler öldürücü doğal tipte Virüsü ile ikinci bir sorun korundu. Bu NS4B-P38G mutant ideal aşı adayı için uygun özelliklere sahip olduğunu göstermektedir. NS4B-P38G mutant yüksek koruyucu adaptif bağışıklığı hangi mekanizmalar henüz net olarak anlaşılamamıştır. Patojen ilişkili moleküler desenleri tanımaya Toll benzeri reseptörler (TLR), viral enfeksiyon karşı doğal bağışıklığın başlamasında önemli bir rol oynamaktadır. Çekirdek TLR sinyal yolu miyeloid farklılaşma birincil yanıt ge kullanırBirincil adaptörü ^3,4 olarak ne 88 (MyD88). Yeni bir çalışmada, MyD88 sinyal farelerde ⁵ Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutant enfeksiyonu esnasında hücre aracılı bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Dentritik hücreler (DC'ler), viral enfeksiyonun ^6,7 sırasında birincil T hücresi tepkilerini başlatmak için benzersiz kapasitesini gösteren en önemli antijen sunan hücreler bulunmaktadır. CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücreleri, uzun süreli koruyucu bağışıklık katkı ve vahşi tip Batı Nil Virüsü enfeksiyonu ^8,9 Aşağıdaki ana yaşaması için önemliyse her ikisi. İki immünolojik tahliller NS4B-P38G mutant amacıyla enfeksiyon bulaştırılan farelerde bu hücrelerin fonksiyonlarını belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır.

^{- / -} Farelerde İlk olarak, in vitro T hücre prime deney Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arasında DC'lerin antijen sunan yeteneği karşılaştırmak için kullanılmıştır. Tahlil, naif CD4 <duyarlılığını artırmak içinCFSE (WNV enfekte edilmiş farelerin 339 DCler saflaştırıldı ve karboksiflüoresein süksinimidil paskalya birlikte kültürlenmiş - destek> + T hücreleri, 323 (OVA) peptidi tavuk ovalbümin için Vα2 / Vβ5 TCR ifade OTII transgenik farelerden izole edilmiştir OVA peptidi varlığında) -etiketli CD4 ⁺ T hücreleri. Ko-kültür içinde 5 gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve paraformaldehit (PFA) ile tespit edilmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Çoğalma tahlilleri geleneksel bir 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) veya toz haline getirilmiş timin deoxyriboside ⁽³ HTdr) ¹⁰ arasında dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu deneyler radyoaktif ve / veya BNV çalışmalarının yapıldığı biyogüvenlik düzeyi (BL) 3 tesislerde, özel ekipman ihtiyacı ya vardır. CFSE, daha yaygın hale imünolojik deneylerde kullandı vital boyanın flüoresan yoğunluğu seri yarılanmasına lenfosit çoğalmasının akış sitometrik analizi, boya daha stabil olduğu gibive eşit, hücrelere dahil flow sitometri ile kolayca tespit ve ¹¹ radyoaktif olmayan bir. Tahlil, aynı zamanda, hücre bölünmesini belirlemek için yeteneği vardır. Batı Nil Virüsü çalışmalarda, bu tahlili kullanarak bir büyük avantajı,% 1-2 PFA ile enfekte olmuş hücrelerde tespiti, bir BL2 laboratuarda bir akış sitometresinde numune toplama sağlayacak WNV ^12, etkisiz olmasıdır.

