Abstract
La visualisation de pleine longueur projections neuronales dans les embryons est essentiel d'acquérir une compréhension de la façon dont les mammifères réseaux neuronaux se développent. Nous décrivons ici un procédé pour marquer in situ un sous-ensemble de ganglion de la racine dorsale (DRG) de projections axonales à évaluer leurs caractéristiques phénotypiques utilisant plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Les neurones TrkA-positif sont des neurones nocicepteurs, dédiées à la transmission des signaux de douleur. Nous utilisons une lignée de souris TrkA taulacZ d'étiqueter les trajectoires de tous les axones périphériques TrkA-positif dans l'embryon de souris intactes. Nous élevons en outre la ligne TrkA taulacZ sur un fond nul Bax, qui abolit essentiellement apoptose neuronale, afin d'évaluer les questions indépendamment de possibles effets de manipulations génétiques sur la survie neuronale liés à la croissance. Par la suite, les souris génétiquement modifiées d'intérêt sont élevés avec le TrkA TaullacZ / Bax ligne nulle et sont alors prêts pour l'étude en utilisant les techniques décrites ici. Cette présentation contient des informations détaillées sur les plans d'élevage de souris, le génotypage au moment de la dissection, la préparation des tissus, la coloration et la compensation pour permettre la visualisation de pleine longueur trajectoires axonales dans l'ensemble du montage préparation.
Introduction
Mise en place des réseaux neuronaux précis est un processus complexe du développement essentiel pour le fonctionnement du système nerveux. La perturbation de ce processus conduit à un dysfonctionnement neuronal qui a été impliquée dans des maladies neurologiques humaines 3.1. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la croissance axonale et la cible innervation chez les mammifères, nous avons développé un protocole de visualiser les trajectoires axonales de TrkA exprimant neurones sensoriels utilisant une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées.
TrkA est un récepteur pour le facteur NGF de croissance des nerfs et est un marqueur fonctionnel des neurones sensoriels nociceptifs 4. TrkA est fortement exprimé dans les neurones nociceptifs au cours du développement précoce et la médiation de la survie des neurones dépendant du NGF, la croissance des axones, arborisation cible innervation et 9.5. Chez les souris TrkA taulacZ, le gène de type sauvage TrkA est remplacé par une expression de c taulacZassette 10, de telle sorte que la morphologie axonale des neurones positifs putatifs TrkA peut être visualisée par β-gal (X-gal) 11 coloration. Utilisation d'une ligne TrkA taulacZ / WT hétérozygote, nous pouvons examiner les facteurs qui peuvent réglementer ou interférer avec le développement de projections sensorielles afférentes in vivo.
En outre, l'expression TrkA est absent chez les souris homozygotes TrkA taulacZ / taulacZ, qui peuvent donc être utilisés pour évaluer la croissance de l'axone promouvoir des mécanismes en l'absence de signalisation du NGF / TrkA. Etant donné que les neurones nociceptifs dépendent de NGF / TrkA signalisation non seulement pour la croissance des axones, mais aussi pour la survie, on emploie une autre lignée de souris, dépourvu du gène Bax pro-apoptotique, pour inhiber l'apoptose dans les neurones de DRG embryonnaires, les sauver de la mort cellulaire qui est par ailleurs observé en l'absence de signalisation TrkA. Le Bax - / - fond 12 permet ainsi pour la molécudissection lar des voies qui affectent spécifiquement 7-9,13-15 de croissance axone signalisation. Dans TrkA - / -: - Bax / - souris, les neurones DRG survivre, mais sensorielle innervation afférente dans la peau est complètement abolies 14,15. Nous pouvons activer sélectivement les voies de signalisation pour déterminer leurs contributions respectives à l'élaboration de projections axonales. L'utilité de cette méthode est qu'elle permet à l'évaluation des changements de phénotypes de croissance axonale lorsque différentes modifications génétiques sont élevés sur le TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ou TrkA taulacZ / WT: Bax - / - milieux.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures sont conformes à la NIH Guide pour l'entretien et utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole d'animal a été approuvé par le IACUC au Weill Cornell Medical College.
