Abstract
リジンのメチル化は、新たな翻訳後修飾であり、それは細胞の発達および多くの疾患において重要な役割を果たしているいくつかのヒストンおよび非ヒストンタンパク質、上で同定された。約5000リジンメチル化部位は、タンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼの数十によって設定された異なるタンパク質、上で同定された。これは、各PKMTしかし今は、1つまたは2つの基板は、これらの酵素のいくつかのために同定されているまで、複数のタンパク質をメチル化することを示唆している。この問題に取り組むために、我々が導入しているペプチドアレイベースの基質特異性はPKMTsの分析。異なる配列を有するいくつかの基板のメチル化は1アレイ上でテストすることができるので、ペプチドアレイはPKMTsの特異性を特徴づけるための強力なツールです。我々はIntavis SPOT合成機を用いてセルロース膜上にペプチド配列を合成し、様々なPKMTsの特異性を分析した。これらの酵素のいくつかのために、その結果に基づいて、新規のubstratesを同定することができた。例えば、ペプチドアレイを用いることによりNSD1ために、我々はそれがH4のK44の代わりに報告H4K20のメチル化と加えH1.5K168は以前から知られているH3K36上非常に好ましい基質であることを示した。したがって、ペプチド配列は、生化学的にPKMTsを特徴付けるための強力なツールです。
Introduction
過去20年間、いくつかの報告は、細胞の発達および癌のようないくつかの疾患において、翻訳後修飾（PTM）の重要性を実証したが、最近、タンパク質のリジンのメチル化は、他の重要なPTMとして浮上している。最初にヒストンリジンのメチル化は、本質的なクロマチンマークであることが見出されたが、後の研究は、いくつかの非ヒストンタンパク質1~4のリジンのメチル化を示した。リジン残基のεアミノ基へのS-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基の連続的な移動は、ヒトゲノム中に60以上のタンパク質を含むタンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMTs）と呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。 PKMTsは、最初に特定のリジン残基をメチル化、ヒストン修飾酵素として発見されたが、後の報告は、これらはまた、非ヒストンタンパク質5をメチル化できることを実証した。現在までに、約5000リジンメチル化部位は、異なるタンパク質上で同定された6
ペプチド配列は、抗体の生化学分析のために広く使用されているツールは、ペプチド修飾酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用部位（抗体-抗原、受容体-リガンド）のマッピング7-9である。ペプチドの数百SUCのために必要とされるHアプリケーション。別の方法は、それらの間で樹脂上でのペプチド合成は、非常に一般的に使用され、ペプチド合成のために利用可能であるが、それは、スループットに制限があり、それが比較的高価である。これらの問題は、フランクと同僚10によるSPOT合成法の導入により解決された。 SPOT合成法は、並行して、数百のペプチドの合成を可能にし、平均して、樹脂の合成に比べて安価である。セルロース膜上に合成されたペプチドは、膜から切断し、溶液アッセイにおいて、またはペプチドマイクロアレイ10-13を調製するための遊離ペプチドとして使用することができ、様々なアプリケーションまたはペプチドのいずれかのために直接使用することができる。
SPOT合成は、固体支持体としてのセルロース膜を使用し、標準的なFmoc化学10-13を用いる固相ペプチド合成の変異体である。したがって、ペプチド鎖の合成は、C末端から始まりに向かって進行するリボソームにおける生物学的合成とは対照的に、N末端。セルロース膜は、第一の活性化アミノ酸（ 図1）の取付けのために官能化される。 SPOT法は、自動化ピペッティングシステムを用いて膜上の規定のスポットへの溶媒の液滴中の活性化されたアミノ酸の逐次的送達に基づいている。液体の液滴は、それが後でペプチド合成における化学反応のためのオープンな反応器として機能する円形のウェットスポットを形成し、多孔質膜上に分配される。スポットサイズは体積分注し、膜の吸収能力によって決定され、そのようなスポットの倍数は、アレイとして配置されている。合成のスケールは、スポットサイズ、膜の積載量と相関する。スポットのアレイの密度との間の距離は、スポットサイズを変化させることによって管理されている。セルロース膜はchemicに耐性は、安価で、ペプチド合成において固相として、いくつかの利点を有する水溶液中で安定であり、取り扱いが容易で、ペプチド合成に使用するals。また、その親水性の性質は、いくつかの生物学的アッセイシステムに適しています。 SPOT合成は、ペプチドの必要数に応じて、（ペプチドの1000など）を手動で行うか、自動化することができる。 Intavis（ケルン、ドイツ）から完全に自動化されたSPOT合成は、我々の用途に用いられる。これは、異なる量および異なる長さのペプチドの合成を可能にする。また、段階的合成14,15によって調製することができる線状ペプチドは、定期的に、最大42個のアミノ酸の付加ペプチドが、15〜20アミノ酸長で合成される。しかしながら、アミノ酸の数を増加させることは、ペプチドの品質に影響を与える全体的なカップリング収率の低下につながる。なぜならスポットあたりのペプチドの量が少ないと、製品はしばしば精製が困難であり、個々のペプチドの品質を容易に評価することはできない。したがって、結果は、SPOT PEPTから得IDEの配列のいずれかのペプチドの合成において、所望のペプチド配列を含むタンパク質を合成することによって基準に従って精製し、分析することができる大規模で標準的な方法によって合成されたペプチドを確認しなければならない。それでも、我々は高い信頼性がSPOT合成を見つけ、再現性があることが一般に生じる。 SPOT合成は、いくつかの市販の修飾アミノ酸はまた、合成のために使用することができ、タンパク質構成アミノ酸に制限ペプチドは、側鎖保護基の最終的な切断の前と後に修正されることを可能にし、さらに、それはまた、組み込むことを可能にされていない、リン酸化されたメチル化またはアセチル化アミノ酸は11。
SPOT法により合成固定化ペプチドライブラリーは、直接、多くの生物学的および生化学的アッセイのために使用することができる。我々はPKMTsの基質特異性を調べるために300-400ペプチドを含むペプチドアレイを用いた。酵素によるMODIFIのために陽イオンは、ペプチド配列は、それぞれPKMTと共にインキュベートされ、適切な緩衝液中に[メチル- 3 H]標識-AdoMet。それぞれの基質のメチル化は、オートラジオグラフィー（ 図3）を介して、ペプチド基質へのAdoMetから放射性標識されたメチル基の酵素的転移を下記によって分析される。この手順によって、ペプチドアレイは、同時に異なるペプチド基質のメチル化の研究を可能にする。この方法の1つの重要な利点は、メチル化動態の線形位相の間に、各ペプチドの相対的なメチル化は、解離定数（k 猫 / Kで割った触媒速度定数に比例するように、すべてのペプチドは、競争においてメチル化されていることであるそれぞれのペプチド基質に対する酵素のD）。したがって、各スポットに取り込まれた放射活性の量は、直接特定のペプチドに向かって酵素活性と相関している。使い方ペプチド配列のメチル化実験の結果、PKMTの特異性プロファイルが定義され、この新規基質に基づくことができるが前提とすることができる。ペプチド配列は、ペプチドレベルでの新規基質のメチル化の迅速かつ費用効率的な検証を可能にする。このために、アレイは、標的部位でのLysのAlaの代わりにを含む修飾されたペプチド、ならびに陽性および陰性対照ペプチドと共に予測新規基質を含有する調製される。最後に、新規基質は一緒にターゲットのLysがAlaに変更され、メチル化は、タンパク質レベルで確認することができる変異体を有するタンパク質として調製することができる。結果に応じて、これは、新たに記載されるタンパク質基質のメチル化の潜在的な役割に対処する生物学的研究が続いている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ペプチド配列の調製
