Abstract
Lysin metylering er en ny post-oversettelse modifikasjon og det har blitt identifisert på flere histone og ikke-histonproteiner, hvor den spiller avgjørende roller i celle utvikling og mange sykdommer. Omtrent 5000 lysin metylering områder ble identifisert på ulike proteiner, som er satt av noen titalls protein lysin metyltransferaser. Dette tyder på at hver PKMT methylates flere proteiner, men til nå bare én eller to underlag er identifisert for flere av disse enzymene. Å nærme seg dette problemet, har vi innført peptid matrise basert substratspesifisiteten analyser av PKMTs. Peptid arrays er kraftige verktøy for å karakter spesifisiteten av PKMTs fordi metylering av flere underlag med forskjellige sekvenser kan testes på en array. Vi syntetiserte peptid arrays på cellulose membran ved hjelp av en Intavis SPOT synthesizer og analysert spesifisiteten av ulike PKMTs. Basert på resultatene, for flere av disse enzymene, roman substrates kunne identifiseres. For eksempel, for NSD1 ved anvendelse av peptid-matriser, viste vi at det methylates K44 for H4 stedet for den rapporterte H4K20 og i tillegg H1.5K168 er den svært foretrukket substrat over tidligere kjent H3K36. Derfor peptid arrays er kraftige verktøy til biokjemisk karakteriserer PKMTs.
Introduction
I de siste to tiårene, flere rapporter vist betydningen av post-translasjonelle modifikasjoner (PTM) i mobilnettet utvikling og flere sykdommer som kreft, men nylig protein lysin metylering har dukket opp som en annen viktig PTM. Selv om utgangspunktet Histone lysin metylering ble funnet å være en viktig kromatin mark, viste senere arbeid også lysin metylering av flere ikke-histonproteiner 1-4. Den sekvensielle overføring av metylgrupper fra S-adenosyl-L-metionin til ε-aminogruppen i lysinrester katalyseres av en familie av enzymer som kalles protein lysin metyltransferaser (PKMTs) som inneholder mer enn 60 proteiner i det humane genomet. PKMTs ble først oppdaget som histon modifisere enzymer som metilat spesifikk lysinrest men senere rapporter viste at de kunne også metilat ikke-histonproteiner 5. Opp til nå, ble omtrent 5000 lysin metylering områder identifisert på ulike proteiner 6
Peptid arrays er mye brukt verktøy for biokjemisk analyse av antistoffer, peptid modifiserende enzymer og kartlegging av protein-protein interaksjon sider (antistoff-antigen-reseptor-ligand) 7-9. Flere hundre peptider er nødvendig for such applikasjoner. Forskjellige metoder er tilgjengelige for peptidsyntese, blant dem peptidsyntese på harpiksen blir svært ofte brukt, men har begrensninger i gjennomstrømningen, og det er relativt dyrt. Disse problemene ble løst med innføring av SPOT syntesemetode av Frank og kolleger 10. SPOT syntesemetode tillater syntese av flere hundre peptider i parallell, og i gjennomsnitt er det billig sammenlignet med harpikssyntesen. Peptidene syntetisert på cellulosemembran kan anvendes enten direkte for ulike applikasjoner eller peptider kan bli spaltet fra membranen og anvendt som frie peptider i løsning for analyser eller for å fremstille peptid-mikromatriser 10-13.