Daha sonra, bir tadil edilmiş hücre içi sitokin boyama (ICS) prosedürü MyD88 NS4B-P38G mutantı ile enfekte olmuş farelerde Batı Nil Virüsü spesifik T hücre karşılıklarının düzenlenmesinde sinyalleme rolünü incelemek için kullanılmıştır. Bu tahlilde, enfekte farelerinden yalıtılmış splenositlerin Batı Nil Virüsü spesifik peptidler ile in vitro muamele edildi. Brefeldin bir hücre içinde sitokin tutmak için ilave edildi. 5 saat inkübasyondan sonra, hücreler toplandı, yıkandı ve T hücre alt-gruplar için boyandı. Hücreler daha sonra, PFA sabit geçirgenleştirildi ve interferon (IFN) -γ boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.Hücreler tespit ve PFA içeren permeabilizasyon tampon maddesi ile muamele edilmiş bir kez başka akış sitometrisi bazlı bir deneyde olduğu gibi, enfekte örnekleri daha fazla işleme ve analizi için bir BL2 laboratuara aktarılır. Birkaç yayınlanan çalışmalarda, biz WNV-enfekte farelerde ^13,14 T hücresi efektör fonksiyonları ölçmek için ICS kullandık. Iyi kurulmuş oluyor rağmen, bu testin bir büyük dezavantajı prosedürü çok uzun ve BL3 tesisleri içinde yapıldığında alıcı daha fazla zaman olabilir olduğunu. Burada, mikro-santrifüj tüpü tabanlı ICS yöntem daha uygun, daha kolay devam etmek ve daha az zaman BL3 laboratuar içinde gerçekleştirilen zaman alıcı olduğu gösterilmiştir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Texas Tıp Şubesi Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Enfekte-Sigara ve BNV ile enfekte fareler ile DH'lere 1. izolasyonu

1. Yaş ve cinsiyet maç 6-10 haftalık, vahşi tip C57BL / 6 (B6) ve MyD88 ^{- / -} fareler. Periton boşluğu içine (ip) ve Batı Nil Virüsü NS4B- P38G mutantının 500 plak oluşturan birim (pfu) ile inoküle. ^{/ - -} CO ₂ ile fareler gün 3 sonrası enfeksiyon, B6 ve MyD88 euthanize. Kontroller olarak her iki grupta da enfekte olmayan fareler kullanın. Her gruptan üçer fare kullanın.
2. Islak% 70 etanol kullanılarak kurban farenin sol tarafındaki kürk ve ön ve arka bacaklarının arasına yarım hakkında, farenin sol tarafındaki kürk kesip. Vücut boşluğu açmak kesin. Forseps kullanarak dalak çıkarın. RPMI ile Petri kabındaki dalak yerleştirin.
3. Göre anti-CD11c manyetik boncuk kullanılarak dalak DC'leri izole edinüreticinin talimatları.

2. Arıtma ve OTII Transgenik Farelerde T hücrelerinin Etiketleme

1. Bir naif OTII fare Hasat bir dalak Yukarıda adım 1.2 tarif ve iki slaytlar buzlu uçları arasında dalak homojenize olarak. 14 ml RPMI orta kadar ekleyin, bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. Süspansiyon 5 dakika oturup yeni bir 15 ml konik tüp bunun 13 ml aktarmak edelim.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir CD4 ⁺ T hücresi izolasyon kiti kullanılarak dalak CD4 ⁺ T hücreleri izole edin.
3. 50 ml'lik bir konik tüp içine Aktarım hücreleri, PBS ile iki kez yıkanır. Süspanse ml başına 1 x 10 ⁶ hücre,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) içeren PBS içinde hücreleri ve CFSE 0.5 umol / ml ekleyin. Işıksız bir ortamda 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
4. % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 5 ml soğuk tam bir ortam (RPMI-1640 ekleyin, 1/100 hacimantibiyotikler / antimikotikler, 1/100 hacim L-glutamin ve 1000 x 2-merkaptoetanol, 1 / 1,000 hacim) konuldu.
5. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Yıkama Hücreler bir kez PBS ile,% 2 PFA 0.2 x 10 ⁶ etiketli CD4 ⁺ T hücreleri saptamak ve bir akış sitometresi üzerinde kazanır. KAKE bazal düzeyini belirlemek için bu örnek kullanın. Tam ortamda etiketli hücrelerin geri kalanını yeniden askıya.

Batı Nil Virüsü ile enfekte Fareler DCler ile 3. Ortak kültür OTII T hücreleri

1. Kültür 2 x 10 OTII farelerin ⁵ saflaştırılmış CD4 ⁺ T hücreleri, tek başına ya da vahşi tip veya MyD88 saflaştırılmış DCler ile ^{- / -} OVA tortu 323-339, bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde fareleri (2 x 10 ⁴⁾ (1 g oyuk başına 1 mi tam bir ortamda / ml).
2. 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Hücreleri, (% 1 FBS, PBS) FACS tamponunda iki sefer yıkama ve 0.25 mi% 2 PFA sabitleyin. Vortex hemen.