1. Préparation des tissus
- Euthanasier femelles chronométré-grossesse par dislocation cervicale 15. Disséquer embryonnaires E16 - E18 embryons de femelles chronométré-grossesse et placer des embryons individuellement dans les puits d'une plaque à 6 puits, remplis de solution saline tamponnée phosphate froide (PBS).
- Rincer embryons dans du PBS froid.
- Retirer une petite partie de la membrane amniotique de l'embryon et le placer dans une solution pré-préparés protéinase K pour le génotypage ultérieure. Alternativement, si la membrane amniotique est perdu, enlever une petite partie de la pointe de la queue de l'embryon et le placer dans une solution de proteinase K
- Percez des trous dans la peau tout autour de l'embryon en utilisant des épingles insectes (au moins 100 par côté).
- Retirer du PBS et ajouter lentement frais 2% de paraformaldéhyde (PFA),pH 7,4, au puits.
- Agitez doucement pendant 2 h à 4 ° C.
- Rincer les embryons à deux reprises dans du PBS et les stocker dans du PBS à 4 ° C jusqu'à ce que la coloration.
2. génotypage
- Plongez membranes amniotiques ou queues d'embryons dans la protéinase K mélange selon les instructions du fabricant.
- Incuber à 56 ° C pendant 10 min.
- Extraire l'ADN en utilisant un kit de purification d'ADN disponible dans le commerce.
- Prendre 0,5 ul du total 200 ul purifiés solution d'ADN génomique, le combiner avec 0,5 pl de chacune des amorces sens et antisens spécifiques d'un gène (10 uM), 2 ul de mélange dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP) , 0,2 ul de polymerase de Taq (5 U / ul) et du tampon de PCR 2 pi (10x), ajoutez H 2 O à un volume total de 20 ul.
NOTE: Les séquences des amorces sont les suivantes (tableau 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Frag PCRlongueur ment: 400 paires de bases (pb).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NéoR: GCC CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragments longueurs: type sauvage, 304 pb; Bax null, 507 pb.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR de longueur des fragments: 360 pb. - Exécuter une PCR avec le programme suivant pour TrkA: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, étape 3: 20 sec à 68 ° C, étape 4: 30 sec à 72 ° C. Répétez les étapes 2 à 4 pour 40 cycles.
- Pour LacZ et Bax, exécutez une PCR avec le programme suivant: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, l'étape 3: 1 min à 54 ° C, étape 4: 1 min à 72 ° C, répétez les étapes 2 à 4 pour 35 cycles.
- Exécuter les échantillons de PCR sur un gel d'agarose à 2% à 100 V dans un tampon Tris-acétate 1x-EDTA pendant 20 min avec une voie de échelle d'ADN pour évaluer la longueur des fragments.
- Analyser embryons pour la présence de type sauvage TrkA, TRKA-tauLacZ et Bax allèles nuls. Les génotypes des embryons expérimentaux sont TrkA taulacZ / WT: Bax - / - TrkA et taulacZ / taulacZ: Bax - / -, en fonction des questions expérimentales. Les embryons qui ne ont pas le journaliste tauLacZ seront négatifs pour axonale coloration et peuvent donc servir de témoins négatifs pour calibrer le processus de coloration.
3. embryon coloration
- Utilisez un kit commercial pour lacZ coloration avec quelques modifications telles que décrites ci-dessous dans les sections 3.2 à 3.8. Ici, utiliser le kit Millipore.
- Plongez embryons dans le tampon A pendant au moins 1 h, secouant doucement à la température ambiante.
- Immerger directement embryons dans le tampon B pendant au moins 15 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
- Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, solution de pré-base chaude de tissus à 37 ° C. Utilisation 5 ml de solution de base de tissu par embryon.
- Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, préparer une nouvelle 5-bromo- 4- chloro- 3- indolyle α-D-galactopyranoside (X-gal) à une concentration de 40 mg / ml dans 100% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Diluer X-gal dans la solution préchauffée base de tissu à une concentration de 1 mg / ml et ajouter 5 ml de X-gal / le mélange de base de tissu à un flacon à scintillation en verre.