SPOT-syntesen er en variant av den faste fase peptid-syntese, som anvender en cellulosemembran som en fast bærer, og anvender standard Fmoc-kjemi 10-13. Derfor syntesen av peptidkjeder begynner ved den C-terminale enden og fortsetter langsden N-terminale ende i motsetning til den biologiske syntese i ribosomer. Cellulosemembraner er funksjonalisert til å feste det første aktiverte aminosyrer (fig. 1). SPOT metoden er basert på den sekvensielle levering av aktiverte aminosyrer i en dråpe av oppløsningsmiddel til definerte steder på membranen ved hjelp av et automatisert system pipettering. Dråpen av flytende dispenseres på den porøse membranen, der den danner en sirkulær våt flekk, som senere opptrer som en åpen reaktor for kjemiske reaksjoner i peptidsyntese. Den punktstørrelse bestemmes av volumet dispenseres og absorpsjonskapasitet av membranen, er multipler av slike flekker anordnet som matriser. Omfanget av syntese korrelerer med punktstørrelse og lastekapasitet av membranen. Avstanden mellom flekker og tettheten av arrays styres ved å variere spot størrelser. Cellulosemembranen har flere fordeler som fast fase i peptidsyntese, det er billig, tolerant til chemicals brukes i peptidsyntese, stabile i vandige oppløsninger og lett å håndtere. I tillegg gjør dens hydrofile natur det passer til flere biologiske analysesystemer. SPOT syntesen kan utføres manuelt eller automatisk (for 1000 av peptider), avhengig av det nødvendige antall peptider. En helautomatisk SPOT synthesizer fra Intavis (Köln, Tyskland) brukes for våre applikasjoner. Det tillater syntese av peptider i forskjellige mengder og med forskjellig lengde. Lineære peptider er regelmessig syntetisert med 15 til 20 aminosyrer lang, i tillegg til peptidene på opp til 42 aminosyre kan også fremstilles ved trinnvis syntese 14,15. Imidlertid øker antallet av aminosyrer fører til reduksjon i den samlede koblings utbytter, noe som påvirker kvaliteten av peptidene. På grunn av den lave mengden av peptider pr flekk, produktene er ofte vanskelig å rense, og kvaliteten på de enkelte peptider ikke lett kan vurderes. Derfor er resultatene hentet fra SPOT PeptIDE matrisene må bli bekreftet enten med peptider syntetisert ved hjelp av standardmetoder i større målestokk, som kan bli renset og analysert i henhold til standarder i peptidsyntese eller ved syntetisering av proteiner inneholdende de ønskede peptidsekvenser. Likevel fant vi SPOT syntese å være svært pålitelig og gir vanligvis å være reproduserbar. SPOT syntese er ikke begrenset til proteinogene aminosyrer, flere kommersielt tilgjengelige modifiserte aminosyrer også kan anvendes for syntese, slik at peptidene for å bli modifisert før og etter den endelige spaltning av sidekjedebeskyttelsesgruppen og, videre, er det også mulig inkorporering av fosforylerte, denaturert eller acetylerte aminosyrer 11.
Immobiliserte peptid-bibliotek syntetisert ved SPOT metoden kan brukes direkte for mange biologiske og biokjemiske analyser. Vi ansatt peptid arrays omfatter 300-400 peptider å undersøke substratspesifisiteten av PKMTs. For enzymatisk modifikation er peptid arrays inkubert med de respektive PKMT og merket [metyl- 3H] -AdoMet i en egnet buffer. Metylering av det respektive substrat blir analysert ved å følge den enzymatiske overføring av de radioaktivt merkede metylgrupper fra AdoMet til det peptidsubstrat via autoradiografi (fig. 3). Ved denne fremgangsmåten kan de peptid-arrays tillater studiet av metylering av ulike peptidsubstrater samtidig. En viktig fordel med denne metoden er at alle peptider er metylert i konkurransen, slik at under den lineære fase av metylering kinetikk, er den relative metylering av hvert peptid proporsjonal med den katalytiske hastighetskonstant dividert med dissosiasjonskonstant (k cat / K D) av enzymet til det respektive peptid-substrat. Derfor er mengden radioaktivitet inkorporert i hver flekk direkte korrelert med den enzymatiske aktiviteten til det bestemte peptidet. BrukeResultatene av et peptid matrise metylering eksperiment, kan spesifisiteten profil av PKMT være definert, og basert på denne nye substrater kan være betinget av. Peptid arrays tillate rask og kostnadseffektiv validering av metylering av nye substrater ved peptid-nivå. For dette er arrays forberedt som inneholder den anslåtte nye underlag sammen med modifiserte peptider som inneholder en Ala istedenfor Lys på målse samt positive og negative kontroll peptider. Endelig kan de nye substrater fremstilles som proteiner sammen med mutanter, hvor målet Lys er endret til Ala og metyleringen kan bli bekreftet på proteinnivå. Avhengig av resultatene, er dette da etterfulgt av biologiske undersøkelser rettet mot potensielle roller metylering av de nylig beskrevet proteinsubstrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Peptide Arrays
- Programmering av peptidsekvensene
- Designe peptidsekvenser for syntesen bruker MultiPep Spotter programvare. Tast peptidsekvensene i enkeltbokstavkoder.