In Vitro 4. Akım Sitometri Analizi </ Em> T Hücre Astar

1. Edinimi için, çift yazılım simgesi flow sitometri tıklayın. SSC-A 200.000 FSC-A 200.000'den ve 0 lineer FSC-A vs doğrusal SSC-A yoğunluk arsa, kanalları seçmek için 0. (Şekil 1A bakınız P2) Ardından, canlı hücreleri üzerinde bir kapı oluşturun.
2. KAKE floresan yoğunluğunu analiz etmek, FL1 kanalı için histogramı açmak ve kapı nüfus 20.000 olayları kazanır. Tek başına kültürlenen (Şekil 1A) OTII hücreleri için örnekler üzerinde bir işaret ayarlayın.
3. Vahşi tip DCler (Şekil 1B) veya MyD88 birlikte kültürlenmiş OTII hücreleri için numuneler elde edin ^{- / -} DCler (Şekil 1C) benzer bir şekilde.

5. izolasyonu ve sitokin tahlilleri için splenositler uyarılması

1. Ste de anlatılan ile aynı prosedür kullanılarak Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant farelere ^{- / -} B6 ve MyD88 Infects 1.1. Günde 30 sonrası enfeksiyon anda, yeniden meydan günlerinde 8 ve ikincil enfeksiyonu takiben 21 ilköğretim sonrası Batı Nil Virüsü enfeksiyonu veya 4. günde de yabani tip BNV suşu ip 2000 PFU'nun ile fareler hayatta, dalak toplanması için CO ₂ ile fareler euthanize .
   NOT: Her bir zaman noktası için, grup başına 2-3 fare kullanıldı.
2. Aşama 1.2 ve adım 2.2 tarif edildiği gibi dalak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı 10 ml tam orta bunları yeniden askıya.
3. 2.5 x 10 ⁶ hücre / ml komple ortam ile hücrelerin seyreltin. 1.5 ml mikro santrifüj tüpü içinde splenositlerin 1 ml ilave edilir.
4. DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS4B ve E peptidler (SSVWNATTA ve IALTFLAV), CD8 ⁺ T hücreleri simüle sulandırmak. CD4 ⁺ T hücrelerinin uyarılması için, DMSO içinde 1 mg / ml Batı Nil Virüsü özgü NS3 ve E peptidler (RRWCFDGPRTNTILE ve PVGRLVTVNPFVSVA) seyreltin. Followe hücrelere peptidlerin 10 ul ekleBrefeldin bir solüsyonun 1 ul d. Kontroller olarak peptidler, tedavi olmaksızın hücreleri kullanır. Hücreleri karıştırın.
5. Tüpün kapağının bir 18 G iğne ile iki delik Punch. 5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.

