Abstract
Ett försvagat West Nile-virus (WNV), en icke-strukturell (NS) 4B-P38G mutanten, inducerade högre medfödda cytokin och T-cellsvar än vildtyp WNV i möss. Nyligen, myeloid differentieringsfaktor 88 (MyD88) signalering visades vara viktiga för initial T-cell priming och cellutveckling minne T under WNV NS4B-P38G mutant infektion. I denna studie två flödescytometri-baserade metoder - ett in vitro T-cell priming analys och en intracellulär cytokin färgning (ICS) - användes för att bedöma dendritiska celler (DC) och T-cellfunktioner. I den T-cell priming test, har cellproliferation analyserades med flödescytometri efter samodling av DCs från båda grupperna av möss med karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) - märkt CD4 + T-celler av OTII transgena möss. Detta tillvägagångssätt gav en noggrann bestämning av andelen prolifererande CD4 + T-celler med väsentligt förbättrad övergripande känslighet än traditionenal-analyser med radioaktiva reagens. Ett mikrocentrifugrör system användes i både cellkultur och cytokin färgningsförfaranden av ICS-protokollet. Jämfört med traditionella vävnadsodlingsplatta baserat system, denna modifierade förfarande var lättare att prestera på skyddsnivå (BL) 3 anläggningar. Dessutom har WNV- infekterade celler som behandlats med paraformaldehyd i båda analyserna, vilket möjlig ytterligare analys utanför BL3 anläggningar. Sammantaget kan dessa in vitro immunologiska analyser användas för att effektivt utvärdera cellförmedlade immunsvar under WNV-infektion.
Introduction
West Nile-virus (WNV), en neurotrop, plus-avkända flavivirus, är en ny folkhälsorisk. För närvarande har inga vacciner godkänts för humant bruk 1. En försvagad WNV-stam, som har en P38G substitution i den icke-strukturella (NS) 4B-protein, är känd för att inducera någon letalitet hos möss men högre medfödda cytokiner och T-cellsvar i möss än vildtyp WNV NY99-stam 2. Möss immuniserade med NS4B-P38G mutanten var alla skyddade från en sekundär utmaning med dödliga vildtyp WNV. Detta tyder på att NS4B-P38G mutant har lämpliga egenskaper för en perfekt vaccinkandidat. De mekanismer genom vilka NS4B-P38G mutant inducerar hög skyddande adaptiv immunitet är inte klart ännu. Toll-liknande receptorer (TLR), som erkänner patogen-associerade molekylära mönster, spela en viktig roll i initieringen av medfödd immunitet mot virusinfektion. Vägen kärn TLR signalering utnyttjar myeloid differentiering primära svaret GEne 88 (MyD88) som primär adaptern 3,4. I en nyligen genomförd studie, fick MyD88 signalering visat sig spela en viktig roll vid utvecklingen av cellmedierad immunitet under WNV NS4B- P38G mutant infektion hos möss 5. Dentritic celler (DC) är en av de viktigaste antigenpresenterande celler som uppvisar den unika förmågan att initiera cellsvar primära T under virusinfektion 6,7. CD4 + och CD8 + T-celler både bidrar till långvarig skyddande immunitet och är viktiga för värd överlevnad efter vildtyp WNV infektion 8,9. Två immunologiska analyser användes i denna studie för att utvärdera funktionerna hos dessa celler i muterade infekterade möss NS4B-P38G.
Först var ett in vitro T-cell priming analys som ska jämföra den antigenpresenterande förmågan hos DCs av WNV-infekterade vildtyp och MyD88 - / - möss. För att öka känsligheten för analysen, naiva CD4 <sup> + T-celler isolerades från OTII transgena möss, som uttrycker en Vα2 / Vβ5 TCR specifik för kycklingovalbumin (OVA) peptid 323 - 339. DCs av WNV infekterade möss renades och samodlades med karboxifluorescein succinimidyl påsk (CFSE ) -märkt CD4 + T-celler i närvaro av OVA-peptid. Efter 5 dagar av samodling, skördades cellerna och fixerades med paraformaldehyd (PFA) och analyserades med flödescytometri. Proliferativa analyser har traditionellt utförts genom inkorporering av 5-bromo-2'-deoxiuridin (BrdU) eller tritierat tymin deoxyriboside (3 HTdr) 10. Ändå är dessa analyser är antingen radioaktiva och / eller i behov av speciell utrustning på skyddsnivå (BL) 3 anläggningar, där WNV studier utförs. Den flödescytometrisk analys av lymfocytproliferation genom seriell halvering av fluorescensintensiteten av det vitala färgämnet CFSE har blivit mer vanligt förekommande i immunologiska analyser som färgämnet är mer stabiltoch jämnt införlivas celler, upptäcks lätt genom flödescytometri, och är icke-radioaktiv 11. Analysen har också förmågan att bedöma antal celldelningar. En stor fördel med att använda denna analys i WNV studier är att fixering av de infekterade cellerna med 1-2% PFA kunde inaktivera WNV 12, vilket gör det möjligt för prov förvärv med en flödescytometer i BL2 laboratorium.
