Abstract
Attenuiertes West Nile-Virus (WNV), eine nicht-strukturellen (NS) 4B-P38G Mutante induziert höhere angeborenen Cytokin und T-Zell-Antworten als die Wildtyp-WNV in Mäusen. Vor kurzem myeloischer Differenzierungsfaktor 88 (MyD88) Signalisierung wurde gezeigt, während WNV NS4B-P38G mutierte Infektion wichtig für erste T-Zell-Priming und Gedächtnis-T-Zell-Entwicklung zu sein. In dieser Studie wurden zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren - eine in vitro T-Zell-Priming-Assay und eine intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) - wurden verwendet, um dendritische Zellen (DCs) und T-Zell-Funktion zu bewerten. Markierten CD4 + T-Zellen von OTII transgenen Mäusen - im T-Zell-Priming-Assay wurde die Zellproliferation durch Durchflusszytometrie folgenden Co-Kultur von DCs, die aus den beiden Gruppen von Mäusen mit Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) analysiert. Dieser Ansatz vorgesehen eine genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit als der Traditional-Assays mit radioaktiven Reagenzien. Ein Reaktionsgefäß-System wurde in beiden Zellkultur und Zytokin Färbeverfahren des ICS-Protokoll verwendet. Im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte-basierte System, das war modifiziertes Verfahren einfacher, der Sicherheitsstufe (BL) 3 Einrichtungen durchzuführen. Außerdem wurden WNV- infizierten Zellen mit Paraformaldehyd in beiden Assays, die die weitere Analyse außerhalb BL3 Einrichtungen aktiviert behandelt. Insgesamt können diese in vitro immunologischen Assays verwendet werden, um zellvermittelte Immunreaktionen beim WNV-Infektion wirksam zu beurteilen.
Introduction
West-Nil-Virus (WNV), einem neurotropen plus-spürte Flavivirus, ist eine neue Bedrohung der öffentlichen Gesundheit. Derzeit sind keine Impfstoffe für den menschlichen Gebrauch 1 zugelassen. Attenuiertes WNV-Stamm, der eine P38G Substitution in der nicht-strukturellen (NS) 4B Protein, ist dafür bekannt, keine Letalität in Mäusen, aber höher angeborenen Zytokine und T-Zell-Antworten in Mäusen als Wildtyp WNV NY99-Stamm 2 induzieren. Mäuse, die mit der NS4B-P38G Mutante immunisiert wurden alle von einem sekundären Herausforderung mit tödlichen Wildtyp WNV geschützt. Dies deutet darauf hin, dass der NS4B-P38G Mutante geeigneten Eigenschaften für einen optimalen Impfstoffkandidaten. Die Mechanismen, mit denen die NS4B-P38G Mutante induziert hohe Schutz adaptiven Immunität noch nicht genau geklärt. Toll-like Rezeptoren (TLR), die pathogen-associated molecular patterns erkennen, spielen eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der angeborenen Immunität zu Virusinfektion. Der Kern TLR-Signalweges nutzt myeloische Differenzierung primäre Antwort gene 88 (MyD88) als primärer Adapter 3,4. In einer neueren Studie wurde MyD88 Signalisierungs gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von zellvermittelter Immunität während WNV NS4B- P38G Mutante Infektion bei Mäusen 5 zu spielen. Dendritische Zellen (DCs) sind eines der wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen die einzigartige Fähigkeit, primären T-Zell-Reaktionen während der viralen Infektion zu initiieren 6,7 aufweist. CD4 + und CD8 + T-Zellen sowohl für langanhaltende schützende Immunität bei und sind wichtig für die Host-Überlebensrate nach Wildtyp WNV Infektion 8,9. Zwei immunologischen Assays wurden in dieser Studie verwendet, um die Funktionen dieser Zellen in der NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen zu beurteilen.
