Abstract
Een verzwakt West Nile virus (WNV), een niet-structurele (NS) 4B-P38G mutant geïnduceerde hogere aangeboren cytokine en T cel responsen dan het wildtype WNV bij muizen. Onlangs, myeloïde differentiatie factor 88 (MyD88) signalering werd getoond belangrijk voor initiële T-cel priming en geheugen T-cel ontwikkeling te zijn tijdens WNV NS4B-P38G mutant infectie. In deze studie twee stroomcytometrie-gebaseerde methoden - een in vitro T-cel priming assay en een intracellulaire cytokine kleuring (ICS) - werden gebruikt om dendritische cellen (DCs) en T celfuncties beoordelen. In de T-cel priming test werd celproliferatie geanalyseerd door flow cytometrie na co-cultuur van DCs uit beide groepen muizen met carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) - gelabelde CD4 + T-cellen van OTII transgene muizen. Deze aanpak gaf een nauwkeurige bepaling van het percentage prolifererende CD4 + T-cellen met aanzienlijk verbeterde algehele gevoeligheid dan de traditieal assays met radioactieve reagentia. Een microcentrifugebuis werd gebruikt in zowel celkweek en cytokine kleuringen van de ICS protocol. Vergeleken met de traditionele weefselkweek-plate-gebaseerd systeem, deze aangepaste procedure was makkelijker om te presteren op de bioveiligheid niveau (BL) 3 faciliteiten. Bovendien werden WNV- geïnfecteerde cellen behandeld met paraformaldehyde in beide assays, die verdere analyse buiten BL3 faciliteiten ingeschakeld. Kortom, kunnen deze in vitro immunologische assays worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen in WNV infectie efficiënt beoordelen.
Introduction
West-Nijlvirus (WNV), een neurotropisch, plus-voelde flavivirus, is een opkomende bedreiging voor de volksgezondheid. Op dit moment zijn er geen vaccins zijn goedgekeurd voor menselijk gebruik 1. Een verzwakte WNV stam, die een P38G substitutie in het niet-structurele (NS) 4B eiwit, bekend geen letaliteit bij muizen maar hogere aangeboren cytokinen en T cel responsen in muizen dan wildtype WNV NY99 stam 2 induceren. Muizen geïmmuniseerd met de NS4B-P38G mutant werden allemaal beschermd tegen een secundaire uitdaging met dodelijke wild-type WNV. Dit suggereert dat de NS4B-P38G mutant geschikte kenmerken voor een ideaal vaccin kandidaat. De mechanismen waarmee de NS4B-P38G mutant induceert hoge beschermende adaptieve immuniteit is nog niet duidelijk begrepen. Toll-like receptoren (TLR's), die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen, spelen een essentiële rol in de initiatie van aangeboren immuniteit tegen virale infectie. De kern TLR signaalweg maakt gebruik van myeloïde differentiatie primaire reactie gene 88 (MyD88) als de primaire adapter 3,4. In een recente studie werd MyD88 signalering blijkt een belangrijke rol in de ontwikkeling van celgemedieerde immuniteit spelen tijdens WNV NS4B- P38G mutante infectie bij muizen 5. Dendritische cellen (DCs) zijn één van de belangrijkste antigeen presenterende cellen vertonen de unieke capaciteit tijdens virale infectie 6,7 primaire T-cel responsen leiden. CD4 + en CD8 + T-cellen dragen bij tot langdurige beschermende immuniteit en zijn belangrijk voor gastheer overleven na wildtype WNV infectie 8,9. Twee immunologische assays werden bij dit onderzoek naar de functie van deze cellen in de NS4B-P38G mutant geïnfecteerde muizen te beoordelen.