Därefter ett förfarande modifierat intracellulär cytokin färgning (ICS) som används för att studera vilken roll MyD88 signalering i regleringen av WNV specifika T-cellsvar i NS4B-P38G muterade-infekterade möss. I denna analys, splenocyter som isolerats från infekterade möss behandlade in vitro med WNV specifika peptider. Brefeldin A tillsattes för att hålla kvar de cytokiner inom cellen. Efter 5 timmars inkubering, skördades celler, tvättades och färgades för T-cellundergrupper. Cellerna fixerades sedan i PFA, permeabiliserades och färgas för interferon (IFN) -γ och analyseras med flödescytometri.Som med andra flödescytometri-baserad analys, när cellerna behandlas med fixering och permeabilization buffert innehållande PFA, infekterade prover kan överföras till en BL2 laboratorium för vidare bearbetning och analys. I flera publicerade studier har vi använt ICS för att mäta T-cell effektorfunktioner i WNV-infekterade möss 13,14. Även om det är väl etablerat, är en stor nackdel med denna analys att förfarandet är mycket tidskrävande och kan vara mer tidskrävande när de utförs inne BL3 anläggningar. Här var ett mikro-centrifugrör baserade ICS-metoden visat sig vara mer genomförbart, lättare att gå vidare och mindre tidskrävande när de utförs inom en BL3 laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Animal Care och användning kommittén vid University of Texas Medical Branch.
1. Isolering av DCs från icke-infekterade och WNV-infekterad möss
- Ålders- och sex- match 6-10 veckor gamla, vildtyp C57BL / 6 (B6) och MyD88 - / - möss. Inokulera intraperitonealt (ip) med 500 plackbildande enhet (PFU) av WNV NS4B- P38G mutant. På dag 3 efter infektion, euthanize B6 och MyD88 - / - möss med CO 2. Använd icke-infekterade möss av båda grupperna som kontroller. Använd tre möss från varje grupp.
- Våt päls på vänster sida av offrade musen med 70% etanol och skära bort pälsen längs vänster sida av musen, ungefär halvvägs mellan fram- och bakben. Skär öppna kroppen hålighet. Ta bort mjälten med hjälp av pincett. Placera mjälten i en petriskål med RPMI.
- Isolera splenovävnader DCs genom användning av anti-CD11c magnetiska pärlor enligttillverkarens instruktioner.
2. Rening och märkning av T-celler i OTII transgena möss
- Harvest en mjälte från en naiv OTII musen som beskrivs i steg 1.2 ovan och homogenisera mjälten mellan frostade ändarna av två bilder. Överför cellsuspensionen till en 15 ml koniskt rör, tillsätt RPMI-medium upp till 14 ml. Låt suspensionen stå i 5 min och överför 13 ml av den till en ny 15 ml koniska rör.
- Isolera mjält CD4 + T-celler genom användning av en CD4 + T-cellisoleringskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Överför celler till en 50 ml koniskt rör, tvätta två gånger med PBS. Resuspendera cellerna i PBS med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) på 1 x 10 6 celler per ml, och lägga 0.5 umol / ml CFSE. Inkubera vid 37 ° C i 10 minuter, skyddade från ljus.
- Tillsätt 5 ml kall fullständigt medium (RPMI-1640 med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 1/100 volymantibiotika / antimykotika, 1/100 vol L-glutamin och 1/1000 vol av 1000 x 2-merkaptoetanol).
- Inkubera på is under 5 min. Tvätta cellerna en gång med PBS, fixa 0,2 x 10 6 märkta CD4 + T-celler i 2% PFA och förvärva på en flödescytometer. Använd detta prov för att bestämma den basala nivån av CFSE. Återuppslamma resten av märkta celler i komplett medium.
3. Co-kultur OTII T-celler med DCs av WNV infekterade möss
- Kultur 2 x 10 5 renade CD4 + T-celler i OTII möss ensam eller med renade DCs av vildtyp eller MyD88 - / - möss (2 x 10 4) i en 24 brunnar med eller utan OVA rest 323-339 (1 g / ml) i 1 ml fullständigt medium per brunn.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 dagar. Harvest celler, tvätta två gånger i FACS buffert (PBS med 1% FBS) och fixa i 0,25 ml 2% PFA. Vortex omedelbart.
4. Flödescytometri Analys av In Vitro </ Em> T Cell Priming
- För förvärv, dubbelklicka på flödescytometri programvaruikonen. För en densitet tomt på linjära FSC-A mot linjär SSC-A väljer kanalerna 0 till 200.000 på FSC-A och 0 till 200.000 på SSC-A. Skapa sedan en grind på levande celler (P2, se figur 1A).
- För att analysera fluorescensintensiteten hos CFSE, öppna histogrammet för FL1-kanalen och förvärva 20.000 händelser gated befolkningen. Sätt upp en markör på prover för OTII celler odlade enbart (Figur 1A).
- Skaffa prover för OTII celler samodlade med vildtyp DC (Figur 1B) eller MyD88 - / - DCs (Figur 1C) på ett liknande sätt.
5. Isolering och Stimulering av Splenocyter för cytokinanalyser
- Infektera B6 och MyD88 - / - möss med WNV NS4B-P38G mutant med hjälp av samma procedur som beskrivs i step 1,1. Vid dag 30 efter infektion, re-utmaning överlevande möss med 2000 PFU av vildtyp WNV stam ip Vid dagarna 8 och 21 efter primär WNV-infektion eller vid dag 4 efter sekundär infektion, euthanize möss med CO 2 för uppsamling av mjältar .
OBS: Vi använde 2-3 möss per grupp för varje tidpunkt. - Gör en enkelcellsuspension av splenocyter som beskrivits ovan i steg 1,2 och steg 2.2. Räkna celler med användning av en hemocytometer och återsuspendera dem i 10 ml komplett medium.
- Späd cellerna med fullständigt medium till 2,5 x 10 6 celler / ml. Tillsätt 1 ml splenocyter i ett 1,5 ml mikro-centrifugrör.
- För att simulera CD8 + T-celler, utspädd WNV specifik NS4B och E peptider (SSVWNATTA och IALTFLAV) och 1 mg / ml i DMSO. För stimulering av CD4 + T-celler, utspädd WNV specifika NS3 och E peptider (RRWCFDGPRTNTILE och PVGRLVTVNPFVSVA) och 1 mg / ml i DMSO. Lägg 10 pl av peptider till cellerna followed med 1 pl Brefeldin En lösning. Använd celler utan peptider behandling som kontroller. Blanda cellerna.
- Punch två hål med en 18 G nål i locket på röret. Inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 h.
6. Intracellulär Cytokine Färgning
- Överför celler till en ny mikro centrifugrör. Snurra celler i 5 minuter vid 300-400 xg och häll bort supernatanten. Tillsätt 1 ml FACS buffert, spinn 5 min vid 300-400 xg och slamma cellerna genom pipettering med 120 pl FACS buffert.
- Tillsätt 2 l Fc blockerare och inkubera cellerna vid rumstemperatur i 10 minuter. Tillsätt 1 ml FACS-buffert till varje rör. Spin 5 min vid 300-400 x g.
- Åter avbryta celler i 300 l FACS buffert och dela upp dem i tre rör (ca 0,8 x 10 6 celler per rör). Såsom visas i tabell 1, reservera det första röret i varje odlingsbetingelse för rått-IgG-PE-färgning. För det andra röret, lägg 3 pl anti-CD4 APC till CD4-peptider-behandlade celler, 3 μl av anti-CD8 FITC till CD8 peptider-behandlade celler eller båda antikroppar mot celler utan peptider behandling. Använd den tredje rör för ersättning färgning. För varje kultur skick, använd tre rör av celler färgade med APC-konjugerad CD4, FITC-konjugerad CD8 eller PE-märkta CD3-antikroppar enbart (3 il per rör) som kontroller ersättning till FL1, FL2 och FL4 kanaler.
- Vortex-celler kortfattat. Lämna på is i 20 min och skydda den mot ljus. Lägg 1,4 ml FACS-buffert. Spin 5 min vid 300-400 xg och häll bort supernatanten.
- Skaka för att störa cellpellet (eller kort vortex). Åter avbryta cellpelleten i 250 pl fixering / permeabilization solutionby pipettering. Inkubera vid rumstemperatur i 20 min och skyddas mot ljus.
- Tillsätt 1,2 ml FACS-buffert. Spin 5 min vid 300-400 xg och återsuspendera cellerna i 300 l FACS buffert.
OBS: Vid denna punkt, celler kan överföras till en BL2 laboratorium för vidare bearbetning eller förvaras i kylskåp och skyddas från ljus för up till tre dagar. - Lägg 500 | il FACS-buffert. Spin 5 min vid 300-400 xg och återsuspendera cellerna i 500 l av 1x permeabilization / tvättbuffert. Spin 5 min vid 300-400 x g.
- Återuppslamma celler i 100 l 1x Perm / Wash, lägga 3,5 l anti-IFNy-PE till röret som tidigare lagt med antikroppar för CD4 och / eller CD8 T-cellsmarkörer i steg 6,3 och 3,5 pl rått-IgG-PE i röret reserverade för IgG-kontroll för 25 minuter på is och skydda den mot ljus. Tvätta cellerna genom att tillsätta 1,4 ml 1x permeabilisering / tvättbuffert. Spin 5 min vid 300-400 x g. Upprepa tvättsteget genom att lägga 1,4 ml 1x permeabilization / tvättbuffert.
- Spin 5 min vid 300-400 xg och dekan supernatanten. Tvätta cellerna genom att tillsätta 1,4 ml FACS buffert och åter suspendera i 400 pl FACS buffert för slut förvärvet.
7. Flödescytometri Analys av intracellulär cytokin färgning
- Använd samma förvärvsinställningar som i steg 4.1. Create en grind på levande celler (P2, se figur 2A). Justera spänningar med hjälp av kompensations rör för varje grupp.
- Öppna två nya punktdiagram, en visa data som samlas in för FL1 vs. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), och den andra är att visa data som samlats in för FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Förvärva 50.000 evenemang för gated befolkningen i varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I T-cellen priming analys, CFSE märkta CD4 + T-celler odlades med renade DC från NS4B-P38G mutant-smittade vildtypen och MyD88 - / - möss i närvaro eller frånvaro av OVA-peptider. Märkta T-celler odlade enbart med eller utan OVA under 5 dagar användes som negativa kontroller. Såsom visas i figur 1A, var totala T-celler gated för analys av fluorescensintensitet på FL1-kanalen. Markören inrättades på grundval av de nyligen märkta CD4 + T-celler på dag 0 för att bestämma spridningstakten utan samodling av DCs. Det var en låg nivå av spridningshastighet (1,6%) under denna kultur tillstånd. Samma markör användes för att bestämma den proliferationshastigheten av CD4 + -T-celler samodlade med DCs vid en 10: 1-förhållande. På grund av deras höga förhållande i samodlingen och deras proliferativa karaktär kan T-celler grindas på de blandade populationer utan ytterligare fenotypiska staining. Som visas i figur 1B, det fanns en 87,0% spridning takt i vildtyp grupp som visas i en företrädare för tre prover som behandlats på samma villkor. Vidare CFSE-märkta T-celler samodlade med DCs av MyD88 - / - möss i närvaron av OVA hade en 74,5% proliferationshastighet (Figur 1C). Således proliferationshastigheten av OT II CD4 + T-celler samodlade med DCs av NS4B-P38G-mutant-infekterade MyD88 - möss var lägre än av de som samodlades med DCs från vildtypsmöss - /. Dessa resultat tyder på att en brist i MyD88- signalväg leder till en försämrad antigenpresenter kapacitet DCs under NS4B-P38G mutant infektion.
För att analysera ICS resultat, vi gated på totala splenocyter isolerade från vildtyp möss vid dag 8 efter infektion (Figur 2A), andelen dubbelpositiva populationer (CD4 <sup> + IFNy + och CD8 + IFNy +) i ett representativt exempel var 0,4% respektive 1,7%. Procentsatserna av CD4 + IFNy + och CD8 + IFNy + av totala splenocyter gated i en representativt urval av MyD88 - / - möss var 0,2% respektive 0,6% (Figur 2B). Inga skillnader noterades i de dubbel positiva populationer av de två grupperna av splenocyter utan peptider behandling (data visas ej). Liknande analyser utfördes med splenocyter isolerade från icke-infekterade, vildtyp och MyD88 - / - möss (figur 2C och 2D). Procentsatserna för dubbel positiva populationer (CD4 + IFNy + och CD8 + IFNy +) mellan de två grupperna var inte annorlunda. Vidare, i figur 2A, de enskilda positiva populationer av CD4+ Och CD8 + T-celler var 21% respektive 13,3% av de totala gated splenocyter. Med beaktande av följande, de visade sig vara 15,9% och 11,2% av MyD88 - / - splenocyter (Figur 2B). Jämfört med de infekterade grupperna, skillnaderna i andelen ensamstående positiva befolkningar mellan de två icke-infekterade vildtyp och MyD88 - / - möss var mycket mindre (19,1% vs. 18,4% för CD4 + T-celler, 15,7% vs. 13,3% för CD8 + T-celler). Kombinerad tillsammans, var både CD4 + och CD8 + T-cellssvar minskas i MyD88 - / - möss jämfört med vildtyp-grupp vid dag 8 efter NS4B- P38G mutant infektion. En liknande analys utfördes för prover som samlats på dag 21 efter infektion. Såsom visas i Figur 3A & 3B, procentandelen av CD4 + IFNy + av totala splenocyter i MyD88 <sup> - / - gruppen (0,1%) var något lägre än vildtyp-gruppen (0,2%). Den enda positiv population av CD4 + T-celler i MyD88 - / - grupp (17%) var också lägre än den för vildtyp-gruppen (20,6%). I jämförelse, varken andelen CD8 + IFNy + heller andelen enda positiv population av CD8 + T-celler var olika mellan de två grupperna. Vid dag 4 efter sekundär infektion, andelen dubbla positiva populationer (CD4 + IFNy + och CD8 + IFNy +) i en representativt urval av vildtyp gruppen var 0,3% respektive 0,5% (Figur 4A). Procentsatserna av CD4 + IFNy + och CD8 + IFNy + av totala splenocyter gated i en representativt urval av MyD88 - / - gruppen var 0,1% och 0,2% (Figur 4B). Vidare, den enda positiv population av CD4 + och CD8 + T-celler var 18,7% och 15,8% av de totala Splenocyterna från vildtypsmöss. För var denna andel minskas 12,1% och 12,3% i MyD88 - / - möss (Figur 4B). I sammanfattning av dessa resultat, är MyD88 signalering involverad i den initiala T-cellsaktivering av båda populationerna och bidrar till CD4 + T-cellssvar vid senare skede av infektionen. Det är också inblandad i minnes CD4 + och CD8 + T-cellssvar.
Figur 1:. DC antigenpresenterförmåga i vildtyp och MyD88 - / - möss under NS4B- P38G infektion CFSE märkt CD4 + T-celler samodlades enbart (A) eller med DCs av WNV-NS4B-P38G mutant- infekterad vildtyp (B) och MyD88 - / - möss (C) i närvaro av OVA 323-339. Celler skördades på dag 5, gated på T-celler baserade på FSC / SSC (vänster paneler) och analyserades för deras spridningshastigheter (höger paneler). En företrädare för tre prover i varje grupp visades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: T-cellsvar på ett tidigt stadium av WNV NS4B-P38G infektion Splenocyter isolerade från WNV NS4B-P38G mutant- infekterad vildtyp (A) och MyD88 - / - möss (B) vid dag 8. Som kontroller, splenocyter skördades från ickeinfekterade av vildtyp (C) och MyD88 - / - möss (D). Celler odlades ex vivo med WNV peptider i 5 h, skördas, och färgas för IFNy och CD4 eller CD8. Totala splenocyter från varje grupp gated (P2) och analyserades. De punktdiagram som visas är en företrädare för tre prover i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3: T-cellsvar på sent stadium av WNV NS4B-P38G infektion Splenocyter isolerade från WNV NS4B-P38G mutant- infekterad vildtyp (A) och MyD88 - / - möss (B) på dag 21. Cellerna odlades ex vivo med WNVpeptider för 5 timmar, skördades och färgades med avseende på IFN-γ och CD4 