Peptid 1: TARKSTGGKA - Generere alanine eller arginin gange biblioteker med en bestemt kommando (.Sett, A) for å skjerme de viktige aminosyrer som kreves for godkjenning av et definert underlag. For eksempel i det følgende eksempel den første linjen er villtypesekvensen og fra den andre linjen hver aminosyre i et peptid er endret til alanin sekvensielt.
erstatte, A
TARKSTG
En -ARKSTG
T- En -RKSTG
TA-A -KSTG
Målet A -STG
TARK- A -TG
TARKS- En -G
TARKST- A - Bruke lignende kommandoer (.Sett R,.erstatte N ol) som beskrevet i 1.1.2 med alle de naturlig tilgjengelig aminosyrerestene (eventuelt utelate cystein, metionin og tryptofan, fordi disse rester er utsatt for oksydasjon, og noen ganger lavere syntese utbytte) for å syntetisere et peptid matrise for å bestemme konsensus substrat sekvensmotiv for et enzym.
MERK: Som vist i figur 4A, representerer den horisontale aksen den gitte peptidsekvensen, og den vertikale akse representerer de aminosyrer som er valgt kommando for. I likhet med sekvensen vist i 1.1.2, A på den vertikale aksen betyr at en Ala sekvensielt erstatter hver posisjon av den gitte sekvens i den første raden i fig. 4A. Tilsvar arginin sekvensielt erstatter hver aminosyre i den andre raden, og så videre med de andre aminosyrer. Komplett peptid array-biblioteker er syntetisert ved systematisk å erstatte hver rest i den medfølgende peptidsubstratet sekvens med hver av the andre naturlig tilgjengelig aminosyrerester, bidrar dette til å forstå innvirkningen av hver rest i hver posisjon av den gitte sekvens. - Alternativt kan metylering av kjente eller antatte peptidsubstrater lett verifiseres syntetisere peptid biblioteker med målet peptidene PKMT sammen med positive og negative metylering kontroller (dvs. peptider kjent for denaturert eller kjente ikke til å være denaturert). Syntetisere peptider ved å bytte den antatte målet lysin til alanin å bekrefte metylering av målet lysin som vist nedenfor ved manuell programmering.
Vill type peptid: STGG K PRQFL
Mutant peptid: STGG A PRQFL
MERK: Programvaren har også iboende skript for å lage ulike biblioteker, som epitopkartlegging med en ønsket ramme skift av sekvensen å kartlegge viktige aminosyrer som kreves for en interaksjon.
- Designe peptidsekvenser for syntesen bruker MultiPep Spotter programvare. Tast peptidsekvensene i enkeltbokstavkoder.
- Utarbeidelse av Membrane, aminosyrer end Reagenser
- Pre-svelle SPOT membran i DMF (N, N-dimetylformamid) i 10 min og deretter plassere den våte membranen på SPOT synthesizer rammen uten luftbobler eller rynker.
- Vask membranen tre ganger med 100% etanol. Tørk membranene fullstendig i minst 10 minutter før oppstart av synteseprogram.
- Parallelt tilbereder 0,5 M arbeids konsentrasjoner av kommersielt tilgjengelige Fmoc-beskyttede aminosyrer ved å oppløse dem i NMP og også forberede aktivatoren og basen som beskrevet i tabell 1.
- Sørg for at alle avfallsløsning beholdere av SPOT synthesizer ble tømt og fylle de løsemiddel reservoarer med DMF, etanol og piperidine.
MERK: Nå er maskinen klar for syntesen.
- Spotting av den første aminosyren
- For å generere amidbinding med den frie aminogruppe på membranen, aktiverer karboksygruppen til den innkommende aminosyren etter annonseding aktivatoren (N, N'-diisopropylkarbodiimid), og baseløsning (hydroksyimino Etyl cyanoacetat) til aminosyrederivatet.
- Spot de ønskede volumer av aktiverte aminosyrer på amino-funksjonaliserte PEG-membran ved hjelp av den programmerbare roboten.
MERK: Derved blir den C-terminale aminosyren er koblet til aminogruppen av membranen. - Gjenta dette trinnet tre ganger for å sikre bedre kobling av den første aktivert aminosyre. Inkuber membranen i 20 minutter, og deretter vaske med DMF for å fjerne koblede aminosyrer.