Eerst werd een in vitro T-cel priming assay gebruikt ter vergelijking de antigenpresenterende vermogen van DCs van WNV-geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen. Om de gevoeligheid van de assay, naïeve CD4 <vergrotensup> + T-cellen werden geïsoleerd uit OTII transgene muizen, die een Vα2 / Vβ5 TCR specifiek voor de kip ovalbumine (OVA) peptide uitdrukken 323 - 339. DC's van WNV geïnfecteerde muizen werden gezuiverd, en co-gekweekt met carboxyfluoresceïne succinimidyl Pasen (CFSE ) -gemerkte CD4 + T-cellen in aanwezigheid van OVA-peptide. Na 5 dagen van co-kweek werden de cellen geoogst en met paraformaldehyde (PFA) vastgesteld en door flow cytometrie geanalyseerd. Proliferatieve assays zijn vanouds door incorporatie van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) of getritieerd thymine deoxyriboside (3 HTdr) 10 uitgevoerd. Toch zijn deze testen zijn ofwel radioactief en / of die bijzondere apparatuur in bioveiligheidsniveau (BL) 3 faciliteiten waar WNV studies worden uitgevoerd. De flowcytometrische analyse van lymfocyt proliferatie door seriële halvering van de fluorescentie-intensiteit van de vitale kleurstof CFSE geworden vaker gebruikt in immunologische assays de kleurstof stabieleren gelijkmatig opgenomen in cellen, gemakkelijk gedetecteerd door flow cytometrie en is nonradioactive 11. De test heeft ook de mogelijkheid om het aantal celdelingen beoordelen. Een groot voordeel van deze assay in WNV studies is dat fixatie van de geïnfecteerde cellen met 1-2% PFA WNV 12, die monsterverzameling mogelijk maakt met een flowcytometer in BL2 laboratorium kunnen inactiveren.
Vervolgens werd een gemodificeerd intracellulaire cytokine kleuring (ICS) procedure gebruikt om de rol van MyD88 signalering in regulatie van WNV specifieke T cel responsen in NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde muizen te bestuderen. In deze test werden splenocyten geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen behandeld in vitro met WNV specifieke peptiden. Brefeldine A werd toegevoegd aan de cytokinen in de cel behouden. Na 5 uur incubatie werden cellen geoogst, gewassen en gekleurd voor T cel subsets. Cellen werden vervolgens gefixeerd in PFA, gepermeabiliseerd en gekleurd voor interferon (IFN) -γ en geanalyseerd met flow cytometrie.Zoals bij andere flowcytometrie gebaseerde bepaling, wanneer de cellen worden behandeld met fixatie en permeabilisatie buffer met PFA, geïnfecteerde monsters kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking en analyse. In verschillende gepubliceerde studies, hebben we gebruik ICS T celeffectorfuncties meten WNV-geïnfecteerde muizen 13,14. Hoewel het goed gevestigd, een belangrijk nadeel van deze test is dat de procedure zeer langdurig en tijdrovend wanneer deze binnen BL3 voorzieningen kunnen zijn. Hier werd een micro-centrifugebuis ICS-methode getoond haalbaarder, gemakkelijker te gaan en minder tijdrovend wanneer deze binnen een BL3 laboratorium zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Texas Medical Branch.
1. Isolatie van DC's van niet-geïnfecteerde en-WNV geïnfecteerde muizen
- Leeftijd en sekse match 6-10 weken oud, wild-type C57BL / 6 (B6) en MyD88 - / - muizen. Te enten intraperitoneaal (ip) met 500 plaque vormende eenheid (PFU) van WNV NS4B- P38G mutant. Op dag 3 na de infectie, euthanaseren B6 en MyD88 - / - muizen met CO 2. Gebruik van niet-geïnfecteerde muizen van beide groepen als controles. Met drie muizen per groep.
- Natte vacht aan de linkerkant van opgeofferd muis met behulp van 70% ethanol en weggesneden de vacht langs de linkerkant van de muis, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten. Opengesneden de lichaamsholte. Verwijder de milt met behulp van de tang. Plaats de milt in een petrischaal met RPMI.
- Isoleer milt DCs met anti-CD11c magnetische parels volgensinstructies van de fabrikant.
2. Zuivering en Labeling van T-cellen van OTII transgene muizen
- Oogst een milt van een naïeve OTII muis zoals beschreven in stap 1.2 en homogeniseer de milt tussen de matte uiteinden van twee dia. Breng de celsuspensie aan een 15 ml conische buis, voeg RPMI-medium tot 14 ml. Laat de suspensie zitten 5 minuten en breng 13 ml aan een nieuwe 15 ml conische buis.
- Isoleer milt CD4 + T-cellen met een CD4 + T cel isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Overdracht cellen in een 50 ml conische buis, twee keer wassen met PBS. Resuspendeer cellen in PBS met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 1 x 10 6 cellen per ml en voeg 0,5 umol / ml CFSE. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min, beschermd tegen licht.
- Voeg 5 ml koud compleet medium (RPMI-1640 met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1/100 volantibiotica / antimycotica, 1/100 volume L-glutamine en 1 / 1,000 vol 1,000 x 2-mercaptoethanol).
- Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Was de cellen eenmaal met PBS, vast 0,2 x 10 6 gelabelde CD4 + T-cellen in 2% PFA en verwerven op een flowcytometer. Gebruik dit monster naar het basale niveau van CFSE bepalen. Resuspendeer de rest van gelabelde cellen in compleet medium.
3. Co-cultuur OTII T-cellen met DC's van WNV-geïnfecteerde muizen
- Culture 2 x 10 5 gezuiverde CD4 + T-cellen van muizen OTII alleen of met gezuiverd DCs wild-type of MyD88 - / - muizen (2 x 10, 4) in een 24 wells plaat met of zonder OVA resten 323-339 (1 g / ml) in 1 ml compleet medium per putje.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 dagen. Oogst cellen, was twee keer in FACS-buffer (PBS met 1% FBS) en bevestig in 0,25 ml 2% PFA. Vortex onmiddellijk.
4. Flowcytometrieanalyse van In Vitro </ Em> T Cell Priming
- Voor overname, dubbelklik op de flowcytometrie software icoon. Voor een dichtheid perceel van lineaire FSC-A versus lineaire SSC-A, kanalen te selecteren 0 tot 200.000 op FSC-A en 0 tot 200.000 op SSC-A. Maak vervolgens een poort op levende cellen (P2; zie figuur 1A).
- Om de fluorescentie-intensiteit van CFSE analyseren, opent u het histogram voor de FL1 kanaal en het verwerven van 20.000 evenementen op de gated bevolking. Het opzetten van een marker op monsters voor OTII cellen alleen gekweekt (Figuur 1A).
- Verwerven monsters OTII cellen samen gekweekt met wildtype DCs (Figuur 1B) of MyD88 - / - DCs (figuur 1C) op een soortgelijke wijze.
5. Isolatie en Stimulatie van Splenocyten voor cytokine Testen
- Infecteren B6 en MyD88 - / - muizen met WNV NS4B-P38G mutant volgens dezelfde procedure zoals beschreven in step 1.1. Op dag 30 na de infectie, re-challenge overlevende muizen met 2000 PFU van de wild-type WNV stam ip Op dagen 8 en 21 post-primaire WNV infectie of op dag 4 na secundaire infectie, euthanaseren muizen met CO 2 voor het verzamelen van de milt .
OPMERKING: We gebruikten 2-3 muizen per groep voor elk tijdstip. - Voeg een enkele celsuspensie van splenocyten zoals beschreven in stap 1.2 en stap 2.2. Tellen cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in 10 ml compleet medium.
- Verdun cellen met volledig medium tot 2,5 x 10 6 cellen / ml. Voeg 1 ml splenocyten in 1,5 ml micro-centrifugebuis.
- CD8 + T-cellen simuleren verdunnen WNV specifiek NS4B en E peptiden (SSVWNATTA en IALTFLAV) tot 1 mg / ml in DMSO. Voor stimulatie van CD4 + T-cellen, verdund WNV specifieke NS3 en E peptiden (RRWCFDGPRTNTILE en PVGRLVTVNPFVSVA) tot 1 mg / ml in DMSO. Voeg 10 ul van peptiden aan de cellen followed met 1 pl Brefeldine A oplossing. Gebruik cellen zonder peptiden behandeling als controles. Meng de cellen.
- Punch twee gaten met een 18 G naald in de dop van de buis. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 uur.
6. intracellulaire cytokine kleuring
- Overdracht cellen om een nieuwe micro-centrifugebuis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300-400 xg en giet af supernatant. Voeg 1 ml FACS buffer, draai 5 min bij 300-400 xg en opnieuw te schorten cellen door pipetteren met 120 ul FACS buffer.
- Voeg 2 pi Fc blokker en incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 1 ml FACS-buffer aan elke buis. Spin 5 min bij 300-400 x g.
- Re-schorten cellen in 300 ul FACS buffer en ze splitsen in drie buizen (ongeveer 0,8 x 10 6 cellen per buis). Zoals getoond in tabel 1, behouden de eerste buis van elke kweekomstandigheid voor rat IgG-PE-kleuring. Voor de tweede buis, voeg 3 ul van anti-CD4 APC CD4 peptiden behandelde cellen, 3 μl anti-CD8 FITC CD8 peptiden behandelde cellen of beide antilichamen aan cellen zonder peptiden behandeling. Gebruik de derde buis tot schadevergoeding kleuring. Voor elke cultuur staat, gebruik drie buizen van cellen gekleurd met APC-geconjugeerde CD4, FITC-geconjugeerd CD8 of PE- gelabelde CD3 antilichamen alleen (3 pi per buis) als compensatie controles voor VT1, VT2 en FL4 kanalen.
