Abstract
Musen er nu den primære dyr, der anvendes til at modellere en række lungesygdomme. For at undersøge de mekanismer, der ligger til grund sådanne patologier, er der behov for fænotypiske metoder, der kan kvantificere de patologiske forandringer. Desuden for at tilvejebringe translationel relevans for musemodeller, bør sådanne målinger være tests, der kan nemt gøres i både mennesker og mus. Desværre, i den nuværende litteratur få fænotypiske målinger af lungefunktionen har direkte anvendelse på mennesker. En undtagelse er den diffuserende kapacitet til carbonmonoxid, som er en måling, der rutinemæssigt udføres i mennesker. I den foreliggende rapport beskriver vi et middel til hurtigt og enkelt måle denne spredende kapacitet i mus. Denne procedure indebærer kort lunge inflation med sporgasser i en bedøvet mus, efterfulgt af en 1 min gasanalyse tid. Vi har testet evnen af denne fremgangsmåde til at detektere adskillige lunge patologier, herunder emfysem, fibrose, akut lungeskade, og influenza ogsvampeinfektioner lungeinfektioner, samt overvågning lunge modning hos unge hvalpe. Resultaterne viser et signifikant fald i alle lunge patologier, samt en stigning i det spredende strøm med lunge modning. Denne måling af lunge diffuserende kapacitet giver således en lungefunktionen test, der har bred anvendelse med sin evne til at detektere fænotypiske strukturelle ændringer med de fleste af de eksisterende patologiske lunge-modeller.
Introduction
Musen er nu den primære dyr, der anvendes til at modellere en række lungesygdomme. For at undersøge de mekanismer, der ligge til grund for sådanne patologier, er der behov for fænotypiske metoder, der kan kvantificere det de patologiske ændringer. Selvom der er mange mus undersøgelser, hvor ventilation mekanik måles, disse målinger er generelt relateret til standard vurderinger af lungefunktionen normalt i mennesker. Dette er uheldigt, da evnen til at udføre tilsvarende målinger i mus og mennesker kan lette oversættelsen af resultater i musemodeller for human sygdom.
En af de mest almindelige og let gjort målinger i mennesker er den spredende kapacitet for carbonmonoxid (DLCO) 1,2, men denne måling er kun sjældent blevet gjort i musemodeller. I de undersøgelser, hvor det er blevet rapporteret 3-7, har der ikke været opfølgende undersøgelser, dels fordi procedurerne er ofte besværlige eller kan require komplekst udstyr. En anden fremgangsmåde er at anvende en CO genindånding fremgangsmåde i en steady state-system, som har den fordel at være i stand til at måle CO diffusion i bevidste mus. Men denne metode er meget besværlig, og resultaterne kan variere med størrelsen af musens ventilation samt O 2 og CO 2 koncentrationer 8,9. Disse vanskeligheder synes at have udelukket rutinemæssig brug af spredende evne til at afsløre lunge patologier i mus på trods af dens mange fordele.
For at omgå problemerne med måling af diffuserende kapacitet i mus, at oplysninger om en simpel anordning måle det i mus er for nylig blevet rapporteret 10. Proceduren eliminerer det vanskelige problem med prøveudtagning uforurenet alveolær gas ved hurtigt prøveudtagning en mængde svarende til hele inspireret gas. Denne procedure resulterer i en meget reproducerbar måling, betegnet udbredelsen faktor for kulilte (DFCO), der er følsom over for et væld af pathologic ændringer i lungen fænotype. Den DFCO således beregnes som 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), hvor c og 9 sænket refererer til koncentrationen af gasserne injicerede kalibrering og gasserne fjernet efter en 9 sek ånde hold tid, henholdsvis. DFCO er en dimensionsløs variabel, der varierer mellem 0 og 1, hvor 1 afspejler fuldstændig optagelse af alle CO, og 0 afspejler ikke optagelse af CO.
I denne præsentation viser vi, hvordan du gør dette diffuserende måling kapacitet, og hvordan det kan bruges til at dokumentere ændringer i næsten alle de eksisterende muselunge sygdomsmodeller, herunder emfysem, fibrose, akut lungeskade, og virus- og svampeinfektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyr protokoller blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg.