eller CD8. Totala splenocyter från varje grupp gated (P2) och analyserades. En företrädare för tre prover i varje grupp visades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: T-cellsvar under sekundär utmaning med vildtyp WNV Möss som överlevt från en primär infektion med WNV NS4B-P38G mutant re-infekterade med en LD 100 av vildtyp WNV.. Vid dag 4 efter sekundär infektion, fick splenocyter isolerade från WNV NS4B-P38G mutant- infekterad vildtyp (A) och MyD88 - / - möss (B). Celler odlades ex vivo med WNV peptider för 5 timmar, harvested, och färgades med avseende på IFN-γ och CD4 eller CD8. Totala splenocyter från varje grupp gated (P2) och analyserades. En företrädare för tre prover i varje grupp visades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WNV är en BL3 patogen. På grund av säkerhetsbestämmelser, är immunologiska analyser med WNV-smittade prover ofta begränsas av tillgången på utrustning vid BL3 anläggningar eller mer utdragen och omständlig att utföra. I en nyligen genomförd studie använde vi två flödescytometrisystem baserade metoder för att studera cellmedierade immunsvar under WNV infektion 5. I båda analyserna gjordes WNV infekterade celler som behandlats med 1-2% PFA direkt eller med fixering / permeabilization lösning innehållande 4% PFA. Det är känt att en% PFA fixering av virusinfekterade celler effektivt kunde minska antalet infektiösa partiklar under detektionsgränsen 12. Därför har båda metoderna minskade signifikant prestanda tid inne BL3 anläggningar. Det finns många etablerade analyser för att mäta T-cellsproliferation, eventuellt via en inkorporering av BrdU eller radioaktiv tymidin, den flödescytometri-baserad in vitro T-cell priming analys med CFSE märkta OTII T-celler har gett more noggrann bestämning av andelen prolifererande CD4 + T-celler med väsentligt förbättrad totala känsligheten. Här, en 10: var 1 ratio för DCS och T-celler som används för att på ett effektivt sätt definiera antigenpresenter kapacitet under WNV infektion. En dostitrering rekommenderas att studera DC funktioner under infektion med annan patogen, eftersom detta förhållande kan variera. ICS är ett vanligt använt flödescytometri-baserad analys för att studera antigenspecifika T-cellsvar. Icke desto mindre är förfarandet lång, och inkluderar cellodling och flera steg av tvättning och färgning av celler. Det är potentiellt besvär när du utför på BL3 anläggningar. Vi har ändrat protokollet så att cellerna initialt stimulerades med WNV specifika peptider i en mikro-centrifugrör istället för ett vävnadsodlingsplatta. Därefter tvättades cellerna och färgades inom de eppendorfrören stället för koniska rör. Dessa ändringar har gjort det möjligt för hela processen utförs i ett biosäkerhetsskåpmed hjälp av en mikro-centrifug maskin, som har eliminerat desinfektionsförfarande vid centrifugering celler utanför biosäkerhet skåp. Celler även förvärvat i mikrocentrifugrören med en flödescytometer. Sammantaget hade rörsystemet mikrocentrifug sparade tid och ansträngning (ca 2 h) i ICS jämfört med de traditionella vävnadsodlingsplatta baserad analys. Slutligen gör mikrocentrifugrör metoden inte särskilt instrument krav, som är ekonomiskt och erbjuder större flexibilitet i prestanda. Dessutom var det lättare att utföra och mindre tidskrävande, vilket i slutändan hade ökat cellviabilitet (data ej visade). Det finns en liten säkerhetsrisk på grund av användningen av 18 G nål i inrättandet cellodling för ICS.
Utredning av den mekanism genom vilken WNV NS4B-P38G mutant inducerar högre skyddande immunitet kan användas som ett paradigm till stöd i en rationell utveckling av andra effektiva levande försvagade flavivirus vacciner. Genom att använda ICS och in vitro T-cell priming analyser, har vi visat att MyD88 signalering är viktigt för utvecklingen av cellmedierad adaptiv immunitet under WNV NS4B-P38G mutant infektion. Varken analys är specifik avsedd för WNV. De kan också användas för att bedöma DCS och T-cellfunktioner med prover infekterade med andra BL3 agenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