- ペプチド配列のプログラミング
- MultiPepスポッターソフトウェアを使用して合成するためのペプチド配列を設計します。 1文字のコードでペプチド配列を入力してください。
ペプチド1：TARKSTGGKA - 定義された基板の認識に必要な重要なアミノ酸をスクリーニングするために特定のコマンド（.replace、A）とアラニン又はアルギニン散歩ライブラリを生成します。例えば、次の例の最初の行は、野生型配列であり、2行目からのペプチド中の各アミノ酸がアラニンに順次変更される。
、Aを交換
TARKSTG
-ARKSTG
T- A -RKSTG
TA-A -KSTG
TAR- A -STG
TARK- A -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - 、次のようなコマンド（.replace Rを使用してください。1.1.2で説明したようにコンセンサスを決定するためのペプチド配列を合成するために、すべての自然に利用可能なアミノ酸残基（これらの残基は、酸化、時には低い合成収率を受けやすいので、最終的には、システイン、メチオニンおよびトリプトファンを省略）で）N 等を交換酵素の基質配列モチーフ。
注： 図4（a）に示すように、横軸は、与えられたペプチド配列を示し、縦軸は、コマンドのために選択されるアミノ酸を表す。 1.1.2に示された配列と同様に、縦軸AはAlaで順次図の最初の行で指定された配列の各位置を置き換えることを意味する。図4（a）。同様に、アルギニン順次ので、他のアミノ酸と上の第2行の各アミノ酸を置換する。完全なペプチド配列のライブラリーは、系統的に番目の各々に設けられたペプチド基質配列における各残基を置換することによって合成される電子他の天然に入手可能なアミノ酸残基が、これは、所与の配列の各位置におけるそれぞれの残基の影響を理解するのに役立ちます。 - あるいは、既知のまたは予測ペプチド基質のメチル化が容易正および負のメチル化コントロールと共にPKMTの標的ペプチドとの（メチル化に知られているまたはメチル化されたことがないことが知られている、すなわちペプチド）ペプチドライブラリーを合成することを検証することができる。手動プログラミングによって、以下に示すように、目標リジンのメチル化を確認するために、アラニンに推定標的リジンを交換することにより、ペプチドを合成する。
野生型ペプチド：STGG K PRQFL
変異ペプチド：STGG A PRQFL
注：このソフトウェアは、相互作用に必要な重要なアミノ酸をマッピングするための配列の所望のフレームシフトとのエピトープマッピングのように、さまざまなライブラリを作成するための固有のスクリプトを持っています。
- MultiPepスポッターソフトウェアを使用して合成するためのペプチド配列を設計します。 1文字のコードでペプチド配列を入力してください。
- 膜の調製、アミノ酸D試薬
- 10分間、DMF（N、N-ジメチルホルムアミド）のスポット膜を事前に膨潤した後、気泡やしわなしでSPOTシンセサイザーフレームに濡れた膜を置く。
- メンブレン100％エタノールで3回洗浄する。合成プログラムを開始する前に少なくとも10分間、完全に膜を乾燥させる。
- 並行して、新たにNMPに溶解して、市販のFmoc保護アミノ酸の0.5 Mの作業濃度に調製し、 表1に記載したように活性剤と塩基とを準備する。
- SPOTシンセサイザのすべての廃液容器を空にしていることを確認して、DMF、エタノール及びピペリジンで溶剤リザーバを補充します。
注：これでマシンは合成のために準備ができている。
- まずアミノ酸のスポッティング
- 膜上の遊離アミノ基とアミド結合を生成するために、広告によって着信アミノ酸のカルボキシ基を活性化するディング活性剤（N、N 'ジイソプロピルカルボジイミド）およびアミノ酸誘導体の塩基溶液（エチルヒドロキシシアノ）。
- プログラム可能なロボットを用いてアミノ官能化PEG膜上の活性化アミノ酸の所望のボリュームを見つける。
注：これは、アミノ酸のC末端は、膜のアミノ基に結合されている。 - 最初の活性化されたアミノ酸のより良いカップリングを確実にするために、この手順を3回繰り返します。 20分のための膜をインキュベートした後、未結合アミノ酸を除去するために、DMFで洗浄する。