- Blokkering av friområder på Non-stikk Områder
MERK: Etter koblingen av den første C-terminale aminosyre av alle peptider til aminogruppen av membranen, må aminogruppene mellom stedene, og også noen av aminogruppene i forenklede områder som ikke danner bindinger med aminosyrer.- Blokkere disse frie aminogrupper ved inkubering med capping-løsning (20% eddiksyreanhydrid i DMF)i 5 min.
MERK: Dette unngår koblingen av aminosyrene i de ytterligere sykluser med membranen i stedet for den voksende peptidkjede.
- Blokkere disse frie aminogrupper ved inkubering med capping-løsning (20% eddiksyreanhydrid i DMF)i 5 min.
- Fjerning av Fmoc Gruppe
- Etter blokkering, vaskes membranen 4 ganger med DMF og deretter inkuberes med 20% piperidin i DMF i 20 min for å fjerne Fmoc beskyttelsesgruppen.
MERK: Dette trinnet fører til fjerning av aminobeskyttelsesgrupper Fmoc grupper, og det kalles deblokkering. - Etterpå vaske membranen to ganger med DMF og to ganger med etanol og la den tørke.
MERK: Nå membranen er klar for kobling av de neste aminosyrer.
- Etter blokkering, vaskes membranen 4 ganger med DMF og deretter inkuberes med 20% piperidin i DMF i 20 min for å fjerne Fmoc beskyttelsesgruppen.
- Kjeden Forlengelse
MERK: Tilsetning av hver aminosyre som kalles en syklus. Bortsett fra koplingen av den første aminosyre, begynner syklusen med avspaltning av Fmoc-gruppen fra det koblede aminosyre, og den etterfølges av kobling av den aktiverte karboksylgruppe av en innkommende aminosyre til aminogruppen av den voksende peptidevannet kjeden.- Gjenta trinn 1.3 og 1.5 inntil det ønskede peptid lengde er oppnådd.
- Farging
MERK: Etter den siste syklusen, er peptid arrays farget med bromfenolblått å bekrefte vellykket syntese av peptider. Bromfenolblått binder seg med de frie aminogrupper av peptidene. Peptidflekker viser lyseblå farge etter fargingen, men intensiteten av stedene varierer avhengig av peptidsekvensen. Denne farging tillater bekreftelse av fullstendig fjerning av piperidin, fordi i nærvær av piperidin bromfenolblått ikke flekker peptidene. I tillegg bidrar det også til å markere peptid arrays for videre bruk.- Når Fmoc-gruppen avbeskyttelse i det siste syntesesyklus, vaske membranen med DMF og 100% etanol. Deretter, behandler membranen med bromfenolblått (0,02% bromfenolblått i DMF) i minst 5 minutter før den helt blir blå.
- Etterpå vaske membranen med DMF og eth-alkohol etterfulgt av tørking i 10 min. Nå tar ut membranen fra synthesizeren og utføre sidekjede avbeskyttelse (§ 1.8) manuelt. Hvis nødvendig, fotografere membranen for å dokumentere resultatene av peptid-syntese (fig. 2).
- Side Chain Avbeskyttelse
- Behandle membranene med 20 til 25 ml av sidekjede avbeskyttelse blanding bestående av 95% trifluoreddiksyre (TFA) for å spalte de sidekjedebeskyttelsesgrupper og scavenger reagenser (2,5% vann og 2,5% triisopropylsilan) for å beskytte sidekjeder av aminosyrer fra modifikasjon i dette trinnet. Ta et tilstrekkelig volum av avbeskyttelse blandingen for å sikre at det dekker membranen helt i en tett lukket kjemikaliebestandig boksen og inkuber det for 1 til 2 timer under forsiktig rysting.
- Vask membranen seks ganger med 20-25 ml DCM (diklormetan) i 2 minutter hver, og til slutt to ganger med 100% etanol og tørkes i en eksikator natten over.
MERK: Nåmembranen kan bli brukt for eksperimenter. En ordning av peptidet matrisen syntesen er gitt i figur 1.