Zunächst wurde ein in vitro-T-Zell-Priming-Assay verwendet, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der DCs von WNV-infizierten Wildtyp-MyD88 und Vergleichen - / - Mäusen. Um die Empfindlichkeit des Assays, naive CD4 <erhöhensup> + T-Zellen wurden aus OTII transgenen Mäusen, die eine Vα2 / Vβ5 TCR spezifisch für das Hühner-Ovalbumin (OVA) Peptid exprimieren 323 isoliert - 339. DCs von WNV infizierten Mäusen wurden aufgereinigt und co-kultiviert mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ostern (CFSE ) -markierten CD4 + T-Zellen in Gegenwart von OVA-Peptid. Nach 5 Tagen gemeinsamer Kultur wurden die Zellen geerntet und mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Proliferationsassays wurden traditionell durch Einbau von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) oder tritiiertem Thymin desoxyribosid (3 HTdR) 10 durchgeführt. Dennoch sind diese Assays entweder radioaktive und / oder benötigen spezielle Ausrüstungen der Sicherheitsstufe (BL) 3 Anlagen, wo WNV Studien durchgeführt werden. Die durchflusszytometrische Analyse von Lymphozyten-Proliferation durch serielle Halbierung der Fluoreszenzintensität des Vitalfarbstoffs CFSE geworden üblicherweise in immunologischen Assays verwendet werden, wie der Farbstoff stabilerund gleichmäßig in Zellen eingebaut, leicht durch Flusszytometrie nachgewiesen und ist nicht-radioaktiven 11. Der Test hat auch die Fähigkeit, die Anzahl der Zellteilungen zu beurteilen. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser Assays in WNV Studien ist, dass die Fixierung der infizierten Zellen mit 1-2% PFA könnte WNV 12, die Probennahme mit einem Durchflußzytometer in einen BL2 Labor ermöglichen inaktivieren.
Als nächstes wurde ein modifiziertes intrazellulärem Zytokinfärbung (ICS) Verfahren verwendet, um die Rolle von MyD88 Signalisierung in der Regulation der WNV spezifische T-Zellantworten in NS4B-P38G Mutante infizierten Mäusen untersucht. In diesem Test wurden Splenozyten aus infizierten Mäusen isoliert in vitro mit WNV spezifischen Peptiden behandelt. Brefeldin A wurde zugegeben, um die Cytokine in der Zelle zurückzuhalten. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen geerntet, gewaschen und für die T-Zell-Subpopulationen gefärbt. Die Zellen wurden dann in PFA fixiert, permeabilisiert und für Interferon (IFN) -γ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert.Wie bei anderen auf Basis der Durchflusszytometrie-Assay, nachdem die Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Puffer mit PFA behandelten, infizierten Proben können auf eine BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung und Analyse übertragen. In mehreren veröffentlichten Studien haben wir ICS verwendet, um T-Zell-Effektorfunktionen in WNV-infizierten Mäusen 13,14 messen. Obwohl es gut etabliert ist, ist einen großen Nachteil dieses Tests, dass das Verfahren ist sehr langwierig und könnte mehr Zeit in Anspruch, wenn sie innerhalb BL3 Einrichtungen durchgeführt werden. Hier wurde ein Mikrozentrifugenröhrchen Basis ICS Verfahren gezeigt, dass mehr möglich ist, leichter zu gehen und weniger zeitaufwendig, wenn sie innerhalb einer BL3 Labor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Animal Care und Verwenden Committee an der Universität Texas der medizinischen Niederlassung zugelassen.
1. Isolierung von DCs, die aus Nicht-Infizierte und WNV-infizierten Mäuse
- Alters- und geschlechts Spiel 6-10 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6 (B6) und MyD88 - / - Mäusen. Inokulieren intraperitoneal (ip) mit 500 plaquebildenden Einheit (PFU) von WNV NS4B- P38G Mutante. Am Tag 3 nach der Infektion einschläfern B6 und MyD88 - / - Mäuse mit CO 2. Verwendung von nicht-infizierten Mäusen beider Gruppen als Kontrollen. Verwenden Sie drei Mäuse aus jeder Gruppe.
- Nasses Fell auf der linken Seite geopfert Maus mit 70% Ethanol und das Fell weggeschnitten an der linken Seite der Maus, etwa auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine. Schneiden Sie die Körperhöhle. Entfernen Sie die Milz mit Hilfe der Pinzette. Legen Sie die Milz in einer Petrischale mit RPMI.
- Isolieren Milz DCs durch die Verwendung anti-CD11c magnetische Kügelchen nachAnweisungen des Herstellers.