- 非スポット領域上のフリースペースのブロッキング
注：膜のアミノ基へのすべてのペプチドの最初のC末端アミノ酸のカップリング後、スポット、スポットエリア内のアミノ基の一部との間のアミノ基がアミノ酸と結合を形成しない。- キャッピング溶液（DMF中20％無水酢酸）を用いてインキュベートすることにより、これらの遊離アミノ基をブロック5分間。
注：これは、膜の代わりに、成長するペプチド鎖のさらなるサイクルでアミノ酸のカップリングを回避する。
- キャッピング溶液（DMF中20％無水酢酸）を用いてインキュベートすることにより、これらの遊離アミノ基をブロック5分間。
- Fmoc基の除去
- ブロッキング後、DMFで4回、膜を洗浄した後のFmoc保護基を除去するために20分間、DMF中20％ピペリジンでインキュベートする。
注：この手順は、アミノ保護のFmoc基の除去につながり、それが脱保護と呼ばれています。 - その後、エタノールで2回DMFで二回膜を洗って、それが乾燥させます。
注：今膜は、次のアミノ酸のカップリングの準備ができている。
- ブロッキング後、DMFで4回、膜を洗浄した後のFmoc保護基を除去するために20分間、DMF中20％ピペリジンでインキュベートする。
- 鎖延長
注：各アミノ酸の付加は、サイクルと呼ばれる。別に最初のアミノ酸のカップリングから、サイクルが結合されたアミノ酸のFmoc基の脱保護で開始し、それが成長して激励のアミノ基への着信アミノ酸の活性化カルボキシル基とのカップリングに続いて潮のチェーン。- 所望のペプチド長が得られるまで繰り返して、1.3と1.5の手順。
- 染色
注：最後のサイクルの後、ペプチド配列は、ペプチドの合成に成功を確認するために、ブロモフェノールブルーで染色する。ブロモフェノールブルーは、ペプチドの遊離アミノ基と結合する。ペプチドスポットは、染色後に淡青色を示すが、スポットの強度は、ペプチド配列に依存して変化する。ピペリジンブロモフェノールブルーの存在下でペプチドを染色していないため、この染色は、ピペリジンの完全な除去を確認できる。また、これは、さらなる使用のためのペプチド配列をマークするのに役立つ。- 最後の合成サイクルにおけるFmoc基の脱保護の後、DMF、100％エタノールでメンブレンを洗浄する。それは完全に青色になるまで、5分間の最低ブロモフェノールブルー（DMF中の0.02％ブロモフェノールブルー）を有する膜を扱う。
- その後、DMFおよびETHを有する膜を洗うサノールを10分間乾燥させた。今、シンセサイザーから膜を取り出し、手動で側鎖の脱保護（セクション1.8）を実行する。必要に応じて、ペプチド合成（ 図2）の結果を文書化するために膜を撮影。
- サイドチェーン脱保護
- 側鎖保護基および捕捉試薬（2.5％の水および2.5％トリイソプロピルシラン）からのアミノ酸の側鎖を保護するために切断するために、95％トリフルオロ酢酸（TFA）からなる側鎖脱保護混合物20~25 mlの膜を扱うこのステップの間変更。それは完全に密閉された化学薬品耐性のボックス内膜をカバーしていることを確認し、穏やかに振盪しながら1から2時間のためにそれをインキュベートし、脱保護混合物の十分なボリュームを取る。
- 2分ごとに、DCM（ジクロロメタン）20-25 mlの膜を6回洗浄し、最終的に二回、100％エタノールで、一晩デシケーターでそれを乾燥させてください。
注：今すぐ膜は、実験に使用することができる。ペプチドアレイの合成のスキームを図1に提供される。
2.タンパク質の発現および精製
- GST融合物としてPKMTsのタンパク質発現
- 標準的な技術を用いて、GST融合タンパク質として発現させるために（をpGEX-6P2のような）細菌の発現ベクターに、完全長PKMTまたはその触媒ドメインをコードする遺伝子をクローニングする。
- BL21またはBL21コドンプラスE.挿入希望PKMTとベクトルを転送ヒートショック法または他の任意の方法によって大腸菌細胞。
- 式の当日にルリア - ベルターニ（LB）メディアの30ミリリットルで前培養を準備し、継続的に振盪しながら7から8時間、37℃でインキュベートする。