- Transfert d'embryons dans un flacon à scintillation en verre contenant le mélange de base X-gal / tissus. Sceller le couvercle avec du Parafilm et incuber à 37 ° C pendant la nuit, la vérification de présence de bleuissement.
- Embryons de Postfix avec frais PFA 4%, pH 7,4. Agitez doucement pendant 4 heures à 4 ° C.
- Rincer embryons deux fois dans PBS froid.
4. tissus déshydratation et de compensation
- La place embryons dans 50% de méthanol / 50% d'un mélange PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans les flacons de verre.
- Continuer à déshydrater dans 75% de méthanol / 25% de PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons en verre.
- Continuer à se déshydrater dans 90% de méthanol / 10% PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons de verre.
- Continuer à déshydrater dans 100% de methanol pendant 30 min (2x) à la température ambiante en agitant dans des flacons en verre.
- Lorsque des embryons sont déshydratant, préparer un mélange 1: 1 (v: v) un mélange d'alcool de benzoyle et benzoyle benzoate.
REMARQUE: l'alcool de benzoyle et benzoyle benzoate est toxique. - Immerger les embryons dans le complexe 1: 1 (v: v) mélange de methanol à 100%: 100% BABB pendant 15 min. Utilisez uniquement parce que le verre BABB va se dissoudre en plastique.
- Plongez embryons dans 100% BABB effacer complètement le tissu et de visualiser coloration X-gal dans l'embryon effacé.
REMARQUE: Image dès que possible parce que la tache X-gal va se estomper au fil du temps.
5. Mont entiers Imaging
- Stabiliser l'embryon, immergé dans 100% BABB, aux angles appropriés pour la photographie utilisant des pinces métalliques. Illuminez utilisant une combinaison de sources jusqu'à la lumière et sous-lumière lumière.
- Acquérir des images avec un microscope disséquantéquipé d'un appareil photo numérique. Prenez plusieurs expositions aux champs lumineux à cinq plans focaux successives 0,5 mm d'intervalle le long de l'axe Z. Les temps d'exposition et diaphragmes peuvent varier en fonction de l'éclairage et de la caméra spécifications et doivent être optimisés pour chaque configuration.
- Utilisez un logiciel de traitement d'image pour traiter des images de superposition et de générer des photomontages.
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Representative Results
Les génotypes de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - TrkA et taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryons peuvent être déterminées sans ambiguïté par génotypage PCR standard (figure 1). Coloration X-Gal affiche des informations détaillées tonnelles axonales périphériques sous-cutanée chez les embryons classiquement colorées (figures 2, 3a), et dans tout l'embryon après compensation de tissu (figures 3b, 4).
Nous avons élevé le TrkA WT / taulacZ: Bax - / - ligne avec des souris portant le B-RAF (V600E) mutation kinase activée constitutivement (LSL-kaBraf 16) sous le contrôle du promoteur de la nestine spécifique des neurones 17, pour obtenir LSL- kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - souris. Dans ces embryons, qui manquent complètement de signalisation TrkA, la morphologie des saillies périphériques nocicepteurs néanmoins développé près normalement (figure 4). Cette démonstrationsa fonction essentielle pour la B-RAF de signalisation dans la croissance axonale périphérique, et montre également que la survie et axone favorisant la croissance des fonctions de signalisation TrkA peuvent être séparés, avec le Bax - / - arrière-plan génétique substituant à la perte de la survie TrkA dépendant de signalisation .
Figure 1: Le génotypage des souris transgéniques images représentatives de gel d'agarose.. Exemple 1: TrkA WT / taulacZ: Bax WT / -, l'échantillon 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, l'échantillon 3: TrkA WT / taulacZ: Bax - / -.
Figure 2: a 18,5 TrkA WT / taulacZ souris colorées avec X-gal projections Axon de ganglions de Gasser dans torse et HEA.d sont présentés dans un embryon non défrichée. Barre d'échelle: 1 mm.