1. Animalske Fremstilling
- Forbered 6 C57BL / 6 kontrolmus til DFCO måling ved at bedøve dem med ketamin og xylazin som beskrevet i trin 2.3 nedenfor.
- Forbered alle de andre mus med de forskellige lunge patologier vist i tabel 1 ved anvendelse af samme procedure som for kontrollen. Specifikke detaljer er nødvendige for at etablere hver af disse modeller findes i de relevante referencer. Kontrol mus og i de andre patologiske kohorter er alle 6-12 ugers alderen.
2. Måling af Diffusion Factor for carbonmonoxid (DFCO)
- Opsætning gaskromatografen modulet leveres med maskinen til at måle toppe for nitrogen, oxygen, neon, og kulilte. Til denne ansøgning brug kun neon og CO data.
BEMÆRK: Dette instrument bruger en molekylær sieve kolonne med helium som bæregas, med en 12,00 um film, 320.00 um id og 10 m længde. Kolonnen kromatograf har et volumen på 0,8 ml, men vi anvendte 2 ml for at sikre tilstrækkelig rensning af den forbindende slange med prøven. - Ved begyndelsen af hver forsøgsdag før at gøre målinger af prøver fra musene, tage en 2 ml prøve direkte fra en gasblanding pose indeholdende ca. 0,5% Ne, 0,5% CO, og balance luft og anvende denne prøve at kalibrere gaskromatografen.
- Bedøver mus med ketamin (90 mg / kg) og xylazin (15 mg / kg), og bekræft anæstesi ved fraværet af refleks bevægelse. Påfør veterinær salve på øjnene for at forhindre tørhed. Tracheostomize musene med en stub nålekanyle (18 g hos voksne eller 20 G i meget unge mus).
BEMÆRK: DFCO er færdig på mindre end 10 minutter efter anæstesi og forud for enhver mekanisk ventilation eller andre procedurer. - Hos mus mere end 6 uger, skal du bruge en 3 ml sprøjte to trække 0,8 ml gas fra gasblandingen posen. Forbind sprøjten med den tracheale kanyle og hurtigt puste lungerne. Ved hjælp af en metronom, tæller 9 sek, og derefter hurtigt trække de 0,8 ml (udåndingsluft).
- Fortynd Den tilbagetrukne 0,8 ml udåndingsluft til 2 ml med rumluft, lad det hvile i mindst 15 sek. Så injicere hele prøven i gaskromatografen til analyse.
- Når man analyserer dette første DFCO prøve, oppuste muselunge med en anden 0,8 ml fra gasblandingen posen, og derefter behandle denne prøve er identisk med den første prøve. Gennemsnittet af to DFCO målinger.
BEMÆRK: For målinger i mus som unge som 2 uger, bruge et volumen på 0,4 ml, idet 0,8 ml er for store til at foretage målinger i lungerne hos meget unge mus. Det er bedre at bruge 0,8 ml volumen for mus ældre end 6 uger, og at hvis volumen 0,4 ml er nødvendig for nogle mus, bør den anvendes konsekvent for alle mus i kohorten blive undersøgt. - Beregn DFCOsom 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), hvor c og 9 sænket refererer til koncentrationen af gasserne injicerede kalibrering og gasserne fjernet efter en 9 sek vejret holdetid hhv.
- Analysere og sammenligne forskelle med en envejs ANOVA og vurdere betydningen niveau med Tukeys korrektion for multiple sammenligninger i alle kohorte mus. Overvej p <0,05 som betydelig værdi.
BEMÆRK: Alle musene her anvendte var en del af eksperimentelle undersøgelser med flere efterfølgende målinger af lunge ventilation, mekanik, lungeudskylning eller histologi, som ikke indberettes her. Eftersom fremgangsmåden er den samme i alle de eksperimentelle modeller som blev gjort ovenfor i kontrolmusene, kun resultaterne fra de forskellige patologiske modeller præsenteres. Yderligere information om disse modeller er præsenteret i den supplerende tabel. - Aflive dyrene ved dyb anesthetic overdosis efterfulgt af cervikal dislokation eller halshugning. Om nødvendigt, fjern lunge celler og / eller væv fra de døde mus til yderligere biologisk eller histologisk behandling og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser DFCO målinger fra voksne mus i gruppe A, B, C, D, E og F. Der var signifikante fald med både Aspergillus og influenzainfektioner samt signifikante fald i den fibrotiske, emphysematous og akut lungeskade modeller. Figur 2 viser gruppen G udviklingsmæssige ændringer i DFCO efterhånden som musene alder fra 2-6 uger. Der var en svag, men signifikant stigning med lunge udvikling over dette tidsforløb. Virkningen af anvendelse af en inflation mindre volumen var også ganske tydeligt i 6 ugers tidspunktet. Der var en tendens til, at kvinder har en lidt højere DFCO, men dette var kun signifikant ved 5 ugers tidspunktet.