- 次に、LB培地1 Lを含む2 L大きなバッフル付きフラスコに予備培養物10mlを転送し、37℃でインキュベート 培養に到達するまで連続振盪インキュベーターで°C600nmで定義された光学密度ES。
注：これは、各タンパク質のために最適化することができるが、我々が日常的に約0.8のOD 600nmまでで誘導する。誘導温度を個別に各タンパク質について最適化されなければならない、いくつかのタンパク質は、22で良好な発現を示す °Cより高い温度でのいくつかの。 - イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを1mMで誘導し、培養物を誘導温度で10〜12時間増殖させ、次いで、15分間誘導温度に細胞を移す。
- その後15分間5000×gでの遠心分離によって細胞を回収し、最後に、他の用途のために-20℃でSTE緩衝液（10mMトリスpH8.0で、100mMのNaClおよび0.1mM EDTA）及び店舗30mlでペレットを洗浄する。
- タンパク質精製
- 細胞ペレットを解凍し、超音波処理緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）30mlに再懸濁し、超音波処理によって破壊する。
注：このバッファnEEDSは、最終的に、各タンパク質のために最適化される。 - 1時間22000×gで細胞溶解物を遠心して、後から上清を収集し、グルタチオンセファロース4B樹脂600μlのを含むカラムを通過する。
- 非特異的に結合したタンパク質を除去するために超音波処理緩衝液50mlおよび高塩緩衝液（50mMトリスpH7.5で、500mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）100mlで次でカラムを洗浄する。 40 mMのグルタチオンを含む高塩緩衝液5mlで結合したタンパク質を溶出する。
- 低いグリセロール（20mMトリスpH7.4中の100mMのKCl、0.5mMのDTTおよび10％グリセロール）pH7.4で2時間、後に20mMのトリス、100mMの塩化カリウム、0.5mMの透析緩衝液2リットル中に溶出したタンパク質を透析DTT、70％グリセロール、8時間または一晩。すべての精製バッファは4℃であり、タンパク質の変性を避けるために、低温室でタンパク質精製を行うことを確認してください。
- 細胞ペレットを解凍し、超音波処理緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）30mlに再懸濁し、超音波処理によって破壊する。
3.ペプチドアレイのメチル化
- 事前incuペプチド配列のbation
- 酵素と高価な放射性標識したのAdoMetの浪費を避けるために適切な大きさの箱やビニール袋にいずれかのペプチド配列のメチル化を実行します。 10分間酵素なしそれぞれのメチル化緩衝液を含有する密封されたビニール袋中のペプチド配列膜をプレインキュベートし、標識された[メチル - 3 H] -AdoMet。例では、完全な特異プロファイルペプチドアレイ用のメチル化バッファーを8mlを使用するための緩衝液の体積は、配列のサイズに依存する。各酵素の量とのAdoMetの濃度を最適化します。
- ペプチド配列のメチル化
- 1から2時間-AdoMetプレインキュベーション緩衝液を破棄し、それぞれのPKMTを含むメチル化バッファーの8ミリリットルで膜をインキュベートし、標識[メチル - 3 H]。
NOTE：メチル化反応に必要な酵素の量は、特定のPKMTの活性に依存し、我々は、典型的には、50nMの酵素フィンと私たちのスクリーニング実験を開始Al濃度。
- 1から2時間-AdoMetプレインキュベーション緩衝液を破棄し、それぞれのPKMTを含むメチル化バッファーの8ミリリットルで膜をインキュベートし、標識[メチル - 3 H]。
- ペプチド配列の洗濯
- その後、放射性廃棄物容器内のメチル化バッファーを破棄し、結合したタンパク質を除去するために5分間、100 mM重炭酸アンモニウム、および1％SDSを含む緩衝液20mlで5回のペプチドアレイを洗浄する。放射性廃棄物容器内の洗浄緩衝液を廃棄します。
- 放射性シグナルの検出
- 洗浄した後のAmplify溶液（NAMP100V）の10ミリリットル中で5分間メンブレンをインキュベートする。