6. Hücre içi Sitokin Boyama

1. Yeni bir mikro-santrifüj tüp hücreleri aktarın. 300-400 xg'de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve süpernatant kapalı dökün. 300-400 xg'de 1 ml FACS tampon, spin 5 dk ekleyin ve 120 ul FACS tamponu ile pipetleme hücreleri askıya yeniden.
2. 2 ul Fc engelleyici ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkalayın. Her bir tüpe 1 mL FACS tampon ekleyin. Spin 300 5 dk - 400 x g.
3. 300 ul FACS hücreleri askıya Yeniden tampon ve üç tüpler (tüp başına yaklaşık 0.8 x 10 ⁶ hücre) bölebilirsiniz. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, fare IgG-PE boyaması için her bir kültür durumda ilk tüp tutar. İkinci boru için, CD4, anti-CD4 APC 3 ul peptit ile muamele edilmiş hücreler, 3 μCD8 peptidler ile muamele edilmiş hücreler ya da peptidler, tedavi olmaksızın hücrelere iki eden antikorlara karşı anti-CD8 FITC l. Tazminat boyama üçüncü tüp kullanın. Her kültür koşulu için, APC-konjuge CD4, FITC konjuge CD8 veya FL1, FL2 ve FL4 kanalları için tazminat kontrolleri gibi yalnız PE etiketli CD3 antikorları (tüp başına 3 ul) ile boyanmış hücrelerin üç tüpleri kullanın.
4. Kısaca girdap hücreleri. 20 dakika boyunca buz üzerinde boş ve ışıktan korur. 1.4 mi FACS tampon ekleyin. 300-400 xg'de 5 dakika Spin ve süpernatant kapalı dökün.
5. Hücre pelet (veya kısaca girdap) bozmaya çalkalayın. 250 ul sabitleme / permeabilizasyon solutionby pipetleme hücre pelet yeniden askıya. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve ışıktan korur.
6. 1.2 mi FACS tampon ekleyin. 300 ul FACS tampon 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de Spin 5 dakika.
   NOT: Bu noktada, hücreler u ışıktan daha fazla işlenmek üzere bir BL2 laboratuara aktarılır ve saklanan bir buzdolabı ve korunabilirÜç gün p.
7. 500 ul FACS tampon ekleyin. Sıkma 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu içinde 500 ul 300-400 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri de 5 dak. Sıkma 300-400 x g'de 5 dak.
8. Daha önce ayrılmış bir tüp içinde aşama 6.3 ve 3.5 ul fare IgG-PE CD4 antikor ve / veya CD8 T hücresi belirleyicileri ilave boruya 3.5 ul anti-IFNy-PE eklemek, 100 ul 1x Perm / Wash hücrelerin yeniden askıya ve buz üzerinde 25 dakika süre ile, IgG kontrolü için ışıktan koruyunuz. 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu 1.4 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Sıkma 300-400 x g'de 5 dak. 1.4 ml 1x permeabilizasyon / yıkama tamponu ekleyerek yıkama adımı tekrarlayın.
9. 300-400 xg'de 5 dakika Spin ve süpernatant süzün. FACS tampon 1.4 ml ilave edilmesi ve nihai edinimi için FACS tampon 400 ul yeniden askıya hücreleri yıkayın.

Hücre içi Sitokin Boyama 7. Akım Sitometri Analizi

1. Adım 4.1 aynı satın alma ayarları kullanın. Create canlı hücreler üzerinde bir kapı (P2, Şekil 2A 'ya bakınız). Her grup için tazminat tüpler kullanılarak gerilimleri ayarlayın.
2. Açık iki yeni nokta araziler, bir vs FL1 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), diğeri vs FL4 için toplanan verileri görüntülemek için. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Her numunenin kapılı nüfus için 50.000 olayları Edinme.

Representative Results

^{- / -} OVA peptidlerinin varlığında veya yokluğunda, farelerde T hücresi priming tahlilde, CFSE etiketli, CD4 ⁺ T hücreleri, NS4B-P38G mutantı ile enfekte edilmiş yabani tip ve MyD88 arıtılmış DCler ile kültürlenmiştir. 5 gün negatif kontroller olarak kullanılmıştır için etiketli T hücreleri ya da OVA olmaksızın tek başına kültürlenmiştir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, toplam T hücre FL1 kanal flüoresans yoğunluğu analizi için kapı edildi. işaretleyici DC'lerin ko-kültür olmadan çoğalma hızı belirlemek için 0. günde taze etiketli CD4 ⁺ T hücreleri dayalı kurulmuştur. Bu kültür koşulları altında proliferasyon hızı (% 1.6) düşük seviyede oluştu. : 1 oranında aynı imleyici 10 de DCler ile ko-kültür, CD4 ⁺ T hücrelerinin proliferasyon oranını belirlemek için kullanıldı. Nedeniyle ko-kültür içinde yüksek oranda ve çoğalma yapısı nedeniyle, T hücreleri ilave fenotipik DSKE olmayan karışık nüfusu üzerindeki kapı olabilirning. Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi, aynı koşullar altında muamele üç numunenin bir temsilci gösterildiği gibi, vahşi tip grubunda bir% 87.0 çoğalma hızı oldu. ^{- / -} Ayrıca, T MyD88 ait DCler ile ko-kültür hücreleri CFSE etiketli OVA mevcudiyetinde fareler% 74.5 çoğalma hızı (Şekil 1C) vardı. Bu nedenle, NS4B-P38G DCS mutantı ile enfekte edilmiş MyD88 birlikte kültürlenmiş OT II, CD4 ⁺ T hücrelerinin proliferasyon hızı ^{- / -} fareleri, bu ko-kültür vahşi tip farelerden DCler ile kıyasla daha düşüktü. Bu sonuçlar, MyD88- sinyal yolunda bir eksiklik NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında DC'lerin kapasitesini sergileyen bir bozulmuş antijene yol açtığını göstermektedir.