2. Reinigung und Kennzeichnung von T-Zellen von OTII transgenen Mäusen
- Ernte eine Milz aus einer naiven OTII Maus, wie in Schritt 1.2 oben beschrieben und Homogenisierung der Milz zwischen den mattierten Enden von zwei Folien. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen, fügen RPMI-Medium bis zu 14 ml. Lassen die Suspension 5 min stehen und übertragen 13 ml in ein neues 15 ml konischen Röhrchen.
- Isolieren Milz CD4 + T-Zellen unter Verwendung eines CD4 + T-Zell-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers.
- Transfer-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen zweimal mit PBS waschen. Zellen in PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) auf 1 x 10 6 Zellen pro ml und mit 0,5 & mgr; mol / ml CFSE. Bei 37 ° C für 10 min, vor Licht geschützt.
- 5 ml kalter Vollmedium (RPMI-1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1/100 VolAntibiotika / Antimykotika, 1/100 Vol L-Glutamin und 1 / 1.000 Vol 1000 · 2-Mercaptoethanol).
- Inkubieren auf Eis für 5 min. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fix 0,2 x 10 6 beschriftet CD4 + T-Zellen in 2% PFA und erwerben mit einem Durchflusszytometer. Verwenden Sie dieses Beispiel, um das Grundniveau der CFSE bestimmen. Resuspendieren den Rest der markierten Zellen in Vollmedium.
3. Co-Kultur OTII T-Zellen mit DCs von WNV-infizierten Mäuse
- Kultur 2 x 10 5 gereinigten CD4 + T-Zellen von Mäusen OTII allein oder mit gereinigtem DCs von Wildtyp- oder MyD88 - / - Mäusen (2 x 10 4) in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit oder ohne OVA 323-339 Rückstand (1 g / ml) in 1 ml Vollmedium pro Vertiefung.
- Zellen bei 37 ° C für 5 Tage. Ernten Sie die Zellen, waschen zweimal in FACS-Puffer (PBS mit 1% FBS) und befestigen Sie in 0,25 ml 2% PFA. Vortex sofort.
4. Durchflusszytometrie Analyse der In-vitro-</ Em> T-Zell-Priming
- Zur Erfassung, doppelklicken Sie auf die Durchflusszytometrie Software-Symbol. Bei einer Dichte von linearen Plot FSC-A vs. lineare SSC-A, wählen Sie die Kanäle 0 bis 200.000 auf FSC-A und 0 bis 200.000 auf SSC-A. Erstellen Sie dann ein Tor an lebenden Zellen (P2, siehe 1A).
- Um die Fluoreszenzintensität von CFSE analysieren, öffnen Sie das Histogramm für die FL1-Kanal und erhalten 20.000 Events auf der gated Bevölkerung. Eine Markierung auf Samples für OTII Zellen alleine kultiviert (1A).
- Erwerben Sie Proben für OTII Zellen co-kultiviert mit Wildtyp-DC (1B) oder MyD88 - / - DCs (1C) in ähnlicher Weise.
5. Isolierung und Stimulation von Splenozyten für Zytokin-Assays
- Infect B6 und MyD88 - / - Mäuse mit WNV NS4B-P38G Mutante mit dem gleichen Verfahren wie in ste beschriebenp 1,1. Am Tag 30 nach der Infektion erneut Herausforderung überlebenden Mäuse mit 2000 PFU des Wildtyp-Stamms WNV ip An den Tagen 8 und 21 nach der primären WNV-Infektion oder am Tag 4 nach Sekundärinfektion, einschläfern Mäuse mit CO 2 für die Sammlung von Milz .
HINWEIS: Es wird verwendet, 2-3 Mäuse pro Gruppe für jeden Zeitpunkt. - Einen Einzelzellsuspension von Milzzellen wie oben in Schritt 1.2 & Schritt 2.2. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer und resuspendieren sie in 10 ml Vollmedium.
- Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. 1 ml der Splenozyten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Um CD8 + -T-Zellen zu simulieren, verdünnter WNV spezifischen NS4B und E Peptide (SSVWNATTA und IALTFLAV) auf 1 mg / ml in DMSO. Zur Stimulation von CD4 + T-Zellen, verdünnter WNV spezifischen NS3 und E Peptide (RRWCFDGPRTNTILE und PVGRLVTVNPFVSVA) auf 1 mg / ml in DMSO. Zugabe von 10 ul der Peptide an die Zellen followed von 1 ul Brefeldin A-Lösung. Verwenden Zellen ohne Peptide Behandlung als Kontrolle. Mischen Sie die Zellen.