- Vortex cellen kort. Vertrekken op ijs gedurende 20 minuten en bescherming tegen licht. Voeg 1,4 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en giet af supernatant.
- Ageren naar cel pellet (of kort vortex) verstoren. Re-schorten cel pellet in 250 ul fixatie / permeabilisatie solutionby pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en bescherm tegen licht.
- Voeg 1,2 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 300 pi FACS-buffer.
OPMERKING: Op dit punt cellen kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking of in de koelkast bewaard en beschermd tegen licht for up drie dagen. - Voeg 500 pi FACS-buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 500 ul van 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g.
- Re-schorten cellen in 100 ul 1x Perm / Wash, voeg 3,5 ul anti-IFNy-PE aan de buis eerder toegevoegde met antilichamen voor CD4 en / of CD8 T-cel markers in stap 6.3 en 3.5 pi rat IgG-PE in de buis voorbehouden voor IgG controle gedurende 25 min op ijs en bescherming tegen licht. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g. Herhaal de wasstap door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer.
- Spin 5 min bij 300-400 xg en decanteer supernatant. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml van FACS buffer en opnieuw op te schorten in 400 pi van FACS-buffer voor de definitieve overname.
7. Flowcytometrieanalyse van intracellulaire cytokine kleuring
- Gebruik dezelfde overname instellingen als in stap 4.1. Create een poort op levende cellen (P2; zie figuur 2A). Stel de spanningen met de compensatie buizen voor elke groep.
- Open twee nieuwe puntdiagrammen, een tot gegevens die zijn verzameld voor FL1 vs weer te geven. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), en de andere is om gegevens verzameld FL4 vs weergegeven. VT2 (CD4 vs. IFN-γ). Verwerven 50.000 evenementen voor de gated bevolking van elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de T-cel priming test CFSE gelabelde CD4 + T-cellen werden gekweekt met gezuiverd DCs uit de NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen in de aanwezigheid of afwezigheid van OVA-peptiden. Gelabelde T cellen alleen gekweekt met of zonder OVA gedurende 5 dagen werden als negatieve controles. Zoals getoond in figuur 1A, zijn de totale T-cellen gated voor analyse van de fluorescentie-intensiteit op het FL1 kanaal. De markering is ingesteld gebaseerd op de vers gemerkte CD4 + T-cellen op dag 0 op de proliferatiesnelheid zonder gelijktijdige kweek van DCs bepalen. Er was een laag niveau van proliferatie tarief (1,6%) onder deze cultuur staat. Dezelfde marker werd gebruikt om de proliferatiesnelheid van CD4 + T-cellen samen gekweekt met DC op 10 bepalen: 1 ratio. Vanwege hun hoge verhouding in de co-cultuur en hun proliferatieve aard, kunnen T-cellen worden gated de gemengde populaties zonder extra fenotypische staining. Zoals getoond in figuur 1B, is er een proliferatiesnelheid 87.0% in wild-type groep, weergegeven in één representatief voor drie monsters behandeld onder dezelfde omstandigheden. Bovendien CFSE-gelabelde T-cellen samen gekweekt met DCs van MyD88 - / - muizen in de aanwezigheid van OVA had 74,5% proliferatiesnelheid (figuur 1C). Zo is de proliferatiesnelheid van OT II CD4 + T-cellen samen gekweekt met DCs van NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde MyD88 - / - muizen was lager dan van die samen gekweekt met DCs uit wild-type muizen. Deze resultaten suggereren dat een tekort aan MyD88- signaling pathway leidt tot een verminderde antigeen presenterende capaciteit van DC's tijdens NS4B-P38G mutant infectie.