2. Protein Expression og rensing
- Protein Expression of PKMTs som GST Fusions
- Ved hjelp av standardteknikker, klone genet som koder for den fulle lengde PKMT eller dens katalytiske domene i en bakteriell ekspresjonsvektor (som pGEX-6p2) for å uttrykke det som GST-fusjonsprotein.
- Overfør vektor med ønsket PKMT sette inn i BL21 eller BL21 kodon pluss E. coli-celler etter varmesjokkmetoden eller en annen metode.
- Fremstille en pre-kulturen med 30 ml Luria-Bertani (LB) materiale på dagen for ekspresjon og inkuber ved 37 ° C i 7 til 8 timer med kontinuerlig risting.
- Deretter overfører 10 ml av den pre-kultur i en 2 liters store ledeplater kolber inneholdende 1 liter av LB-medium og inkuber ved 37 ° C i kuvøse med kontinuerlig risting inntil kultur rekkeviddees en definert optisk tetthet på 600 nm.
MERK: Selv om dette kan optimaliseres for hvert protein, vi rutinemessig indusere på en OD 600 nm på 0,8. Induksjons temperaturen må optimaliseres for hvert protein individuelt, noen proteiner viser god ekspresjon ved 22 ° C, og noen ved høyere temperaturer. - Skifte cellene til induksjons temperatur i 15 minutter, og deretter fremkalle med 1 mM isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid og tillate kulturen å vokse i 10-12 timer ved induksjon temperatur.
- Etterpå høste cellene ved sentrifugering ved 5000 xg i 15 min, og til slutt vaskes pelleten med 30 ml STE buffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl og 0,1 mM EDTA) og oppbevares ved -20 ° C for videre bruk.
- Protein Rensing
- Tine cellepelleten og re-suspen i 30 ml sonikering buffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycerol) og forstyrre ved ultralydbehandling.
MERK: Denne bufferen needs å være optimalisert for hvert protein etterhvert. - Sentrifuger cellelysatet ved 22.000 x g i 1 time, og senere samle supernatanten og passere gjennom en kolonne inneholdende 600 ul av glutation-Sepharose 4B-harpiks.
- Vask kolonnen med 50 ml buffer og ved ultralydbehandling med 100 ml buffer med høyt saltinnhold (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycerol) for å fjerne uspesifikk bundne proteiner. Eluere det bundne protein med 5 ml av høy saltbuffer inneholdende 40 mM glutation.
- Dialyser den eluerte protein i 2 liter dialysebuffer med lav glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT og 10% glycerol) i 2 timer og deretter i 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT og 70% glyserol i 8 timer eller over natten. Sørg for at alle rense buffere er ved 4 ° C og utfører protein rensing i kjølerommet for å unngå protein denaturering.
- Tine cellepelleten og re-suspen i 30 ml sonikering buffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycerol) og forstyrre ved ultralydbehandling.
3. Peptide Array Metylering
- Pre-incuvestand av Peptide Arrays
- Utføre peptid matrise metylering enten i en boks av passende størrelse, eller i en plastpose for å unngå sløsing av enzym og dyre radioaktivt merket AdoMet. Pre-inkuberes peptidet matrise membran i forseglet plastpose inneholdende de respektive metylering buffer uten enzym og merket [metyl-3H] -AdoMet i 10 min. Volumet av buffer avhenger av størrelsen av matrisen, for eksempel bruke 8 ml metylering buffer for en full spesifisitet profil peptid array. Optimalisere mengden og konsentrasjonen av AdoMet for hvert enzym.
- Metylering av Peptide Arrays
- Kast den pre-inkuberingsbuffer og inkuber membranen i 8 ml metylering buffer inneholdende de respektive PKMT og merket [metyl-3H] -AdoMet i 1 til 2 timer.
MERK: mengden enzym som er nødvendig for en metylering reaksjonen avhenger aktiviteten til bestemte PKMT, initiere vi våre screening eksperimenter vanligvis med 50 Nm enzymfinnenal konsentrasjon.
- Kast den pre-inkuberingsbuffer og inkuber membranen i 8 ml metylering buffer inneholdende de respektive PKMT og merket [metyl-3H] -AdoMet i 1 til 2 timer.