- Stanzen zwei Löcher mit einem 18 G-Nadel in die Kappe der Röhre. Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden.
6. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung
- Übertragungszellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Zellen für 5 Minuten bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand. 1 ml FACS-Puffer, Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen durch Pipettieren mit 120 ul FACS-Puffer.
- Add 2 ul Fc-Blocker und inkubieren Zellen bei Raumtemperatur für 10 min. 1 ml FACS-Puffer zu jedem Röhrchen. Spin 5 min bei 300 bis 400 x g.
- Resuspendieren Zellen in 300 & mgr; l FACS-Puffer und unterteilt sie in drei Rohre (etwa 0,8 x 10 6 Zellen pro Röhrchen). Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, behalten die erste Röhre jeder Kulturbedingung für Ratten-IgG-PE-Färbung. Der zweiten Röhre, werden 3 ul anti-CD4 APC an CD4-Peptiden behandelten Zellen, 3 μl anti-CD8-FITC an CD8 Peptiden behandelten Zellen oder beide Antikörper zu Zellen ohne Peptide Behandlung. Verwenden Sie die dritte Röhre auf Ersatz Färbung. Für jede Kulturbedingungen, verwenden Sie drei Röhren von Zellen mit APC-konjugiertem CD4 FITC-konjugiertem CD8 oder PE-markierten CD3-Antikörper allein (3 ul pro Röhrchen) als Entschädigung Steuerungen für FL1, FL2 und FL4 Kanäle gefärbt.
- Wirbelzellen kurz. Lassen Sie auf Eis für 20 Minuten und vor Licht schützen. Fügen Sie 1,4 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und abgießen Stand.
- Geschwenkt, um den Zellpellet (oder kurz Vortex) zu stören. Re-suspend Zellpellet in 250 ul Fixierung / Permeabilisierung solutionby Pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten und vor Licht schützen.
- Fügen Sie 1,2 ml FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 300 ul FACS-Puffer.
HINWEIS: An diesem Punkt können die Zellen an einen BL2 Labor zur weiteren Verarbeitung in einem Kühlschrank vor Licht u übertragen oder gespeichert und geschütztp bis drei Tage. - Fügen Sie 500 ul FACS-Puffer. Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und resuspendieren Zellen in 500 ul 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 & times; g.
- Re-suspend Zellen in 100 ul 1x Perm / Wash, fügen 3,5 ul anti-IFN-PE auf das Rohr zuvor mit Antikörpern für CD4 und / oder CD8-T-Zellmarker in Schritt 6.3 und 3.5 ul Ratten-IgG-PE in der Röhre vorbehalten hinzugefügt IgG-Steuerung für 25 Minuten auf Eis und vor Licht schützen. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer. Spin 5 min bei 300-400 & times; g. Wiederholen Sie den Waschvorgang durch Zugabe von 1,4 ml 1x Permeabilisierung / Waschpuffer.
- Spin 5 min bei 300 bis 400 · g und dekantieren Stand. Wash-Zellen durch Zugabe von 1,4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 400 & mgr; l FACS-Puffer für die endgültige Übernahme.
7. Durchflusszytometrie Analyse der intrazellulären Zytokin-Färbung
- Verwenden Sie die gleichen Erfassungseinstellungen wie in Schritt 4.1. Create ein Gatter an lebenden Zellen (P2, siehe 2A). Stellen Sie die Spannung über die Entschädigung Rohre für jede Gruppe.