ICS resultaten te analyseren, we gated op de totale splenocyten geïsoleerd van wild-type muizen op dag 8 na de infectie (Figuur 2A), de percentages van de dubbel-positieve populatie (CD4 <sup> + IFNy + en CD8 + IFNy +) in een representatief monster waren respectievelijk 0,4% en 1,7%. De percentages CD4 + IFNy + en CD8 + IFNy + totale splenocyten gated in een representatief monster van MyD88 - / - muizen waren respectievelijk 0,2% en 0,6% (Figuur 2B). Geen verschillen werden opgemerkt in de dubbele positieve populaties van de twee groepen splenocyten zonder peptiden behandeling (gegevens niet getoond). Vergelijkbare analyses werden uitgevoerd met splenocyten geïsoleerd uit niet geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen (Figuren 2C en 2D). De percentages van dubbel-positieve populatie (CD4 + IFNy + en CD8 + IFNy +) tussen de twee groepen waren niet verschillend. Verder is in figuur 2A, enkel positief populaties van CD4+ En CD8 + T-cellen waren 21% en 13,3% van de totale gated splenocyten. Overwegende toonden ze 15,9% en 11,2% van MyD88 worden - / - splenocyten (Figuur 2B). Vergeleken met de geïnfecteerde groepen, de verschillen in het percentage interne positief populaties tussen de twee niet-geïnfecteerde wildtype en MyD88 - / - muizen waren veel lager (19,1% vs. 18,4% CD4 + T-cellen, 15.7% vs. 13,3% voor CD8 + T-cellen). / - - Muizen in vergelijking met het wild-type groep op dag 8 post-NS4B- P38G mutant infectie met elkaar gecombineerd, werden zowel CD4 + en CD8 + T cel responsen in MyD88 verminderd. Een vergelijkbare analyse werd uitgevoerd voor monsters op dag 21 na infectie. Zoals getoond in figuur 3A en 3B, het percentage CD4 + IFNy + totale splenocyten in MyD88 <sup> - / - groep (0,1%) was iets lager dan de wildtype-groep (0,2%). De enige positieve populatie van CD4 + T-cellen in MyD88 - / - groep (17%) was lager dan die van wild-type groep (20,6%). In vergelijking, noch het percentage van CD8 + IFNy + noch het percentage van één positieve populatie van CD8 + T-cellen verschilde tussen de twee groepen. Op dag 4 post-secundaire infectie, de percentages van de dubbele positieve populaties (CD4 + IFNy + en CD8 + IFNy +) in een representatieve steekproef van wild-type groep waren respectievelijk 0,3% en 0,5% (figuur 4A). De percentages CD4 + IFNy + en CD8 + IFNy + totale splenocyten gated in een representatief monster van MyD88 - / - groep was 0,1% en 0,2% (Figuur 4B). Verder, het enige positieve populatie van CD4 + en CD8 + T-cellen was 18.7% en 15.8% van splenocyten van wildtype muizen. Overwegend dat dit percentage verlaagd 12,1% en 12,3% in MyD88 - / - muizen (Figuur 4B). Bij samenvatting van deze resultaten wordt MyD88 signalering betrokken bij de initiële T-cel activatie van beide populaties en bijdraagt aan CD4 + T-celrespons in een later stadium van de infectie. Het is ook betrokken in CD4 + en CD8 + T cel responsen.
Figuur 1:. DC-antigeen-presenterende capaciteit in wildtype en MyD88 - / - muizen in NS4B- P38G infectie CFSE gelabelde CD4 + T-cellen werden alleen (A) samen gekweekt of DCs van WNV-NS4B-P38G mutant- geïnfecteerde wildtype (B) en MyD88 - in aanwezigheid van OVA 323-339 muizen (C) - /. Cellen werden geoogst op dag 5, gated op T-cellen op basis van FSC / SSC (links panelen) en zijn voor hun proliferatie tarieven (rechts panelen) geanalyseerd. Een vertegenwoordiger van de drie monsters in elke groep werd getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 2: T cellen in een vroeg stadium van WNV NS4B-P38G infectie splenocyten werden geïsoleerd uit WNV NS4B-P38G mutant- geïnfecteerde wildtype (A) en MyD88 - / - muizen (B) op dag 8. Als controles splenocyten werden uit niet geoogstgeïnfecteerde wildtype (C) en MyD88 - / - muizen (D). Cellen werden gekweekt ex vivo met WNV peptiden voor 5 uur, geoogst en gekleurd voor IFNy en CD4 of CD8. Totaal splenocyten uit elke groep werden afgesloten (P2) en geanalyseerd. De puntdiagrammen getoond zijn een vertegenwoordiger van drie monsters in elke groep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 3: T cellen in late stadium van WNV NS4B-P38G infectie splenocyten werden geïsoleerd uit WNV NS4B-P38G mutant- geïnfecteerde wildtype (A) en MyD88 - / - muizen (B) op dag 21. De cellen werden gekweekt ex vivo met WNVpeptiden 5 uur, geoogst en gekleurd