- その後、ビニール袋にペプチドアレイを密封、有機溶媒の放射性廃棄物容器にAmplifyソフトウェア液を捨て、オートラジオグラフィーカセットに入れ。
- 暗い部屋でのペプチドアレイ上のオートラジオグラフィーフィルムを配置します。慎重にカセットを閉じ、-80でそれを公開する 必要な時間のためのC°。その後、結果を分析するためにフィルムを開発する。異なるexpositioで倍の画像のカップルをキャプチャn回強くメチル化ペプチド基質の飽和を回避する。
4.データ処理と解析
- スポット強度の濃度測定分析
- 従来のスキャナでフィルムをスキャンし、デンシトメトリーでスポット強度を分析。 （フリーウェアです）この使用したImageJまたは商業プログラムの操作を行います。
注：私たちは、この作業にPhoretixソフトウェアを使用。
- 従来のスキャナでフィルムをスキャンし、デンシトメトリーでスポット強度を分析。 （フリーウェアです）この使用したImageJまたは商業プログラムの操作を行います。
- 正規化と異なる膜からの結果の平均化
- 三重に少なくともペプチドアレイメチル化実験を行う。 1.0として基準基板でのバックグラウンド減算および活性を設定することで、各実験のためにスキャンされた強度を正規化する。個々のスポットのデータを平均化し、それらを、平均値および標準偏差を報告する。
- データ解析と表示
- 相対活性を示すのにグレースケールまたはカラースキームを使用して2Dでデータをプロットします。こののWiかの操作をここに示すように、ExcelやSIGMAPLOT番目。また、データの質を分析するための反復実験の標準偏差の分布のプロットを準備する。
- 定量的基質ペプチドの各残基の認識の精度を比較し、表示するには、私は差別係数D 16,17による位置xにおける各アミノ酸のPKMTの相対的な優先度を計算します。
D X; I = <V のj≠I> / V I - 1
ます。v iは、位置xとのアミノ酸のiを運ぶペプチド変異体のメチル化率である。ここで、<ます。v jは≠i>を含む位置xにおける異なるアミノ酸jは≠iのを運ぶすべての19のペプチドのメチル化の平均速度は、（ある野生型配列）。
注：このことによって定義される識別因子がバックグラウンドレベルに依存する。一つだけ残渣を差別、3％のバックグラウンドを持つ特定の位置で受け入れられた場合32.3倍が得られる。 0の判別係数の位置の結果での指定なし。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ペプチドアレイが正常生化学PKMTsの特異性を特徴付けるために使用し、PKMTのいくつかの新規なヒストンおよび非ヒストン基質は、このアプローチ5,16-19によって同定した。 PKMT（または任意の酵素）の正確な基質スペクトルを定義すると、その分子機構と細胞機能の理解に向けて不可欠なステップである。
ペプチドSPOTアレイメチル化法の適用例として、NSD1 PKMT 19の特異性分析の結果を説明する。私たちの仕事に前に、この酵素は、K36でのヒストンH3およびヒストンH4 K20でなく、K218とK221。 図でNF-kBのファミリー転写因子のp65を含むメチいくつかの基板に説明した。図4Aは、NSD1有するペプチド配列のメチル化反応の一例を示している。この実験のために、H3（31-49）の配列に基づいて大ペプチドアレイは、すべての可能含むように合成したNSD1相互作用およびメチル化のための各アミノ酸の重要性をテストするために、元の配列の単一アミノ酸変化。合計380のペプチドを合成した（20個の可能なアミノ酸は18残基プラス各行に1元のH3シーケンスをX）。横軸はペプチドの配列を表し、垂直方向に対応するペプチドで改変されたアミノ酸が示される。例えば、行17列4でのスポットは、野生型配列（ 図4A）に存在するグリシンの代わりに第三の位置でスレオニンを含んでいる。このようにして、点突然変異は、ペプチド基質の各位置におけるそれぞれの天然アミノ酸をNSD1の優先度をテストするために生成される。 NSD1とメチル化は、それが具体的にH3K36に作用し、それが34から38の標的リジンのいずれかの側に嗜好を有することを示した。