- Öffnen Sie zwei neue Dot-Plots, ein, um Daten für FL1 vs gesammelt anzuzeigen. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), und die andere ist, um Daten für FL4 vs gesammelt wurden. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Erwerben 50.000 Veranstaltungen für die geschlossene Bevölkerung von jeder Probe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In der T-Zell-Priming-Assay wurden CFSE markierten CD4 + T-Zellen mit gereinigtem DCs aus der NS4B-P38G Mutante infizierten Wildtyp-MyD88 und kultiviert - / - Mäusen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OVA-Peptide. Markierten T-Zellen alleine mit oder ohne OVA kultiviert für 5 Tage wurden als negative Kontrollen verwendet. Wie in 1A gezeigt ist, wurden die gesamten T-Zellen für die Analyse der Fluoreszenzintensität von der FL1-Kanal torge. Die Markierung wurde auf der Grundlage der neu markierten CD4 + T-Zellen am Tag 0 festgelegt, um die Proliferationsgeschwindigkeit ohne Co-Kultur von DCs zu bestimmen. Es gab eine geringe Proliferationsrate (1,6%) im Rahmen dieses Kulturbedingungen. Das gleiche Marker wurde verwendet, um die Proliferationsrate von CD4 + T-Zellen co-kultiviert mit DCs bei 10 zu bestimmen: 1-Verhältnis. Aufgrund ihrer hohen Verhältnis in der Co-Kultur und ihre proliferative Natur können T-Zellen von den Mischpopulationen ohne zusätzliche phänotypische Stai gatedning. Wie in 1B gezeigt, gab es eine 87,0% Proliferationsrate in Wildtyp-Gruppe, wie in einem Vertreter der drei unter den gleichen Bedingungen behandelten Proben gezeigt. Weiterhin CFSE-markierten T-Zellen co-kultiviert mit DCs von MyD88 - / - Mäusen in Gegenwart von OVA hatte eine 74,5% Proliferationsrate (Abbildung 1C). Somit ist die Proliferationsrate von OT II CD4 + T-Zellen co-kultiviert mit DCs der NS4B-P38G Mutante infizierten MyD88 - / - Mäusen war niedriger als jener co-kultiviert mit DCs von Wildtyp-Mäusen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Mangel an MyD88- Signalweg führt zu einer Beeinträchtigung der Antigen-präsentierenden Kapazität von DCs während NS4B-P38G mutierte Infektion.
Um ICS Ergebnisse zu analysieren, auf insgesamt Splenozyten von Wildtyp-Mäusen isoliert an Tag 8 nach der Infektion (Abbildung 2A), die Prozentsätze der doppelt positiven Bevölkerungsgruppen bewachten wir (CD4 <sup> + IFNy + und CD8 + IFNy +) in einer repräsentativen Stichprobe waren 0,4% bzw. 1,7%. Die Prozentsätze der CD4 + IFN + und CD8 + IFN + Gesamt Splenozyten in einer repräsentativen Probe von MyD88 gated - / - Mäuse waren 0,2% bzw. 0,6% (2B). Es wurden keine Unterschiede in den doppelt positiven Populationen der beiden Gruppen von Splenozyten ohne Peptide Behandlung festgestellt (Daten nicht gezeigt). - / - Mäusen (2C und 2D) Ähnliche Analysen wurden mit Splenozyten aus nicht-infizierten Wildtyp und MyD88 getrennt durchgeführt. Die Prozentsätze der doppelt positiven Populationen (CD4 + IFN + und CD8 + IFN +) zwischen den beiden Gruppen nicht verschieden waren. Ferner ist in Figur 2A die einzelnen positiven Populationen von CD4+ Und CD8 + T-Zellen waren 21% bzw. 13,3% der Gesamt gated Splenozyten. Während sie gezeigt wurde, 15,9% und 11,2% der MyD88 sein - / - Splenozyten (2B). Im Vergleich zu den infizierten Gruppen, die Unterschiede des Prozentsatzes der einzelnen positiven Populationen zwischen den beiden nicht-infizierten Wildtyp-MyD88 und - / - Mäuse waren viel weniger (19,1% vs. 18,4% für CD4 + T-Zellen, 15,7% vs. 13,3% für CD8 + T-Zellen). - / - Mäusen im Vergleich zum Wildtyp-Gruppe am Tag 8 nach der NS4B- P38G mutierte Infektion miteinander kombiniert wurden sowohl CD4 + und CD8 + T-Zellantworten in MyD88 reduziert. Eine ähnliche Analyse wurde für Proben am Tag 21 nach der Infektion