voor IFN-γ en CD4 of CD8. Totaal splenocyten uit elke groep werden afgesloten (P2) en geanalyseerd. Een vertegenwoordiger van de drie monsters in elke groep werd getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: T cel responsen tijdens secundaire provocatie met wildtype WNV muizen die overleefden van een primaire infectie met WNV NS4B-P38G mutant werden opnieuw geïnfecteerd met een LD 100 wildtype WNV.. Op dag 4 post-secundaire infectie, werden splenocyten geïsoleerd van WNV NS4B-P38G mutant- besmet wild-type (A) en MyD88 - / - muizen (B). Cellen werden gekweekt ex vivo met WNV peptiden voor 5 uur, harveSTED en gekleurd voor IFN-γ en CD4 of CD8. Totaal splenocyten uit elke groep werden afgesloten (P2) en geanalyseerd. Een vertegenwoordiger van de drie monsters in elke groep werd getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WNV is een BL3 pathogeen. Vanwege veiligheidsvoorschriften, worden immunologische tests met WNV besmette monsters vaak beperkt door de beschikbaarheid van apparatuur op BL3 faciliteiten of meer langdurig en vervelend om te presteren. In een recente studie, gebruikten we twee stroomcytometrie gebaseerde methoden om celgemedieerde immuunresponsen bestuderen gedurende WNV infectie 5. In beide assays werden WNV-geïnfecteerde cellen behandeld met 1-2% PFA rechtstreeks of fixatie / permeabilisatie oplossing met 4% PFA. Het is bekend dat 1% PFA gefixeerd met virus geïnfecteerde cellen efficiënt kunnen verminderen het aantal infectieuze deeltjes beneden de detectielimieten 12. Daarom hebben beide methoden aanzienlijk verminderd de prestaties tijd binnenshuis BL3 faciliteiten. Vele gevestigde assays voor T-celproliferatie, waaronder die door incorporatie van BrdU of radioactief thymidine te meten, de flowcytometrie-gebaseerde in vitro T-cel priming test met CFSE gemerkte OTII T cellen mor verstrekte nauwkeurige bepaling van het percentage prolifererende CD4 + T-cellen met aanzienlijk verbeterde algehele gevoeligheid. Hier, 10: 1 verhouding voor DC en T-cellen werd gebruikt om antigeen presenterende capaciteit tijdens WNV infectie efficiënt definiëren. Een dosistitratie aanbevolen om gelijkstroomfuncties studie tijdens de infectie met een pathogeen, omdat deze verhouding kan afwijken. ICS is een veelgebruikte flowcytometrie gebaseerde bepaling antigeen specifieke T cel responsen bestuderen. Toch is de procedure duurt lang en bevat celcultuur en meerdere stappen van wassen en kleuring van cellen. Het is mogelijk lastig bij het uitvoeren bij BL3 faciliteiten. We hebben het protocol aangepast zodat de cellen in eerste instantie werden gestimuleerd met WNV specifieke peptiden in een micro-centrifugebuis in plaats van een weefselkweek plaat. Vervolgens werden de cellen gewassen en gekleurd in de micro-centrifugebuisjes in plaats van conisch. Deze wijzigingen hebben het hele proces geactiveerd wordt uitgevoerd in een bioveiligheid kastmet behulp van een micro-centrifuge machine, die de desinfecterende procedure van centrifugeren cellen buiten de bioveiligheid kast geëlimineerd. Cellen werden ook verkregen in de micro-centrifugebuizen door een flowcytometer. Kortom, had de micro-centrifugebuis systeemtijd en moeite (ongeveer 2 uur) in ICS vergelijking met de traditionele weefsel kweekplaat gebaseerde test opgeslagen. Ten slotte doet de microcentrifugebuisje methode geen speciale eis instrument, dat is economisch en biedt meer flexibiliteit in de prestaties. Bovendien was het gemakkelijker minder tijdrovend, wat uiteindelijk toegenomen cel levensvatbaarheid (data niet getoond) voert en. Er is één kleine veiligheidsprobleem door het gebruik van 18 G naald opzetten celkweek ICS.
Onderzoek van het mechanisme waarmee WNV NS4B-P38G mutant induceert hogere beschermende immuniteit kan worden gebruikt als een paradigma om te helpen bij de rationele ontwikkeling van andere doeltreffende levende verzwakte flavivirus vaccins. Door ICS en in vitro T-cel priming assays hebben we aangetoond dat MyD88 signalering is belangrijk voor de ontwikkeling van celgemedieerde adaptieve immuniteit tijdens WNV NS4B-P38G mutant infectie. Noch test is specifiek ontworpen voor WNV. Ze kunnen ook worden gebruikt om DCs en T celfuncties ervan met monsters geïnfecteerd met andere BL3 middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