Figure 3:. A 18,5 TrkA WT / taulacZ souris colorées avec X-gal (A) avant et (B) après avoir franchi avec Babb Projections de DRG à la mi-torse sont présentés. Barre d'échelle: 2 mm.
Figure 4: Une E16,5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. Nestine Cre-embryon de souris colorées avec X-gal et dégagé avec BABB kaBraf code pour un actif B-RAF de protéine kinase de la kinase, B-RAF V600E. Expression de Kab-RAF dans les neurones DRG a abouti à pleine longueur, proche de l'extension de l'axone normale en l'absence de signalisation TrkA. Barre d'échelle: 1 mm. Pour plus d'images, y compris des contrôles, voir réf. 15, Figure2.
| Les amorces utilisées pour le génotypage par PCR | ||
| 1 | TrkA | la taille des fragments d'ADN: 400 pb |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | la taille des fragments d'ADN: 304 pb (type sauvage), 507 pb (Bax null) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NéoR | GCC CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | la taille des fragments d'ADN: 360 pb |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tableau 1: Amorces utilisées pour le génotypage par PCR.
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Discussion
Le X-gal procédure de souris embryonnaires TrkA taulacZ coloration décrite ci-dessus permet la visualisation rapide et détaillée des projections axonales longue distance dans l'embryon fixe intacte. En raison de la Bax fond nul ces souris permettent de sonder des mécanismes qui peuvent contribuer à la croissance de l'axone et la survie neuronale de signalisation. Accouplement avec transgéniques ou knock-out souris d'intérêt permet une évaluation globale des phénotypes axonales et peut servir de guide au utiles pour de futures expériences d'examiner la signalisation de croissance axone de façon plus détaillée. Un défi majeur pour vivo axone études de croissance est le temps de préparer le tissu sections et évaluer les phénotypes complexes de axones en croissance qui peuvent être affectés de multiples façons par une quelconque manipulation génétique. Le TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ligne permet d'évaluer tous les effets d'un gèned'intérêt sur le développement de nocicepteurs axone périphérique.
La technique est limitée à la visualisation des nocicepteurs axonales des trajectoires qui normalement expriment TrkA pendant les premiers stades de développement. En plus des nocicepteurs périphériques, il peut être possible de visualiser les projections cholinergiques du cerveau antérieur basal et sympathiques; Mais cela nécessiterait l'optimisation spécifique des techniques de coloration
compensation tissulaire est une étape clé du protocole décrit ici. Il permet une évaluation détaillée des projections plus profondes situées dans des préparations l'ensemble du montage et donc l'identification potentielle des phénotypes distincts. Reporters fluorescents, tels que tdTomato ou reporters GFP 18,19, peuvent offrir la clarté visuelle, sous certaines conditions, mais il est difficile d'acquérir l'image l'ensemble du montage parce que nous avons constaté que, contrairement à la coloration X-gal, signaux fluorescents se estompent considérablement au cours la procédure de compensation des tissus. Dilcoloration est également largement utilisé pour le marquage des axones 20; ses défauts sont qu'il ne peut pas marquer sélectivement un sous-type spécifique des axones telles que les fibres de nocicepteurs ici, et il est difficile d'étiqueter longues trajectoires entièrement dans la périphérie.
En résumé, nous proposons un protocole qui utilise une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées pour permettre la visualisation de routine des tonnelles pleins d'axones nociceptifs dans l'embryon de souris.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Louis Reichardt pour les souris TrkA taulacZ et Dr. Annette Markus pour la discussion et suggestions perspicaces. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Fondation Burke ainsi que la Fondation Whitehall subvention de recherche 2010-08-61, une subvention de la Fondation Wings de vie (WFL-US-028/14) pour la recherche, accorder ZB1-1102-1 de la Christopher et Dana Reeve Foundation, et les subventions et 1R01EY022409 3R01EY022409-01S1 du National Eye Institute, à JZ. KJO est un compagnon de Goldsmith.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
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