gesammelt geführt. Wie in 3A & 3B, dem Prozentsatz der CD4 + IFN + Gesamt Splenozyten in MyD88 <gezeigtensup> - / - Gruppe (0,1%) etwas geringer war als der Wildtyp-Gruppe (0,2%). Die einzigen positiven Population von CD4 + T-Zellen in MyD88 - / - Gruppe (17%) war auch niedriger als die von Wildtyp-Gruppe (20,6%). Im Vergleich dazu weder der Prozentsatz von CD8 + IFN + noch der Anteil der einzelnen positiven Population von CD8 + T-Zellen verschieden zwischen den beiden Gruppen war. Am Tag 4 nach der Sekundärinfektion, die Prozentsätze der doppelt positiven Populationen (CD4 + IFNy + und CD8 + IFNy +) in einer repräsentativen Stichprobe von Wildtyp-Gruppe waren 0,3% bzw. 0,5% (4A). Die Prozentsätze der CD4 + IFN + und CD8 + IFN + Gesamt Splenozyten gated in einer repräsentativen Probe von MyD88 - / - Gruppe waren 0,1% und 0,2% (4B). Weiterhin war die einzige positive Population von CD4 + und CD8 + T-Zellen 18,7% und 15,8% der gesamten Splenozyten von Wildtyp-Mäusen. - / - Mäusen (4B) Es wurde dieser Prozentsatz als 12,1% und 12,3% in MyD88 reduziert. In Zusammenfassung dieser Ergebnisse wird MyD88 Signalisierung in der anfänglichen T-Zell-Aktivierung beider Populationen beteiligt und trägt an CD4 + T-Zellreaktion in einer späteren Phase der Infektion. Es wird ebenfalls im Speicher CD4 + und CD8 + T-Zell-Antworten beteiligt.
Abb. 1: DC Antigen-präsentierende Fähigkeit in Wildtyp und MyD88 - / - Mäusen während NS4B- P38G Infektion CFSE markierten CD4 + T-Zellen wurden allein (A) co-kultiviert oder mit DCs von WNV-NS4B-P38G mutant- infizierten Wildtyp (B) und MyD88 - / - Mäusen (C) in Gegenwart von OVA 323-339. Die Zellen wurden an Tag 5 geerntet, auf T-Zellen auf Basis von FSC / SSC gated (linke Felder) und für ihre Proliferationsraten (rechte Bilder) analysiert. Ein Vertreter von drei Proben in jeder Gruppe gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
. Abbildung 2: T-Zellreaktionen zu einem frühen Zeitpunkt des WNV NS4B-P38G Infektion Splenozyten wurden von WNV NS4B-P38G isoliert mutant- infizierten Wildtyp (A) und MyD88 - / - Mäusen (B) am Tag 8. Als Kontrollen Splenozyten wurden von nicht geerntetinfizierten Wildtyp (C) und MyD88 - / - Mäuse (D). Zellen wurden ex vivo mit WNV Peptide 5 h, geerntet und für IFN & ggr; und CD4 oder CD8 gefärbt. Gesamt Splenozyten aus jeder Gruppe wurden gated (P2) und analysiert. Die gezeigten Punktdiagramme sind ein Vertreter der drei Proben in jeder Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
. Abbildung 3: T-Zellreaktionen zu späten Stadium der WNV NS4B-P38G Infektion Splenozyten wurden von WNV NS4B-P38G isoliert mutant- infizierten Wildtyp (A) und MyD88 - / - Mäusen (B) Tag 21 Zellen wurden ex vivo mit WNVPeptide 5 h, geerntet und für die IFN-γ und CD4 oder CD8 gefärbt. Gesamt Splenozyten aus jeder Gruppe wurden gated (P2) und analysiert. Ein Vertreter von drei Proben in jeder Gruppe gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4: T-Zellreaktionen während Sekundär Herausforderung mit Wildtyp-Mäuse, die WNV aus einer primären Infektion mit WNV NS4B-P38G Mutante überlebten, wurden mit einer LD 100 von Wildtyp-WNV erneut infiziert.. Am Tag 4 nach der sekundären Infektion wurden Splenozyten von WNV NS4B-P38G isoliert mutant- infizierten Wildtyp (A) und MyD88 - / - Mäusen (B). Die Zellen wurden 5 Stunden, harve ex vivo kultiviert mit WNV Peptidested und für IFN-γ und CD4 oder CD8 gefärbt. Gesamt Splenozyten aus jeder Gruppe wurden gated (P2) und analysiert. Ein Vertreter von drei Proben in jeder Gruppe gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WNV ist ein BL3 Erregers. Aufgrund von Sicherheitsbestimmungen oder immunologische Assays mit WNV-infizierten Proben werden oft durch die Verfügbarkeit