In Vitro Analyse av MyD88-mediert cellulær immunrespons til West Nile Virus Mutant Strain Infeksjon
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
En attenuert West Nile virus (WNV), en ikke-bærende (NS) 4B-P38G mutant, induserte høyere iboende cytokin og T-celle-responser enn villtype WNV i mus. Nylig, myeloid differensiering faktor 88 (MyD88) signale ble vist å være viktig for første T-celle priming og minne T-celle utvikling under WNV NS4B-P38G mutant infeksjon. I denne studien ble to flowcytometri-baserte metoder – en in vitro T-celle-priming-analyse og en intracellulær cytokin farging (ICS) – ble anvendt for å vurdere dendrittiske celler (DCS) og T-cellefunksjoner. På T-celle-priming-analysen, ble celleformering analysert ved flowcytometri følgende ko-kultur av DC fra begge grupper av mus med karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) – merkede CD4 + T-celler av OTII transgene mus. Denne tilnærmingen gitt en nøyaktig bestemmelse av prosentandelen av prolifererende CD4 + T-celler med betydelig forbedret sensitivitet enn tradisjonenal-analysene med radioaktive reagenser. En mikrosentrifugerør system ble brukt i begge cellekultur og cytokin fargingsprosedyrer i ICS-protokollen. Sammenlignet med den tradisjonelle vevskulturplate-basert system, dette modifisert prosedyre var lettere å prestere på biosikkerhetsnivå (BL) tre anlegg. Videre ble WNV- infiserte celler behandlet med paraformaldehyde i begge analysene, som gjorde ytterligere analyse utenfor BL3 fasiliteter. Samlet kan disse in vitro-immunologiske analyser anvendes til effektivt å evaluere cellemedierte immunresponser i løpet av WNV-infeksjon.
Introduction
West Nile-viruset (WNV), en neurotropisk, pluss-senset flavivirus, er en voksende helsetrusselen. Foreløpig har ingen vaksiner er godkjent for bruk på mennesker en. En attenuert WNV-stamme, som har en P38G substitusjon i nonstructural (NS) 4B protein, er kjent for å indusere ingen letalitet hos mus, men høyere iboende cytokiner og T-celleresponser hos mus enn villtype WNV NY99 stamme 2. Mus immunisert med NS4B-P38G mutant ble alle beskyttet fra en sekundær utfordring med dødelig villtype WNV. Dette tyder på at NS4B-P38G mutant har egnede egenskaper for en ideell vaksine kandidat. De mekanismer som NS4B-P38G mutant induserer høy beskyttende adaptiv immunitet er ikke klarlagt ennå. Toll-lignende reseptorer (TLR), som anerkjenner patogen-assosiert molekylære mønstre, spille en viktig rolle i initiering av medfødt immunitet mot virusinfeksjon. Kjernen TLR signalveien benytter myeloid differensiering primære respons gene 88 (MyD88) som primær adapteren 3,4. I en fersk undersøkelse, ble MyD88 signale vist seg å spille en viktig rolle i utviklingen av cellemediert immunitet under WNV NS4B- P38G mutant infeksjon hos mus fem. Dentritic celler (DCS) er en av de viktigste antigenpresenterende celler som oppviser den unike evne til å initiere primære T-celleresponser ved virusinfeksjon 6,7. CD4 + og CD8 + T-celler både bidra til langvarig beskyttende immunitet, og er viktig for verts overlevelse etter villtype WNV infeksjon 8,9. To immunologiske analyser ble anvendt i denne studie for å vurdere de funksjoner av disse celler i NS4B-P38G mutante infiserte mus.
Først ble en in vitro T-celle-priming-analyse anvendt for å sammenligne den antigen-presenterende evne DC av WNV-infiserte vill-type og MyD88 – / – mus. For å øke sensitiviteten for analysen, naive CD4 <sup> + T celler ble isolert fra OTII gene mus som uttrykker en Vα2 / Vβ5 TCR spesifikk for kylling ovalbumin (OVA) peptid 323 – 339. DCs av WNV infiserte mus ble renset, og co-kultivert med karboksyfluorescens succinimidyl påske (CFSE ) -merket CD4 + T-celler i nærvær av OVA peptidet. Etter fem dager med co-kultur ble cellene høstet og festes med paraformaldehyde (PFA) og analysert av flowcytometri. Proliferative assays har tradisjonelt blitt utført ved inkorporering av 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) eller tritiert thymin deoxyriboside (3 HTdr) 10. Likevel, disse analysene er enten radioaktivt og / eller behov for spesialutstyr på biosikkerhetsnivå (BL) 3 anlegg, hvor WNV studier er gjennomført. Den strømningscytometrisk analyse av lymfocytt proliferasjon av serie halvering av fluorescens-intensiteten av den vitale fargestoff CFSE er blitt mer vanlig brukt i immunologiske analyser som fargestoff er mer stabiltog jevnt inkorporert i cellene påvises lett ved flowcytometri, og er ikke-radioaktivt 11. Analysen har også evnen til å vurdere antall celledelinger. En stor fordel ved å bruke denne analysen i WNV studier er at fiksering av de infiserte celler med 1-2% PFA kunne inaktivere WNV 12, som vil gjøre det mulig for prøvetagning med et strømningscytometer i en BL2 laboratorium.
Deretter ble en modifisert intracellulær cytokin farging (ICS) Fremgangsmåten anvendt for å studere rollen til MyD88 signalering i reguleringen av WNV spesifikke T-celle responser in NS4B-P38G mutant-infiserte mus. I denne analysen, ble splenocytter isolert fra infiserte mus behandlet in vitro med WNV spesifikke peptider. Brefeldin A ble tilsatt for å beholde cytokiner i cellen. Etter 5 timers inkubasjon ble cellene høstet, vasket og farget for T-celle-undergrupper. Celler ble deretter fiksert i PFA, permeabilisert og farget for interferon (IFN) -γ og analysert ved flow-cytometri.Som med andre flowcytometri-baserte assay, når cellene blir behandlet med fiksering og permeabilization buffer inneholdende PFA, infiserte prøvene kan overføres til en BL2 laboratorium for ytterligere behandling og analyse. I flere publiserte studier, har vi brukt ICS å måle T celle effektorfunksjoner i WNV-infiserte mus 13,14. Selv om det er godt etablert, en stor ulempe med denne analysen er at framgangsmåten er svært lang og kan være mer tidkrevende når utført inne BL3 anlegg. Her ble et mikro-sentrifugerør basert ICS metoden vist seg å være mer praktisk og lettere å fortsette, og mindre tidkrevende når det utføres innenfor et BL3 laboratorium.
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV er en BL3 patogen. På grunn av sikkerhetsforskrifter, er immunologiske analyser med WNV-infiserte prøvene ofte begrenset av tilgjengeligheten av utstyr ved BL3 anlegg eller mer langvarig og kjedelig å utføre. I en fersk studie, brukte vi to flowcytometri-baserte metoder for å studere cellemedierte immunresponser under WNV infeksjon 5. I begge analysene ble WNV-infiserte celler behandlet med 1-2% PFA, direkte eller med fiksering / permeabilization oppløsning inneholdende 4% PFA. Det er kjent at 1% PF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