| Gruppe | Patologi eller tilstand | Kommentarer |
| A | C57BL / 6-kontroller (8-10 uger), n = 6 | Sunde mus </ Td> |
| B | C57BL / 6-mus, der fik 25 TCID50 af influenza A-virus (PR8) intranasalt, n = 10 | Influenza model, studerede 6 og 8 dage efter infektion |
| C | C57BL / 6-mus givet 5.4 U pankreaselastase intratrachealt, n = 6 | Emfysem model 10,13 studerede 21 dage efter elastase udfordring |
| D | C57BL / 6-mus, der fik 0,05 U bleomycin intratrachealt, n = 6 | Fibrose model 14 undersøgte 14 dage efter bleomycin udfordring |
| E | CFTR null kontroller og dem, der smittes med aerosol indånding af Aspergillus fumigatus (stamme AF293), n = 6 | Svampeinfektion model 11,17 undersøgt 12 dage efter svampeinfektion |
| F | C57BL / 6-mus fik 3 ug / g BW LPS (Escherichia coli) intratrachealt, n = 6 | Akut lungeskade (ALI) model 15 undersøgtepå dag 1 og 4 efter LPS fornærmelse |
| G | C57BL / 6-hanmus på 2 til 6 uger gamle, n = 5 ved hvert alder | Lung udviklingsmodel |
Tabel 1: Oversigt over de forskellige musemodeller, hvor DFCO blev målt.
Figur 1:. Måling af DFCO i kontrol C57BL / 6-mus (gruppe A) og i hver af de 5 forskellige patologiske modeller Vist er resultaterne 6 og 8 dage efter PR8 influenza (gruppe B), 21 dage efter intratracheal elastase (Gruppe C), 14 dage efter intratracheal bleomycin (gruppe D), 12 dage efter Aspergillus infektion i CFTR null mus (gruppe E) og 1 og 4 dage efter LPS instillation (gruppe F). * Viser P <0,01 vs. kontrol, # indikerer P <0,01 mellem 6 og8 døgn influenza mus og 1 og 4 dage LPS mus, og + angiver P <0,05 vs. kontrol.
Figur 2: Måling af DFCO i mandlige C57BL / 6 mus fra 2 til 6 uger (gruppe G) Målingerne blev foretaget i alle mus med en inflation volumen på 0,4 ml, og i 6 uger gamle mus en anden måling var. fremstillet med 0,8 ml. Med 0,4 ml volumen, der var signifikante stigninger i DFCO mellem 2 uge mandlige og dem på 4, 5 og 6 uger (p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det foreliggende arbejde, vi definerede en ny parameter for at kvantificere den gas, udveksle evne musen lunge. Denne metrik er analog med den spredende kapacitet, en fælles klinisk måling, der måler den primære funktion af lungen, det vil sige dets evne til at udveksle gas. Den spredende kapacitet er den eneste lunge funktionelle måling, der let og hurtigt kan gøres i både mus og mennesker. Til påvisning af lungesygdom i mus, et vigtigt mål er at kvantificere ændringer i lungefunktionen mellem kontrol og eksperimentelle kohorter. For at nå dette mål, har vi defineret og udnyttet DFCO at vise sin evne til quanitfying fænotypiske ændringer i de fleste af de mest almindelige modeller for lungesygdom hos mus, herunder funktionelle ændringer med lunge udvikling.