ICS sonuçlarını analiz etmek, biz gün 8 sonrası enfeksiyon (Şekil 2A) yabani tip farelerden izole toplam splenositlerinin, çift pozitif nüfus yüzdeleri üzerine Geçitli (CD4 <sup> + IFNy ⁺ ve bir temsili numune CD8 ⁺ IFNy ⁺⁾ sırasıyla% 0.4 ve% 1.7 idi. CD4 ⁺ IFNy'nin ⁺ ve yüzdeleri CD8 ⁺ IFNy ⁺ MyD88 bir örneklemde kapılı toplam dalak ^- fareler sırasıyla% 0.2 ve% 0.6 idi (Şekil 2B) ^{- /.} Herhangi bir değişiklik olduğu peptidler tedavisiz splenositlerin iki grup çift-pozitif popülasyonlarda gözlendi (veriler gösterilmemiştir). ^{- / -} Fareler (Şekil 2C ve 2D) benzer analizleri enfekte olmayan, vahşi tip ve MyD88 izole splenosit ile yapıldı. Çift pozitif popülasyonlar yüzdeleri (CD4 ⁺ IFNy ⁺ ve CD8 ⁺ IFNy ^+), iki grupta da farklı değildi arasındadır. CD4 Ayrıca, Şekil 2A, bir pozitif popülasyonlar⁺ Ve CD8 + T hücreleri,% 21 toplam kapı splenositlerin% 13.3 idi. ^{- / -} Splenositler (Şekil 2B) beraber, bunlar,% 15.9 ve MyD88 11.2% olarak gösterildi. Enfekte gruplara göre, olmayan iki enfekte yabani-tip ve MyD88 arasındaki tek pozitif nüfus yüzdesi farkları ^{- / -} farelerde% 19.1 vs% 15.7 vs CD4 ⁺ T hücreleri için% 18.4, (daha az idi. CD8 ⁺ T hücreleri için% 13.3). ^{- / -} 8. günde NS4B- P38G mutan enfeksiyondan vahşi tip grubuna göre farenin birlikte birlikte, CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücresi tepkileri, hem MyD88 azalmıştır. Benzer bir analiz, gün 21 enfeksiyondan toplanan numuneler için gerçekleştirilmiştir. Şekil 3A ve 3B, MyD88 toplam splenositlerin CD4 ⁺ IFNy ⁺ <yüzdesi gösterildiği gibidestek> ^{- /} - grup (% 0.1), vahşi tip bir grup (% 0.2) daha düşük olmuştur. ^{- / -} MyD88 CD4 ⁺ T hücrelerinin bir pozitif nüfus grubu (% 17), vahşi tip bir grup (% 20.6) göre daha da düşüktür. Buna karşılık, CD8 oranı ne ⁺ IFNy ⁺ veya CD8 ⁺ T hücrelerinin tek pozitif nüfus yüzdesi gruplar arasında farklı değildi. Günde 4 ortaöğretim sonrası enfeksiyon anda, çift pozitif nüfus yüzdeleri (CD4 ⁺ IFNy ⁺ ve CD8 ⁺ IFNy ⁺⁾ yabani tip grubunun bir temsilci örnek sırasıyla% 0.3 ve% 0.5 bulundu (Şekil 4A). yüzdeleri, CD4 ⁺ IFNy ⁺ ve CD8 ⁺ IFNy ⁺ MyD88, temsilci bir örneğinde kapı toplam splenositlerin ^{- / -} grubu,% 0.1 ve% 0.2 idi (Şekil 4B). Bundan başka, CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücrelerinin bir pozitif popülasyonu% 18.7 ve vahşi tip farelerin toplam splenositlerin% 15.8 idi. ^{- / -} Fareler (Şekil 4B) ise, bu oran% 12,1 ve MyD88 12,3% 'si olarak düşürülmüştür. Bu sonuçlar özet olarak, MyD88 sinyal Türkler ve ilk T hücresi aktivasyonu ve enfeksiyonun sonraki bir aşamasında CD4 ⁺ T hücresi yanıtı katkıda bulunur. Ayrıca, hafıza CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücre yanıtlarında rol oynar.