図4Bは、3ペプチドアレイメチル化の統合を表し、NSD1を用いた実験。定量的な情報は、個々のペプチドアレイから取得し、その結果を正規化し、上記のように平均した。個々の平均値の標準偏差は、データは非常に再現性があることを示している。全体的に、ペプチドの約85％が20％より小さく、ペプチド基質の97％以上のSD（ 図4C）のSDの30％未満を示し示す。加えて、我々はまた、正確にテスト位置における各アミノ酸の寄与を決定するための判別率を計算した。説明したように、ペプチドの定量的な説明は、特定の位置（ 図5A）で読み出されたアミノ酸の優先提供する。我々のデータは、NSD1 -2位置（位置0としてK36を考慮して）（F> Y> G）での芳香族残基を好むことを示している。疎水性残基で-1（I> L> V）;それは疎水性または芳香族残基を容認することはできません1（R> QKNM）、少なくとも基本的な残基;とHYD2でのrophobic残基（V> IA> P）。他のサイト（3、-3のような、または6）では、NSD1はいくつかのアミノ酸を好む、しかし強い残留具体的な読み出しが検出されなかった。
このプロファイルに基づいて、潜在的な新規なペプチド基質はScansite 20（ 図5B）を使用してのようなデータベース検索により求めることができる。これらのペプチドは、陽性および陰性対照を含むSPOTアレイで調製し、NSD1と共にインキュベートし、放射能ペプチドレベル（ 図5C）でメチル化されているそれらのサブセットを識別するためのAdoMetを標識した。フォローアップとして、ペプチドアレイは、メチル化を確認するために、ターゲットリジンがアラニンで置換されたペプチド変異体を含むものを調製することができると予測サイトで行われる。その後、標的タンパク質または標的リジンを含むそれらのサブドメインは、組換え的に製造することができ、メチル化はまた、タンパク質レベルで試験した。最後に、結果に応じて、実験をフォローアップすることができます私は nvestigateメチル化はまた、細胞内で発生し、それが有する生物学的役割場合。
図1：セルロース膜上のスポット法ペプチド合成のスキームは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ペプチドの合成を確認するために、ブロモフェノールブルーで染色したペプチドアレイの例この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
図3：ペプチドアレイのメチル化実験のスキーム。ペプチドアレイはPKMTとのインキュベーションによってメチル化し、適切なバッファに[メチル- 3 H] -AdoMet標識した。その後、各スポットに転送された放射能をオートラジオグラフィーによって検出される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：テンプレートとしてH3（31-49）配列を用いて、NSD1ための基質特異性のペプチド配列のNSD1 PKMT A）は、実施例で得られた実施例の結果。横軸は、H3配列を表し、縦軸は、対応する行が変異していることにより、アミノ酸を表す。最初の行は、を有するペプチドが含まれています元のシーケンス。NSD1と3つの独立したペプチドアレイのメチル化実験の結果のB）連結、データが正常化した後にすべての3つの実験から得られた結果を平均した。Kudithipudi らからパネルBに再現さに示す平均メチル化データのための標準誤差のC）流通ら （2014）いくつかの修正19とは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ターゲットリジン（ここに示した実験においてK36）への次の位置でのアミノ酸残基の認識NSD1の新規PKMT基質の検出A）差別化要因。データはNSD1 -2 pで芳香族残基を好むことを示している（位置0としてK36を考慮して）osition。疎水性残基は細部に特徴的な違いはあるものの、-1と2の位置に認識されている。 1サイトでの塩基性残基とアミドが好ましい。他のサイトのいくつかの弱い好み、しかし強い残留具体的な読み出しが検出されなかった。B）NSD1のために決定特異性プロファイルを使用してScansiteでの検索例のスクリーンショット。