von Ausrüstung an BL3 Einrichtungen oder mehr langwierig und mühsam auszuführen beschränkt. In einer aktuellen Studie verwendeten wir zwei Durchflusszytometrie basierenden Verfahren zur zellvermittelten Immunreaktionen beim WNV-Infektion 5 untersuchen. In beiden Tests wurden WNV-infizierten Zellen, die mit 1-2% PFA direkt oder mit Fixierung / Permeabilisierung Lösung mit 4% PFA behandelt. Es ist bekannt, dass 1% PFA Fixation von Virus-infizierten Zellen konnte effizient die Anzahl der infektiösen Partikel unterhalb der Nachweisgrenze 12 verringern. Deshalb haben beide Methoden deutlich die Leistung Zeit in BL3 Einrichtungen reduziert. Es gibt viele etablierte Assays zur T-Zellproliferation, einschließlich jene, die durch Einbau von BrdU oder radioaktivem Thymidin gemessen, die Strömung in vitro T-Zell-Priming-Assay Zytometrie Basis mit CFSE markierten OTII T-Zellen bereitgestellt more genaue Bestimmung des Prozentsatzes von proliferierenden CD4 + T-Zellen mit deutlich verbesserten Gesamtempfindlichkeit. Hier wird ein 10: 1-Verhältnis für DCs und T-Zellen wurde verwendet, um effizient zu definieren antigenpräsentierende Kapazität während WNV-Infektion. Eine Dosisanpassung wird empfohlen, DC-Funktionen während der Infektion mit einem anderen Krankheitserreger zu untersuchen, wie dieses Verhältnis kann sich unterscheiden. ICS ist ein allgemein verwendetes Durchflusszytometrie basierenden Assay, antigenspezifische T-Zellreaktionen zu untersuchen. Dennoch ist das Verfahren langwierig und umfaßt die Zellkultur und mehrere Schritte des Waschens und Färbung der Zellen. Es ist möglicherweise schwierig, wenn die Durchführung in BL3 Einrichtungen. Wir haben das Protokoll modifiziert, so dass die Zellen wurden zunächst mit WNV spezifischen Peptiden in einem Mikrozentrifugenröhrchen statt einer Gewebekultur-Platte stimuliert. Als nächstes wurden die Zellen gewaschen und in Mikrozentrifugenröhrchen statt konische Röhrchen gefärbt. Diese Änderungen haben den gesamten Prozess aktiviert wird in einem Biosicherheitswerkbank durchgeführtmit Hilfe eines Mikrozentrifugenmaschine, die die Desinfektionsverfahren zum Zentrifugieren von Zellen außerhalb des Biosicherheitswerkbank beseitigt haben. Zellen wurden ebenfalls in den Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Durchflußcytometer erworben. Insgesamt hatten die Mikrozentrifugenröhrchen System Zeit und Mühe (ca. 2 h) in ICS im Vergleich zum herkömmlichen Gewebekulturplatte basierenden Assay gespeichert. Schließlich hat der Mikrozentrifugenröhrchen Verfahren keine speziellen Instrument Anforderung, die wirtschaftlich ist und bietet mehr Flexibilität bei der Leistung. Darüber hinaus war es leichter durchführbar und weniger zeitaufwendig, die letztlich angestiegen war die Lebensfähigkeit der Zellen (Daten nicht gezeigt). Es gibt eine kleine Sicherheitsbedenken aufgrund der Verwendung von 18 G-Nadel in die Einrichtung Zellkultur für ICS.
Die Untersuchung des Mechanismus, mit dem WNV NS4B-P38G Mutante induziert höhere schützende Immunität kann verwendet werden, wie ein Paradigma in der Rationalisierung der anderen wirksam abgeschwächten Lebend Flavivirus-Impfstoffe zu unterstützen. Durch den Einsatz von IC-S und in vitro-T-Zell-Priming-Assays haben wir, dass MyD88 Signalisierung dargestellt ist wichtig für die Entwicklung der zellvermittelten adaptiven Immunität bei WNV NS4B-P38G Mutante Infektion. Weder Assay ist spezifisch für WNV gestaltet. Sie können auch verwendet werden, um DCs und T-Zell-Funktionen zu bewerten Proben infiziert mit anderen BL3 Mittel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37 °C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD-Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