Şekil 1:. DC antijen sunan vahşi tip ve MyD88 yeteneği ^{- / -} NS4B- P38G enfeksiyonu sırasında fareler CFSE etiketli, CD4 ⁺ T hücreleri tek başına (A) ko-kültürlenmiştir veya Batı Nil Virüsü-NS DCler ile alındı^{- / -} Fareler (C), OVA 323-339 mevcudiyetinde 4B-P38G enfekte yabani-tür (B) ve MyD88 mutant-. Hücreler FSC / SSC dayalı T hücreleri üzerinde kapılı, 5 gün hasat edildi (paneller sol) ve çoğalma oranları (sağ paneller) için analiz. Her grupta üç numunenin bir temsilcisi gördü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 2: ^{- / -} splenositler Batı Nil Virüsü NS4B-P38G izole edildi Batı Nil Virüsü NS4B-P38G enfeksiyonun erken bir aşamada T hücresi tepkileri, yabani-tür (A) ve MyD88 enfekte mutant- kontrol de gün 8 'de fareleri (B) Splenositler toplanılmıştırenfekte olan vahşi tip (C) ve MyD88 ^{- / -} fareler (D). Hücreler toplandı ve IFNy ve CD4 ya da CD8 için boyandı, 5 saat süre ile Batı Nil Virüsü peptidleri ile ex vivo olarak kültürlendi. Her gruptan Toplam splenositler (P2) işlenir ve analiz edilmiştir. gösterilen nokta araziler, her grupta üç numunenin bir temsilcisi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 3: ^{- / -} splenositler Batı Nil Virüsü NS4B-P38G izole edildi Batı Nil Virüsü NS4B-P38G enfeksiyonun geç bir safhasında, T hücresi tepkileri, yabani-tür (A) ve MyD88 enfekte mutant- 21. günde hücreler fareler (B), kültürlenmiş eski Batı Nil Virüsü ile vivo5 saat peptidler, hasat edilir, ve IFN-γ ve CD4 ya da CD8 pozitif boyandı. Her gruptan Toplam splenositler (P2) işlenir ve analiz edilmiştir. Her grupta üç numunenin bir temsilcisi gördü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:., Vahşi tip WNV bir LD ₁₀₀ ile yeniden enfekte edilmiştir Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant ile primer enfeksiyonu atlattı vahşi tip Batı Nil Virüsü Fareler ikincil Bu esnada T hücresi tepkileri. ^{/ - -} Fareler (B) günde 4 ortaöğretim sonrası enfeksiyon anda, splenositleri WNV NS4B-P38G izole edilmiştir vahşi türünü (A) ve MyD88 enfekte mutant-. Hücreler, 5 saat, Harve için Batı Nil Virüsü peptidleri ile ex vivo kültürlenmişYer ve IFN-γ ve CD4 ya da CD8 pozitif boyandı. Her gruptan Toplam splenositler (P2) işlenir ve analiz edilmiştir. Her grupta üç numunenin bir temsilcisi gördü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