- Vask av Peptide Arrays
- Etterpå forkaste metylering buffer i et radioaktivt avfallsbeholder og vaske peptid matriser for 5 ganger med 20 ml buffer inneholdende 100 mM ammoniumbikarbonat og 1% SDS i 5 minutter for å fjerne det bundne protein. Kast vaskebuffer i et radioaktivt avfallsbeholder.
- Påvisning av radioaktivt Signal
- Etter vaskinger inkuberes membranen i 5 minutter i 10 ml forsterkningsløsning (NAMP100V).
- Deretter kast Forsterke løsning til det radioaktive avfallsbeholderen for organiske løsemidler, forsegle peptid array i en plastpose og legg den i en autoradiography kassett.
- Plasser autoradiography film på peptid array i det mørke rommet. Lukk kassett nøye og utsette det ved -80 ° C i den nødvendige tid. Deretter utvikler filmen for å analysere resultatene. Fange bildet par ganger med forskjellig exposition ganger for å unngå metning av sterkt denaturert peptidsubstrater.
4. Data Processing og analyse
- Densitometrisk Analyse av Spot Intensitet
- Skanne film i en vanlig scanner og analysere spot intensiteter ved densitometri. Gjøre dette ved hjelp ImageJ (som er freeware) eller et kommersielt program.
MERK: Vi bruker Phoretix programvare for denne oppgaven.
- Skanne film i en vanlig scanner og analysere spot intensiteter ved densitometri. Gjøre dette ved hjelp ImageJ (som er freeware) eller et kommersielt program.
- Normalisering og Averaging av resultater fra ulike Membraner
- Gjennomføre peptid matrise metylering eksperimenter i det minste i tre eksemplarer. Normalisere skannede intensiteter for hvert forsøk med bakgrunn subtraksjon og sette aktiviteten ved en referanse substrat som 1.0. Gjennomsnittlig dataene for de enkelte flekker og rapportere dem som gjennomsnittsverdier og standardavvik.
- Data Analysis og skjerm
- Plotte dataene i 2D ved hjelp av en gråtone eller fargevalg for å indikere den relative aktivitet. Gjør dette with Excel eller Sigmaplot som vist her. Også fremstille et plott av fordelingen av standardavvikene til de gjentatte eksperimenter for å analysere kvaliteten av dataene.
- For å sammenligne og viser nøyaktigheten av erkjennelsen av hver rest i substratet peptid kvantitativt, beregne den relative preferanse for PKMT for hver aminosyre i ved posisjonen x ved en diskrimineringsfaktor D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Hvor v i er frekvensen av metylering av peptidet variant bærer aminosyren i posisjon i x og <v j ≠ i> er den gjennomsnittlige hastighet på metylering av alle 19 peptider som bærer en annen aminosyre j ≠ I ved posisjon x (inkludert villtypesekvensen).
MERK: diskriminering faktor definert av dette avhenger av bakgrunnsnivå. Hvis bare en rest aksepteres på en bestemt posisjon med en bakgrunn på 3%, en diskrimineringsfaktor på 32,3 ble erholdt. Ingen preferanse på en posisjon resulterer i en diskriminering faktor på 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptid arrays ble med hell brukt til biokjemisk karakter spesifisiteten av PKMTs, og flere roman histone og ikke-histone substrater av PKMT ble identifisert ved denne tilnærmingen 5,16-19. Definere riktig underlaget spekteret av en PKMT (eller en hvilken som helst enzym) er et viktig skritt videre i forståelsen av sin molekylære mekanismen og cellulære funksjoner.
Som et eksempel på anvendelsen av peptidet SPOT matrise metylering fremgangsmåte, beskriver vi resultatene av spesifisitet analyse av NSD1 PKMT 19. Tidligere til vårt arbeid, dette enzymet ble beskrevet til metilat flere underlag, inkludert histon H3 på K36 og histon H4 ved K20, men også NF-kB familie transkripsjonsfaktor p65 på K218 og K221. Fig. 4A viser et eksempel på en metyleringen av et peptid array med NSD1. For dette forsøk, et stort peptid gruppe basert på H3 (31-49) sekvens ble syntetisert som inneholder alle muligeenkelt aminosyre endringer av den opprinnelige sekvensen for å teste betydningen av hver aminosyre for NSD1 interaksjon og metylering. I alt 380 peptider ble syntetisert (20 mulige aminosyrer x 18 rester pluss én original H3 sekvens i hver rad). Den horisontale aksen representerer sekvensen av peptidet og i vertikal retning aminosyren som blir forandret i tilsvarende peptid er indikert. For eksempel, i stedet linjen 17 kolonne 4 inneholder et treonin i tredje posisjon i stedet for glycin som er til stede i villtypesekvensen (fig. 4A). På en slik måte blir punktmutasjoner som genereres for å teste preferanse for NSD1 for hver opprinnelige aminosyre ved hver posisjon i peptidsubstratet. Metylering med NSD1 viste at det spesifikt virker på H3K36 og den har preferanser på hver side av målet lysin 34-38.
Figur 4B representerer konsolidering av tre peptid rekke metyleringeksperimenter med NSD1. Den kvantitative informasjon ble kjøpt fra de individuelle peptid-matriser, og resultatene ble normalisert og midlet som beskrevet ovenfor. Standardavvikene for de enkelte gjennomsnitt viser at dataene er meget reproduserbar. Samlet rundt 85% av peptidene viser SDS mindre enn 20% og mer enn 97% av peptidsubstrater viste SDS mindre enn 30% (Fig. 4C). I tillegg har vi også beregnet diskrimineringsfaktor for å nøyaktig bestemme bidraget av hver aminosyre i de testede stillinger. Som beskrevet den gir kvantitativ beskrivelse av peptidet lest ut og preferanse for aminosyrer ved spesifikke posisjoner (fig. 5A). Våre data viser at NSD1 foretrekker aromatiske rester ved -2 stilling (vurderer K36 som posisjon 0) (F> Y> G); hydrofobe rester ved -1 (I> L> V); basiske rester på en (R> QKNM), hvor det ikke kan tolerere hydrofobe eller aromatiske rester; og hydrophobic rester på to (V> IA> P). På andre områder (som -3, +3, eller +6), foretrekker NSD1 noen aminosyrer, men ingen sterk rest spesifikk avlesning ble oppdaget.
Basert på denne profilen, kan potensielle nye peptidsubstrater bli funnet ved søk i databaser som å bruke Scansite 20 (Fig. 5B). Disse peptidene var forberedt på en SPOT rekke inkludert positive og negative kontroller og inkuberes med NSD1 og radioaktivt merket AdoMet å identifisere undergruppe av dem som er denaturert ved peptid nivå (Fig. 5C). Som følge ups, kan peptid arrays være forberedt som inkluderer peptid varianter, der målet lysin er erstattet av alanine, for å bekrefte at metylering foregår på spådd stedet. Deretter kan de målproteiner eller underdomener av dem inneholdende mål-lysin fremstilles rekombinant, og metyleringen også testet på proteinnivå. Til slutt, avhengig av resultatene, følge opp eksperimenter kan jeg nvestigate hvis metylering også forekommer i celler og hvilke biologiske rolle den har.
Figur 1:. Scheme av peptidsyntese SPOT metoden på cellulose membran Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Eksempel på et peptid rekke farget med bromfenolblått å bekrefte syntese av peptider Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Figur 3: Skjema over peptid rekke metylering eksperiment; peptid matriser ble metylert ved inkubering med PKMT og merket [metyl- 3H] -AdoMet i en egnet buffer. Etterpå radioaktiviteten overført til hvert sted blir oppdaget ved autoradiografi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempel på resultater oppnådd med NSD1 PKMT A) Eksempel på et substrat spesifisitet peptid array for NSD1 hjelp av H3 (31-49) sekvens som templat.. Den horisontale aksen representerer H3-sekvensen og den vertikale aksen representerer aminosyrene ved hvilken den tilsvarende raden er mutert. Den første raden inneholder peptider medopprinnelige sekvens. B) Konsolidering av resultatene fra tre uavhengige peptid rekke metylering eksperimenter med NSD1, ble dataene gjennomsnitt resultatene fra alle tre forsøkene etter normalisering. C) Fordeling av standardfeil for den gjennomsnittlige metylering data vist i panel B. Gjengitt fra Kudithipudi et al. (2014) med noen modifikasjoner 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Funn av nye PKMT underlag A) Diskriminering faktorer av NSD1 for godkjenning av aminosyreresidier på stillingene ved siden av målet lysin (K36 i forsøket vist her). Dataene viser at NSD1 foretrekker aromatiske rester ved -2 position (vurderer K36 som posisjon 0). Hydrofobe rester regnskapsføres på -1 og 2 stillinger, om enn med markante forskjeller i detaljer. På en side basiske rester og amider er foretrukket. På