C）NSD1が（H3K36正と一緒に基質いくつかの予測小説を含むペプチドスポットアレイ）および陰性対照（H3K36A）。プレディケート新規標的の一部は強く（それらのいくつかは注釈付き）メチル化された、他のケースでは予測が確認できませんでした。パネルAおよびCはKudithipudi らから再生される。（2014）いくつかの変更19。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ベース | NMP中の1M Oxymaピュア - 15ミリリットルNMP中> 2,13グラムOxymaピュア |
| 活性化因子 | 2.4ミリリットルのN、15ミリリットルNMP中N 'ジイソプロピルカルボジイミド |
| キャッピング混合物 | DMF中の20％無水酢酸 - 30ミリリットルのDMF中> 6ミリリットル、無水酢酸を |
| Fmocの脱保護 | DMF中の20％のピペリジン - 千ミリリットルのDMF中> 200ミリリットル |
| サイドチェイン脱保護 | 900μlのトリイソプロピルシラン+ 600μlののddH 2 O 30ミリリットルTFA中 |
| 染色 | DMF中の0.02％ブロモフェノールブルー |
表1：化学混合物およびプロトコルで使用されるそれらの組成物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPOT合成ここに記載されるように、タンパク質 - タンパク質相互作用部位をマッピングし、ペプチド修飾酵素の基質認識を調査するための強力な方法である。 SPOT法により合成されたペプチドは、これは、各インスタンスに確認することが困難であり、90％を超える純度21を有することが報告されているが、しかし、SPOT合成は、依然として、いくつかの欠点を有している。したがって、結果は、タンパク質ドメインを使用して、インスタンスのための他の方法によって、または標準的な方法によって合成された精製されたペプチドで再生しなければならない。また、SPOTアレイの他の主な欠点は、ほとんどの時間は、彼らが一つの配列といくつかのアッセイを実行するために再利用できないということである。
低い安定性のアミノ酸との合成の効率を高めるために、保護されたアルギニンのように、それは、すべての5サイクルのためにそれらを新鮮にすることが重要である。酵素反応やタンパク質結合研究では、多くの場合、ペプチドスポットの周囲はカを有することが観察される中央（「リングスポット効果」）よりも信号強度の再。この効果は、スポットの中心部でのペプチドの高い密度に起因することができ、それはペプチド合成22をダウンスケーリングすることによって解決することができる。ペプチドのさらなるトラブルシューティングのためにマシンのハンドブックを合成と会社のサービスにご相談下さい。メチル化が観察されない場合は、陽性対照ペプチド（調査中の酵素によってメチル化されることが知られている、すなわちペプチド）を膜に添加されるべきである。
SPOTアレイへの代替は、高密度ペプチドマイクロアレイ23が利用可能ですが、彼 らは、より高価であり、使用のために特別な装置を必要とする。さらに、スポットあたりのペプチドの量は、より敏感な読み出し手順を必要とする、小さくなっている。タンパク質アレイはまた、これらの機能24,25を研究するために利用可能であるが、それぞれの個々のタンパク質が発現され、精製される必要があるため、それらは調製するのがより困難であるとアレイ上のタンパク質の折り畳みを維持する必要がある。ペプチドアレイのさらなる利点は、合成中に翻訳後修飾の可能性を導入すると、個々のアミノ酸残基の役割の突然変異試験の容易さである。
これは、調査中の酵素によりメチル化される識別された少なくとも1つのペプチドを有するように、このプロトコルのために必須の出発点である。メチル化条件および緩衝液は、最適化されなければならないだけでなく、メチルトランスフェラーゼの濃度。メチル化の典型的な時間経過は、ダイナミックレンジの損失の原因となる最良の基質の完全なメチル化を回避するために決定されなければならない。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