BNV bir BL3 patojendir. Nedeniyle güvenlik yönetmeliklerine, WNV-enfekte örnekleri ile immünolojik testler genellikle BL3 tesisleri veya gerçekleştirmek için daha uzun ve sıkıcı bir ekipman durumu ile sınırlıdır. Yeni bir çalışmada, biz Batı Nil Virüsü enfeksiyonu ^5. sırasında hücre aracılı bağışıklık yanıtlarını incelemek için iki akış sitometri tabanlı yöntemler kullanılır. Analizlerde, Batı Nil Virüsü ile enfekte edilmiş hücreler,% 1-2 PFA doğrudan ya da% 4 PFA içeren sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi ile muamele edildi. Virüs ile enfekte edilmiş hücreler,% 1 PFA tespit verimli bir şekilde tespit etme sınırları altında ¹² bulaşıcı maddelerin sayısını azaltabilir bilinmektedir. Bu nedenle, her iki yöntem önemli ölçüde BL3 tesisleri içindeki performans süresini azalttı. BrdU ya da radyoaktif timidin dahil edilmesi yoluyla da dahil olmak üzere, T hücresi çoğalmasını ölçmek için bir çok köklü tahliller vardır akış CFSE mor sağlamıştır OTII T hücrelerini etiketli kullanılarak in vitro T hücresi prime tahlilinde sitometri tabanlıönemli ölçüde daha iyi genel hassasiyetle, CD4 ⁺ T hücrelerinin proliferasyon yüzdesi e doğru belirlenmesi. Burada, 10: DH'ler ve T hücreleri için 1 oranında etkin bir Batı Nil Virüsü enfeksiyonu esnasında antijen sağlayan kapasitesi tanımlamak üzere kullanılmıştır. Bu oran farklı olabilir edilen bir doz titrasyonu, bir patojen ile enfeksiyonu sırasında DC akım çalışma önerilir. ICS, antijene spesifik T hücresi tepkilerini çalışma deneyi göre sitometri yaygın olarak kullanılan bir akıştır. Bununla birlikte, işlem uzun ve hücre kültürü ve yıkama ve hücrelerin boyanması çok aşamaları içerir. BL3 tesislerinde yaparken potansiyel zahmetli. Hücreler ilk olarak yerine bir doku kültür plakasının bir mikro santrifüj tüpü içinde Batı Nil Virüsü spesifik peptitler ile uyarıldı böylece protokolü olarak var. Daha sonra, hücreler yıkandı ve yerine konik tüplerin mikro-santrifüj tüpleri içinde boyandı. Bu değişiklikler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır tüm süreci etkin olmasıBiyogüvenlik kabini dışında hücreler santrifüj için dezenfeksiyon prosedürü ortadan kaldırmıştır bir mikro-santrifüj makinesi kullanılarak. Hücreler ayrıca bir akış sitometresinde mikro-santrifüj tüpleri içinde satın alınmıştır. Genel olarak, mikro-santrifüj tüpü sistemi, geleneksel doku kültürü plakası tabanlı tahlil göre ICS zaman ve çaba (yaklaşık 2 saat) kurtarmıştı. Son olarak, Mikrosantrifüj tüp yöntemi ekonomik ve performansı daha fazla esneklik sunuyor özel alet gereksinimi, yok. Buna ek olarak, bu yapmak ve sonuç olarak (veriler gösterilmemiştir), hücre canlılığı artmış daha az zaman, daha kolaydı. ICS için hücre kültürü kurma 18 G iğne kullanımı nedeniyle bir küçük emniyet endişe var.

Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant bir paradigma diğer etkili canlı zayıflatılmış aşıların flavivirüs rasyonel geliştirilmesine yardımcı olmak için daha yüksek koruyucu bağışıklık kullanılabilir neden olduğu bir mekanizmanın araştırılması. IC kullanılarakS ve in vitro T hücre prime deneyleri içinde, bunun MyD88 sinyali göstermiştir Batı Nil Virüsü NS4B-P38G mutant enfeksiyon sırasında hücre aracılı adaptif bağışıklık gelişimi için önemlidir. Ne tahlil WNV için tasarlanmış özeldir. Bunlar ayrıca DH'ler ve T hücre fonksiyonları değerlendirmek için kullanılabilir örnekler ile enfekte edilmiş diğer BL3 ajanlarla birlikte kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	11875	warm up at 37 °C
anti-CD11c magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-052-001	follow the manufacturer’s instructions
anti-CD4 magnetic beads	Miltenyi Biotec	130-095-248	follow the manufacturer’s instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA residue 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-conjugated CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-conjugated CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Fixation/Permeabilization Solution	BD-Bioscience	554722
Permeabilization/wash buffer	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri flow cytometer	BD Bioscience