andre nettsteder noen svake preferanser, men ingen sterk rest spesifikk avlesning ble oppdaget. B) Skjermbilde av et eksempel søk på Scansite, ved hjelp av spesifisitet profilen bestemt for NSD1. C) Peptide SPOT array som inneholder flere spådd roman NSD1 substrater sammen med positive (H3K36 ) og negative kontroller (H3K36A). Noen av de betinget nye målene ble sterkt metylert (noen av dem kommenterte), i andre tilfeller spådommer kunne ikke bekreftes. Panel A og C er gjengitt fra Kudithipudi et al. (2014) med noen modifikasjoner 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Base | 1M Oxyma Pure i NMP -> 2,13 g Oxyma Pure i 15 ml NMP |
| Aktivator | 2,4 ml N, N'-diisopropylkarbodiimid i 15 ml NMP |
| Capping Blanding | 20% eddiksyreanhydrid i DMF -> 6 ml eddiksyreanhydrid i 30 ml DMF |
| Fmoc Avbeskyttelse | 20% piperidin i DMF -> 200 ml i 1000 ml DMF |
| Sidekjede Avbeskyttelse | 900 mikroliter triisopropylsilan + 600 mL DDH 2 O i 30 ml TFA |
| Farging | 0,02% bromfenolblått i DMF |
Tabell 1: Kjemisk blandinger og deres sammensetning anvendt i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPOT syntese som beskrevet her er en kraftig metode for å kartlegge protein-protein interaksjonssider og undersøke underlaget anerkjennelse av peptid modifisere enzymer. Imidlertid har SPOT syntesen fremdeles visse ulemper, fordi selv om peptidene syntetisert ved SPOT metoden er rapportert å ha mer enn 90% renhet 21 dette er vanskelig å få bekreftet i hvert tilfelle. Derfor må resultatene gjengis ved andre fremgangsmåter for eksempel ved hjelp av proteindomener eller med rensede peptider syntetisert ved hjelp av standardmetoder. I tillegg er den annen stor ulempe med SPOT matriser som mest tid de kan ikke brukes på nytt for å utføre flere analyser med en matrise.
For å øke effektiviteten av syntese med aminosyrer med lav stabilitet, som er beskyttet arginin, er det viktig å gjøre dem friskt for hver 5 sykluser. I enzymatiske reaksjoner eller proteinbindingsstudier er det ofte observert at periferien av peptidet sted har more signal intensitet enn sentrum ("ring flekk effekten"). Denne effekten kan være på grunn av den høye tettheten av peptider i den sentrale delen av flekken og så den kan løses ved å nedskalere peptidsyntesen 22. For ytterligere feilsøking av peptid syntese maskinen håndbok og selskapets tjeneste bør konsulteres. Ved metylering ikke observeres, bør positiv kontroll peptider (dvs. peptider som er kjent for å bli denaturert ved hjelp av enzymet som skal undersøkes) tilsettes til membranen.
Alternativ til SPOT arrays, høy tetthet peptid mikro arrays 23 er tilgjengelig, men de er dyrere og krever spesialutstyr for bruk. Videre er mengden av peptid pr spot er mindre, noe som krever mer følsomme avlesning prosedyrer. Protein matriser er også tilgjengelige for å studere disse funksjonene 24,25, men de er mer vanskelige å fremstille, fordi hver enkelt protein må bli uttrykt og renset ogproteinfolding på matrisen må opprettholdes. En ytterligere fordel med peptid-matriser er den mulige innføringen av post-translasjonelle modifikasjoner under syntesen og den enkle mutasjons testing av rollene til individuelle aminosyrerester.
Det er et viktig utgangspunkt for denne protokollen, å ha minst ett peptid identifisert, som metyleres ved hjelp av enzymet som skal undersøkes. Metylering betingelser og buffere må optimaliseres, så vel som konsentrasjonen av metyltransferase. Eksemplariske tids kurs av metylering må være bestemt på å unngå fullstendig metylering av det beste underlaget, noe som vil føre til tap av dynamisk område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