En antagelse iboende i den fremgangsmåde, der forenkler DFCO måling i mus er, at virkningen af ublandet indåndede gas i anatomiske og udstyr dødrum er IGNORed. Men som tidligere beskrevet 10, anvendelse af inflation volumen 0,8 ml indfører en lille, men konsekvent fejl i alle målinger. Størrelsen af denne fejl er en funktion af de relative størrelser af inflation og Dead Space mængder. I den foreliggende fremgangsmåde, er denne fejl minimeres ved at eliminere det døde rum i stophaner eller T-stik, og som vist i videoen, anvender blot en fingerspids for at forsegle sprøjten og lette gasoverførsel. Denne procedure resulterer i en høj gentagelsesnøjagtighed mellem målingerne. Virkningen af den mindre inflation volumen, der kræves i den unge mus gjort klart i de 6 uger gamle mus er vist i figur 2, hvor den oprindelige 0,4 ml prøve blev straks fulgt med en 0,8 ml prøve i hver mus. Med 0,8 ml af DFCO værdi i intervallet for C57BL / 6-mus i de andre grupper, men målingen med 0,4 ml er konsekvent mindre. Dette er et direkte udtryk for det faktum, at med mindre volumen, recovered 9 sek prøve har en større andel af det døde rum luft, som netop består af koncentrationerne kontrol gas. Dette faktum viser sig som en mindre ændring fraktioneret i CO-koncentrationen, hvilket bringer den nærmere ændringen i Ne koncentration. Med en øget andel af CO / Ne, det beregnede DFCO (1 - dette forhold) er således mindre.
I de mange modeller af lunge patologi vist i figur 1, var der et signifikant fald blev observeret i DFCO. Der er imidlertid flere forskellige årsager til, at DFCO fald i disse forskellige modeller. I fibrose forårsaget af enkeltdosis af bleomycin, der er betændelse og en fortykkelse af diffusion barriere, der fører til en reduktion i diffuserende kapacitet 16. I emfysem, der er et tab af overfladeareal virker direkte til at mindske både overfladeareal til diffusion og blodvolumen i kapillærer, der havde været i de ødelagte vægge. Ingen dosis-respons relationer med elastase præsenteres her, men ikke-offentliggjorte data viser en god korrelation af DFCO med niveauet for emfysematøs skader. Med influenza infektion, er der nedsat diffuserende kapacitet sandsynligvis som et resultat af både en fortykkelse af diffusionsbarriere og en stigning i konsoliderede uventilerede områder af lungen. I PR8 influenza model anvendes her, dette forværres over tid (som afspejlet i den videre signifikant fald i DFCO på dag 8), og musene generelt dør på omkring dag 10. I CFTR null mus, var der en mindre DFCO ved baseline , men disse mus er lavet på en blandet genetisk baggrund 17, så der kan være strukturelle forskelle med C57BL6 kontrol. Imidlertid Aspergillus infektion forårsaget en mere omfattende signifikant fald i DFCO, og årsagerne til dette fald med svampeinfektion sandsynligvis svarer til dem med influenza. De LPS resulterer i akut inflammation, der forårsager en signifikant nedsat DFCO, sandsynligvis fra edematous fortykkelse af diffusion barriere og uventilerede regioner af lungen er fyldt med væske. Med dosis af LPS anvendt faldet i DFCO er størst på dag 4 eller 5, og derefter genopretter tilbage til kontrol på dag 10 (data ikke vist).
Til analysen af ændringer i DFCO med lunge vækst i de unge mus, inflation volumen 0,4 ml klart tilladt reproducerbare målinger, og var i stand til at vise en langsom stigning i spredende egenskab lungen nåede voksen modenhed (figur 2). Virkningen af at anvende en mindre 0,4 ml inflation volumen i faldende den beregnede DFCO er også hvad der var forventet, men større 0,8 ml volumen kan ikke anvendes i de mindre mus. Men ændringer med udvikling eller patologi bør stadig være reproducerbart påviselige selv med 0,4 ml volumen.
Afslutningsvis viser denne video og ledsagende manuskript, hvordan man opnår en funktionel måling i mus, der svarer til, hvad der kan måles i mennesker. Metrikken afspejler enheden af lungen til at udveksle gas med en række lung strukturelle ændringer forårsaget af de mest almindeligt undersøgte patologier. Denne diffusion faktor for kulilte (DFCO) er meget reproducerbar og følsom nok til at påvise funktionelle og strukturelle ændringer med mest eksperimentelt inducerede patologier i unge eller gamle mus. Det faktum, at det er direkte analog med lignende målinger foretaget i mennesker til at vurdere lungesygdom, gør det til en enkel måde at få et meget relevant parameter for at phenytype muselunge patologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, og intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
