We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Visualisering av helaftens nevronale anslag i embryoer er viktig å få en forståelse av hvordan pattedyr nevrale nettverk utvikle. Her beskriver vi en metode for å merke in situ en undergruppe av dorsal root ganglion (DRG) axon anslag for å vurdere deres fenotypiske egenskaper ved hjelp av flere genetisk manipulerte mus linjer. TrkA-positive nevroner er nociceptor nevroner, dedikert til overføring av smerte signaler. Vi bruker et TrkA taulacZ mus linje å merke baner av alle trkA–positive perifere axoner i intakt museembryo. Vi avler videre TrkA taulacZ linje på en Bax null bakgrunn, som i hovedsak opphever nerveapoptose, for å vurdere vekstrelaterte spørsmål uavhengig av mulige effekter av genetiske manipulasjoner på neuronoverlevelse. Deretter blir genmodifiserte mus av interesse avlet med TrkA TaulACZ / Bax null linje og er deretter klar for studien ved hjelp av teknikker som er beskrevet her. Denne presentasjonen inneholder detaljert informasjon om muse avl planer, genotyping på tidspunktet for disseksjon, vev forberedelse, beising og rydding for å tillate visualisering av helaftens aksonale baner i hel-mount forberedelse.
Etablering av presise nevrale nettverk er en kompleks utviklingsprosess viktig for funksjonaliteten av nervesystemet. Forstyrrelse i denne prosessen fører til nevronal dysfunksjon, som har vært implisert i humane nevrologiske sykdommer 1-3. Å studere de underliggende molekylære mekanismene for axon vekst og mål innervasjon i pattedyr, har vi utviklet en protokoll for å visualisere de aksonale baner av TrkA-uttrykke sensoriske nevroner ved bruk av en kombinasjon av to genmodifiserte mus linjer.
TrkA er en reseptor for NGF nervevekstfaktor, og er en funksjonell markør for nociceptive sensoriske nevroner 4. TrkA er sterkt uttrykt i nociceptive nevroner under tidlig utvikling og formidler NGF-avhengige nevron overlevelse, axon vekst, arborization og mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ mus, er villtype TrkA-genet erstattet med et taulacZ ekspresjon cAssette 10, slik at aksonal morfologi putative trkA-positive nevroner kan visualiseres ved β-gal (X-gal) farging 11. Ved hjelp av en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersøke faktorer som kan regulere eller forstyrre utviklingen av sensoriske afferente anslag in vivo.
Videre er TrkA ekspresjon fraværende i homozygot TrkA taulacZ / taulacZ mus, som derfor kan brukes til å vurdere axon vekstfremmende mekanismer i fravær av NGF / TrkA signalering. Siden nociceptive neuroner avhenger av NGF / TrkA signalering, ikke bare for axon vekst, men også for å overleve, anvender vi en annen muselinje som mangler den pro-apoptotiske Bax-genet, for å hemme apoptose i embryonale DRG-neuroner, redning dem fra celledød som ellers observert i fravær av TrkA signalering. Den Bax – / – bakgrunn 12 tillater dermed for molecuLar disseksjon av signalveier som spesifikt påvirker axon vekst 7-9,13-15. I TrkA – / -: Bax – / – mus, DRG nevroner overleve, men sensorisk afferent innervasjon i huden er fullstendig avskaffet 14,15. Vi kan selektivt aktivere signalveier å bestemme sine respektive bidrag til utviklingen av axon anslag. Nytten av denne fremgangsmåte er at den gjør det mulig å vurdere endringer i aksonal vekstfenotyper når forskjellige genetiske modifikasjoner er avlet på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – eller TrkA taulacZ / WT: Bax – / – bakgrunner.
Den ovenfor beskrevne X-gal-farging Måten i embryonale TrkA taulacZ mus muliggjør den raske og detaljert visualisering av lang avstand axon spring i intakt fast embryo. På grunn av den Bax null bakgrunns disse musene tillate for sondering av signaleringsmekanismer som kan bidra til både axon vekst og neuronal overlevelse. Parring med transgene eller knockout mus av interesse åpner for omfattende vurdering av aksonale fenotyper og kan tjene som nyttig guide for fremtidige eksperimenter f…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dr. Louis Reichardt for TrkA taulacZ mus og Dr. Annette Markus for innsiktsfull diskusjon og forslag. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsstipend 2010-08-61, et forskningsstipend fra Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), gi ZB1-1102-1 fra Christopher & Dana Reeve Foundation, og tilskudd 1R01EY022409 og 3R01EY022409-01S1 fra National Eye Institute, til JZ. KJo er en Goldsmith stipendiat.
Company | Catalog Number | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
PBS | Life Tech | 10010-023 |
Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
Incubator | Labline | Model 120 |
Insect pins | FST | 26000-30 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
Primers | IDT | custom DNA primers |
Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
Takara LA buffer | Takara | RR002A |
Takara LA Taq | Takara | RR002A |
PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
Dissecting microscope | Leica | M205A |
Camera | Leica | DFC310FX |
Ring light | Leica | MEB110 |
Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |